正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化血脈疏通口服液水提工藝-

1、正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化血脈疏通口服液水提工藝易生富1,陳兵2,孫亞楠1(1.湖北中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校,荊州434020;2.湖北省荊州市中醫(yī)院藥劑科,荊州434010摘要目的優(yōu)化血脈疏通口服液水提工藝方法以加水量煎煮時(shí)間煎煮次數(shù)為考察因素進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn),采用3因素3水平正交設(shè)計(jì),以黃芪甲苷總多糖及80%醇浸出物量作為指標(biāo)值結(jié)果煎煮次數(shù)和加水量對(duì)黃芪甲苷總多糖及80%醇浸出物量具顯著影響,優(yōu)選煎煮提取工藝為煎煮3次,加12倍量水,煎煮0.5h結(jié)論該實(shí)驗(yàn)確定了血脈疏通口服液的最佳提取工藝關(guān)鍵詞血脈疏通口服液;正交實(shí)驗(yàn);水提工藝;黃芪甲苷中圖分類號(hào)R286;TQ460.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)1004-0781

2、(201403-0382-04血脈疏通口服液為湖北省荊州市中醫(yī)院自制中藥制劑(自制制劑批準(zhǔn)文號(hào):鄂藥制字Z20110885,由赤芍黃芪牛膝防風(fēng)桃仁地龍葛根石菖蒲等組成,具益氣活血通脈的作用,用于治療因氣虛血瘀所致的冠心病心絞痛及脂肪肝有很好療效,治療冠心病心絞痛患者70例,總有效率93.33%;治療脂肪肝患者176例,總有效率89.16%12方中牛膝黃芪赤芍葛根桃仁等藥含皂苷類黃酮類和多糖類,考慮水煎煮法提取;石菖蒲防風(fēng)含揮發(fā)油,在提取揮發(fā)油后,再與赤芍黃芪牛膝葛根桃仁等藥合煎為了保證制劑質(zhì)量,筆者在本實(shí)驗(yàn)中采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法,優(yōu)化血脈疏通口服液煎煮提取工藝1儀器與試藥1.1儀器Waterse

3、2695高效液相色譜儀,Empower 工作站,Waters2424蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(美國(guó)沃特士公司;OhausAR124CN型電子分析天平(奧豪斯儀器上海有限公司;UV3000型可見紫外分光光度計(jì)(日本島津;高速離心機(jī)(美國(guó)MICRO12-241.2試藥黃芪甲苷對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院,批號(hào):110683200916,血脈疏通口服液(自制,批號(hào):20120119,規(guī)格:每支10mL,乙腈為色譜純,葡萄糖對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院,批號(hào):110976200903,其他試劑為分析純2方法與結(jié)果2.1樣品的制備按處方比例,稱取石菖蒲6g防風(fēng)8g,按提油工藝提油,濾過得藥液和藥渣備用按處方

4、比例,稱取黃芪30g赤芍10g牛膝10g桃仁8g葛根10g地龍8g與石菖蒲防風(fēng)提油后的藥渣混合,按規(guī)定的加水量煎煮時(shí)間煎煮次數(shù)提取過濾收稿日期2013-07-05修回日期2013-08-22作者簡(jiǎn)介易生富(1966-,男,湖北荊州人,主任藥師,學(xué)士,主要研究方向:中藥制劑電話:0716-*,Email: yishenfu濃縮并定容至100mL(每毫升含生藥0.9g2.2單因素實(shí)驗(yàn)按 2.1”項(xiàng)樣品的制備方法,分別調(diào)整加水量8,10,12,14倍,煎煮時(shí)間0.5,1.0,1.5, 2.0h,煎煮次數(shù)1,2,3,4次,進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)2.2.1加水量的影響在煎煮時(shí)間為1h,煎煮1次,加水量從8倍增加

5、到12倍時(shí),總多糖含量黃芪甲苷含量80%醇浸出物量增加較多但當(dāng)加水量增至14倍后,總多糖含量黃芪甲苷含量近乎沒有變化,80%醇浸出物量增加緩慢因此,加水量應(yīng)選定為約12倍宜2.2.2煎煮次數(shù)的影響在加水量為12倍,煎煮時(shí)間1h,隨著煎煮次數(shù)的增加,總多糖含量黃芪甲苷含量80%醇浸出物量相應(yīng)增加當(dāng)煎煮次數(shù)增加到4次以后,總多糖含量黃芪甲苷含量增加緩慢,80%醇浸出物量有增加但雜質(zhì)增加較多因此煎煮次數(shù)選為3次宜2.2.3煎煮時(shí)間的影響在加水量為12倍,煎煮3次的條件下,隨著煎煮時(shí)間的延長(zhǎng),總多糖含量黃芪甲苷含量80%醇浸出物量增加緩慢,考慮到節(jié)約工時(shí),煎煮時(shí)間選為0.5h2.3正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)選取煎煮

6、時(shí)間加水量煎煮次數(shù)3個(gè)因素,各取3個(gè)水平進(jìn)行L9(34正交實(shí)驗(yàn)黃芪是方中君藥,黃芪甲苷是其主要有效成分,以黃芪甲苷含量評(píng)價(jià)指標(biāo),權(quán)重系數(shù)定為0.5;黃芪中多糖為有效成分,方中牛膝葛根防風(fēng)也含有多糖,因此總多糖含量作為另一個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo),權(quán)重系數(shù)定為0.3;80%醇浸出物為大類成分作為間接控制的指標(biāo),權(quán)重系數(shù)定為0.2,以此篩選最佳提取工藝3綜合評(píng)分=0.5黃芪甲苷含量+0.3總多糖含量+0.280%醇浸出物量正交實(shí)驗(yàn)表見表1,22.4黃芪甲苷的含量測(cè)定2.4.1分析方法的選擇黃芪甲苷含量測(cè)定方法文獻(xiàn)報(bào)道有高效毛細(xì)管電泳法薄層掃描法高效液相色譜蒸發(fā)光散射檢測(cè)法半高效液相色譜質(zhì)譜串聯(lián)法等47本實(shí)驗(yàn)采用

7、HPLCELSD檢測(cè)法8表1正交實(shí)驗(yàn)因素水平表水平加水量(A/倍煎煮時(shí)間(B/h煎煮次數(shù)(C/次180.51210 1.02312 1.532.4.2色譜條件色譜柱:Kromasil C18柱(250mm4.6mm,5m;流動(dòng)相:乙腈水(3565;檢測(cè)器:蒸發(fā)光散射檢測(cè)器200s;柱溫35;漂移管溫度65;氣體流量:1Lmin-1;進(jìn)樣量:10L;理論板數(shù)按黃芪甲苷峰計(jì)算應(yīng)不低于30002.4.3對(duì)照品溶液的制備精密稱取干燥至恒重的黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)品2mg于10mL量瓶,用甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻即可得到0.2mgmL-1對(duì)照品溶液2.4.4供試品溶液的制備精密吸取各正交實(shí)驗(yàn)樣品溶液10mL,用

8、水飽和的正丁醇振搖提取3次,每次20mL,合并正丁醇液,用氨試液洗滌2次,每次20mL,棄去氨液,正丁醇液水浴蒸干,殘?jiān)铀?mL 使溶解,通過D101型大孔吸附樹脂(內(nèi)徑1.5cm,長(zhǎng)12cm,用水50mL洗脫,棄去水液,再用40%乙醇30mL洗脫,棄去40%乙醇洗脫液,繼用70%乙醇50mL洗脫,收集洗脫液,蒸干,用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至2mL量瓶,加甲醇至刻度,搖勻即得9102.4.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密量取對(duì)照品溶液1,2, 4,6和8mL分別置于10mL量瓶,分別加甲醇稀釋定容,搖勻,即得0.02,0.04,0.08,0.12和0.16mgmL-1對(duì)照液取以上溶液各20L注入高效液相色譜儀,

9、記錄色譜峰以峰面積(Y與濃度( X,gmL-1進(jìn)行回歸,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程: Y=58102X+1052.7,r=0.9993(n=5結(jié)果表明,樣品在0.43.2gmL-1濃度范圍內(nèi),濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系2.4.6陰性干擾的判斷照供試品溶液的制備方法制備缺黃芪的陰性對(duì)照品溶液,依照上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定,供試品溶液色譜圖中,在與對(duì)照品溶液色譜圖相應(yīng)的位置上有相同的色譜峰,而陰性對(duì)照品溶液無相應(yīng)的色譜峰2.4.7精密度實(shí)驗(yàn)對(duì)已配制的1.6gmL-1黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液,在色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣5次,分別測(cè)定峰面積,計(jì)算RSD為0.58%(n=52.4.8穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取供試品溶液,分別在0,2

10、,4, 6,8,10,12h測(cè)定進(jìn)樣10L,記錄峰面積,計(jì)算RSD,結(jié)果RSD為0.47%(n=7,表明供試品溶液在12h 內(nèi)穩(wěn)定2.4.9重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取1.6gmL-1黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液5份,在色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定峰面積,RSD為0.53%(n=5,重復(fù)性良好2.4.10加樣回收率實(shí)驗(yàn)量取供試品溶液20L5份,各加入不同量的對(duì)照品溶液,按 2.4.5”項(xiàng)方法測(cè)定峰面積,計(jì)算回收率結(jié)果見表3平均加樣回收率98.8%,RSD=1.02%2.4.11樣品含量測(cè)定精密量取各供試品溶液20L注入高效液相色譜儀,在色譜條件下記錄色譜峰,將峰面積代入回歸方程中,得到溶液中黃芪甲苷的濃度,進(jìn)一步計(jì)算得到黃芪甲苷

11、的含量結(jié)果見表22.5總多糖含量測(cè)定總多糖含量測(cè)定方法文獻(xiàn)報(bào)道有蒽酮硫酸法苯酚硫酸法3,5二硝基水楊酸法(DNS法等1113筆者在本實(shí)驗(yàn)中采用苯酚硫酸法2.5.1對(duì)照品溶液的制備精密稱取105干燥至恒重的無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品60mg置于100mL量瓶,加純化水溶解至刻度,即得0.6mgmL-1對(duì)照品溶液2.5.2苯酚溶液的配制精密稱取苯酚4.0g于100mL量瓶,加水溶解至刻度,即得4%苯酚溶液,移至棕色瓶中保存2.5.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密量取對(duì)照品溶液0.0, 1.0,1.5,2.0,3.0,4.0mL分別轉(zhuǎn)移到50mL量瓶,加水稀釋至刻度,搖勻精密量取上述各溶液2.0mL置10mL具塞試管,分

12、別精密加入4%苯酚溶液1.0mL,搖勻,迅速精密加入濃硫酸7.0mL,搖勻,沸水保溫15min,取出后迅速用冷水冷卻至室溫,以第一份為空白對(duì)照液,在400600nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描,得最大吸收波長(zhǎng)為487nm在487nm波長(zhǎng)處,測(cè)定各對(duì)照品吸光度,以濃度(Y為橫坐標(biāo)吸光度(X為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸方程為Y=0.0226X+0.0089,r= 0.9996(n=52.5.4樣品溶液的配制精密吸取各樣品濃縮液,加無水乙醇4mL,邊加邊振搖,使含醇量達(dá)80%, 2000rmin-1離心20min,沉淀以水溶解,轉(zhuǎn)移到50mL量瓶,加水稀釋至刻度,搖勻2.5.5精密度實(shí)驗(yàn)按 2.5.3”項(xiàng)方法重復(fù)測(cè)

13、定同一濃度葡萄糖對(duì)照品溶液5次,計(jì)算測(cè)定結(jié)果RSD為0.61%2.5.6穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取樣品溶液,按 2.5.3”項(xiàng)方法表2正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表序號(hào)A B C D評(píng)價(jià)指標(biāo)/%黃芪甲苷/(mgmL-1總多糖/(mgmL-180%醇浸出物綜合評(píng)價(jià)111129.9922.41 6.423.0122246.4027.007.932.9133356.0232.657.639.3212340.0138.938.933.5223156.9644.277.943.4231241.3123.527.229.2313259.4835.898.642.2321342.9227.247.931.3332155.7836.439

14、.240.6J95.298.783.5107.0CT=11053.02J106.1107.6107.0104.3J114.1109.1124.9104.1JJ31.732.927.835.7JJ35.435.935.734.8JJ38.036.441.634.7R J 6.3 3.513.8 1.0Q11113110741134011054SS6021.07287.4 1.75A:加水量(倍;B:煎煮時(shí)間(h;C:煎煮次數(shù)(次;D:空白在室溫每隔30min測(cè)定一次,連續(xù)3h考察其穩(wěn)定性,計(jì)算測(cè)定結(jié)果的RSD為1.21%2.5.7樣品含量測(cè)定精密吸取項(xiàng)樣品溶液2.0mL,置10mL具塞試管,分別

15、精密加入4%苯酚溶液1.0mL,搖勻,迅速精密加入濃硫酸7.0mL,搖勻,沸水保溫15min,取出后迅速用冷水冷卻至室溫以純化水為空白,同法制得空白對(duì)照品液在487nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算總多糖含量結(jié)果見表22.680%醇浸出物量測(cè)定取各正交實(shí)驗(yàn)號(hào)濃縮液10mL,加無水乙醇40mL,使乙醇濃度達(dá)到80%,靜置過夜,取上清液于干燥蒸發(fā)皿中,水浴蒸干,105烘箱干燥34h至恒重,取出,迅速移至干燥器中放冷,取出精密稱重即得結(jié)果見表2表3黃芪甲苷加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果mg,n=5樣品量加標(biāo)量測(cè)得量mg回收率/% 0.0480.050.099102.0 0.0500.050.0999

16、8.0 0.0490.050.09796.0 0.0510.050.101100.0 0.0490.050.09898.02.7方差分析對(duì)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果作直觀分析和方差分析方差分析見表4表4方差分析表方差來源離差平方和SS自由度V方差M SF P 60.00230.0034.090.05287.102143.70163.300.01誤差 1.7520.88F0.05(2,2=19.00,F0.01(2,2=99.00由直觀分析可知,影響提取效果的因素順序?yàn)?煎煮次數(shù)加水量煎煮時(shí)間經(jīng)方差分析,煎煮時(shí)間對(duì)提取效果無顯著影響,為節(jié)約工時(shí),定為B1,煎煮次數(shù)和加水量有顯著影響,以A3C3為宜2.8驗(yàn)證實(shí)

17、驗(yàn)驗(yàn)證3批結(jié)果見表5RSD值 3%,表明所篩選的提取工藝條件基本穩(wěn)定3討論方中黃芪為君藥,黃芪甲苷和多糖為黃芪的主要有效成分14,現(xiàn)代藥理研究表明黃芪甲苷具有保護(hù)心臟和肝臟抗細(xì)胞凋亡免疫調(diào)節(jié)改善血液流變學(xué)等作用15,黃芪多糖具有增強(qiáng)免疫系統(tǒng)保肝降血糖表5驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果%,n =3成分123均值(mgmL -1RSD /%黃芪甲苷59.6159.0260.3359.65 1.1總多糖36.5635.5035.8335.96 1.580%醇浸出物8.69.18.98.82.2降血脂抗氧化延緩衰老等藥理活性16,故將黃芪甲苷含量作為評(píng)價(jià)工藝優(yōu)劣的重要指標(biāo)方中臣藥牛膝,佐藥葛根防風(fēng)也含有多糖,因此將總多

18、糖含量作為提取工藝的另一個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo),80%醇浸出物為大類成分,作為間接控制指標(biāo),以此篩選最佳提取工藝具有一定的科學(xué)性按正交實(shí)驗(yàn)所篩選的最佳提取條件,本實(shí)驗(yàn)還比較了石菖蒲防風(fēng)二藥提油后藥渣不再與黃芪赤芍等藥合煎水提和二藥提油后藥渣與黃芪赤芍等藥合煎水提兩種方法主要有效成分的影響結(jié)果表明,分煎后出膏率降低近10%,黃芪甲苷含量無影響,總多糖含量近無影響,為降低出膏率,給后續(xù)除雜工藝降低難度,可以考慮將提取路線定為:石菖蒲防風(fēng)二藥提油后藥渣棄去,藥液與黃芪赤芍等藥水提液合并參考文獻(xiàn)1黨安琪.血脈舒通口服液治療病態(tài)竇房結(jié)綜合征60例J.中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志,2001,8(7:54.2黨安琪,林慶,嚴(yán)光俊

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