第五章 生物制藥工藝技術基礎

1、第五章 生物制藥工藝技術基礎 第一節(jié)第一節(jié) 生物材料與生物活性物質生物材料與生物活性物質一、生物材料的來源 供生產生物藥物的生物資源主要有動物、植物、微生物的組織、器官、細胞與代謝產物。應用動植物細胞培養(yǎng)與微生物發(fā)酵技術也是獲得生物制藥原料的重要途徑?；蚬こ碳夹g與細胞工程技術和酶工程技術更是開發(fā)生物制藥資源的新途徑。（一）動物臟器 （1）胰臟 （激素、酶、多肽、核酸、多糖、氨基酸等） （2）腦 （腦磷脂、肌醇磷脂、神經磷脂、神經肽等）（3）胃粘膜（胃蛋白酶、膠原蛋白酶、胃泌素、胃膜素）（4）肝臟（維生素、磷脂類、膽固醇）（5）脾臟（免疫器官）（6）小腸（糖蛋白、核苷酸酶、溶菌酶、胃腸道激素）

2、（7）腦垂體（各種激素）（8）心臟（細胞色素C、輔酶Q10） 其它等（二）血液、分泌物和其它代謝物血液制品：人血制劑、抗凝血酶，凝血因子，纖維蛋白原，免疫球蛋白、人血漿、干擾素、白介素等。尿液、膽汁、蛇毒、蜂毒也是重要的生物材料，尿激酶，表皮生長因子、HCG。（三）海洋生物（1）海藻 （2）腔腸動物 ?？舅兀?）節(jié)肢動物 甲殼素（4) 軟體動物 多糖、多肽、毒素（5）棘皮動物 海星、海膽、海參 海參素抗癌（6）魚類 魚油、多種激素、毒素，硫酸軟骨素（7）爬行動物 龜 滋陰養(yǎng)腎 抗腫瘤（8）海洋哺乳動物 鯨魚魚肝油（四）植物 生物堿、強心甙、黃酮、皂甙、揮發(fā)油、樹脂、鞣質等。（五）微生物1.細

3、菌常用細菌發(fā)酵法生產乳酸、醋酸、丙酮、丁醇。主要有：（1）氨基酸 利用微生物酶可轉化對應的酮酸或羥基酸產生氨基酸。（2）有機酸 檸檬酸、蘋果酸、乳酸（3）糖類 利用細菌可制取葡聚糖、聚果糖、聚甘露糖、脂多糖。（4）核苷酸類 用細菌可生產5-AMP，5-肌苷酸（5）維生素 VB1,VB2，VB6, Vc（6）酶 淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、彈性蛋白酶2.放線菌放線菌是最重要的抗生素產生菌，已有1000多種抗生素，約2/3產自放線菌。（1）氨基酸 發(fā)酵法（2）核苷酸 5-脫氧肌苷酸（3）維生素（4）酶3.真菌 （1）酶（2）有機酸（3）氨基酸（4）核酸及有關物質（5）維生素（6）促生素（7）多糖4.酵

4、母菌（1）維生素（2）蛋白質與多肽（3）核酸（六）開發(fā)生物新資源（1）動植物細胞的大規(guī)模培養(yǎng)（2）應用基因工程技術建立工程菌或工程細胞二、生物活性物質的存在方式（一）生物活性物質的存在方式與其生物功能 根據生物活性物質的生物功能推斷其存在部位和分布方式。生物活性物質分為胞內與胞外 2種存在部位。（二）生物分子間的作用力三、生物活性物質的存在特點（一）生物材料組成的復雜性（二）生物活性物質的存在特點 生物活性物質在生物材料中含量較低，雜質含量很高，而且生理活性愈高，含量愈低。 生物材料中的生化組成數量大，種類多，分離純化比較困難。四、生物材料的準備 生物藥物的制造生物藥物的制造主要包括以下工藝過

5、程： 1)生物材料的選取與預處理； 2)從生物材料中提取有效活性物質； 3)有效成分的分離，純化； 4)后處理及制劑。（一）生物材料的選取 1.有效成分的含量 （1）生物品種 根據目的物的分布，選擇富含有效成分的生物品種是選材的關鍵。（催乳素，哺乳動物）（2）合適的組織器官 （胃蛋白酶，胃）（3）生物的生長期 生物的生長期對生理活性物質含量影響很大。2.雜質情況 難于分離的雜質會增加工藝的復雜性，嚴重影響收率、質量和經濟效益。3.來源 應選用來源豐富的材料，盡量不與其他產品爭原料，最好能一物多用，綜合利用。 胰臟 制備彈性蛋白酶和激肽釋放酶，胰島素與胰酶等。（二）生物材料的采集與保存 生理活性

6、物質易失活與降解，采集時必須保持材料的新鮮。防止腐敗、變質與微生物污染。如胰臟采摘后要立即速凍，防止胰島素活力下降。 保存生物材料的主要方法有速凍、凍干、有機溶劑脫水，制成丙酮粉，或浸存于丙酮與甘油中等。（三）動物細胞的培養(yǎng)與保存（四）微生物菌種的選育與保存 1.菌種的分離 微生物種類繁多，易于培養(yǎng)，是工業(yè)化生產各種生物藥物的主要材料。（1）含菌樣品的收集 根據微生物的生態(tài)特點，從自然界取樣，分離所需菌種，如到堆積和腐爛纖維素的地方去取樣分離纖維素酶產生菌。 到溫泉附近取樣分離高溫蛋白酶產生菌。 一般可以從土壤中分離所需微生物，取樣時先將表土刮去23cm，在同一條件下選好25點土樣混在一起包好

7、，標明采樣地點及日期備用。（2）富集培養(yǎng) 收集到的樣品若含所需要的菌較多，可直接分離。如含所需要的菌很少，就需要經過富集培養(yǎng)，使所需要的菌大量生長，以利于篩選。再配合控制溫度，pH或營養(yǎng)成分即可達到目的。有時用能分解的底物作為生長和誘導產生所須成分的培養(yǎng)基成分，以使所需要的菌種得到快速生長，有利于進一步分離。（3）菌種純化 在自然條件下，各種類型的菌混雜在一起生活，所以要進行分離，以獲得純種。菌種純化的方法一般采用稀釋分離或劃線分離法。2.菌種的篩選（1）篩選對象的選擇 篩選前，先要考慮哪些微生物是篩選的對象。如有報道，則根據文獻收集可能性最大的的微生物進行篩選。（2）培養(yǎng)方式的確定 微生物的

8、培養(yǎng)方式，有固體培養(yǎng)與液體培養(yǎng)。3.菌株的選育 從自然界直接分離得到的菌種，都不能立即適應實際生產需要。只有通過誘變、選育才能使產量成倍、成百倍地提高。選育方法基本上可以分成兩類：隨機選擇突變體；根據代謝的調節(jié)機制選擇各種突變體。（1）隨機選擇法 一般程序是采用誘變劑誘變處理微生物，增殖培養(yǎng)，經過稀釋涂布，隨機選擇部分或全部單菌落，逐個測定它們 的生物活性。最后挑選出產量或其它性能比親代菌株優(yōu)秀的突變株。（2）根據代謝的調節(jié)機理選擇高產突變體 根據代謝的調節(jié)機理選擇高產突變體。(抗性基因)4.菌種的保藏（1）菌種的退化與防止 生產菌種本來在自然環(huán)境下生長，所以在人工培養(yǎng)條件下，任何菌株通過一系

9、列的轉接傳代都可能發(fā)生退化。退化退化一般把菌株的生活力，產孢子能力的衰退和特殊產物產量的下降，稱為退化。 菌種退化現象：單位容積中發(fā)酵液的活性物質含量；瓊脂平皿上的單菌落形態(tài)；不同培養(yǎng)時期菌體細胞的形態(tài)和主要遺傳特征，如形成孢子能力；發(fā)酵過程pH變動情況；發(fā)酵液的氣味、色澤。 菌種退化防止措施：防止基因突變，基因突變是菌種退化的一個主要原因，低溫保藏法可以減少突變得產生。采用雙重缺陷型 采用雙營養(yǎng)缺陷標志可間接而有效地防止突變。制定科學管理制度 制作平行菌種斜面；分離單菌落；認真進行單菌落分離工作，再多做平行的菌種斜面；選擇培養(yǎng)條件 選擇有利于高產菌株而不利于低產菌株的培養(yǎng)條件。（2）常用的菌

10、種保藏方法斜面保存法將菌種轉接到新鮮的瓊脂斜面上，待生長良好后，于4保存。根據具體情況，間隔一定時間后轉接。礦油法在菌種斜面上覆蓋礦物油以隔絕空氣防止蒸發(fā)。索氏法將小試管斜面的菌種放在大試管內，大試管內裝幾粒氫氧化鉀，管口加橡皮套，然后用石蠟包封。干硅膠法試管內裝硅膠約半滿，180加熱滅菌1.5小時，置密封干燥器內冷卻，接種菌液約1ml，塞好棉花，放入預置有色硅膠的大瓶中，蠟封瓶口，于低溫處保存。砂土管法取普通黃沙，洗凈過60目篩，曬干，另取普通圓土研碎，過篩，曬干。兩者以6:4混合。分裝于安瓿瓶或小試管中，然后在60干熱滅菌2小時，連續(xù)滅菌三次后即可使用。裝管時可吸取少許孢子懸浮液加入，待干

11、燥后抽真空封口或用棉花塞緊后蠟封，低溫保藏。冷凍干燥法：將菌種懸浮于脫脂消毒牛奶中，快速冷凍，真空干燥。甘油冷凍保存法：將對數期菌體懸浮于新鮮培養(yǎng)基中，加入15%消毒甘油，混勻速凍，凍存于7080。（五）組織與細胞的破碎組織與細胞的破碎方法有物理法、化學法與生物法。1.物理法（1）磨切法 工業(yè)上常用的有絞肉機，刨胰機，球磨機、磨粉機。實驗室常用的有勻漿機，研缽，高速組織搗碎機。（2）壓力法 有壓榨法、高壓法和減壓法，滲透壓法。（3）超聲波法（4）反復凍融法2.化學法用稀酸、稀堿、濃鹽、有機溶劑或表面活性劑處理細胞，可破壞細胞結構釋放出內容物。3.生物法（1）組織自溶法 利用組織中自身溶解酶的作

12、用改變、破壞細胞結構，釋放出目的物稱為組織自溶法。(2) 酶解法 用外來酶處理生物材料，如用溶菌酶處理某些細菌，蝸牛酶等。（3）噬菌體法 用噬菌體感染細胞、裂解細胞，釋放出內容物。（六）細胞器的分離為獲得結合在細胞器上的一些生化成分或酶系，常常要先得到細胞器再進一步分離有效成分。方法是勻漿破碎細胞，差速離心。 第二節(jié)第二節(jié) 生物活性物質的提取生物活性物質的提取提取是利用制備目的物的溶解特性，將目的物與細胞的固形物成分或其它結合成分分離，使其由固相轉入液相或從細胞生理狀態(tài)轉入特定溶液環(huán)境的過程。一、物質性質與提?。ㄒ唬┪镔|的性質與提取方法的選擇要取得好的提取效果，最重要的是要針對生物材料和目的物

13、的性質選擇合適的溶劑系統(tǒng)與提取條件。生物材料及其目的物與提取有關的一些性狀包括溶解性質、分子量、等電點、存在方式、穩(wěn)定性、比重、粒度、粘度，目的物含量，主要雜質種類及溶解性質，有關酶的特征等。其中最主要的是目的物與主要雜質在溶解度方面的差異以及它們的穩(wěn)定性。操作者可根據文獻資料及本人的試驗摸索獲得的有關信息，在提取過程中增加目的物的溶出度，盡可能減少雜質的溶出度。（二）活性物質的保護措施（1）采用緩沖鹽系統(tǒng) 在生物藥物制備中，常用的緩沖鹽有磷酸緩沖鹽，檸檬酸緩沖鹽，Tris緩沖液，醋酸緩沖鹽，碳酸緩沖鹽，硼酸緩沖鹽和巴比妥緩沖鹽等。（2）添加保護劑 防止某些生理活性物質的活性基團及酶的活性中心

14、受到破壞，如巰基是許多活性蛋白質和酶催化活性基團，極易被氧化，故提取時，常添加某些還原劑如半胱氨酸、-巰基乙醇。對易受重金屬影響的，可添加EDTA。（3）抑制水解酶的作用（4）其它保護措施（避免冷、熱、酸、堿）二、物質的性質與溶解度（一）物質溶解度的一般規(guī)律 “相似相溶”（二）水在生化物質提取中的作用 水是提取生化物質的常用溶劑。水分子的存在可使其它生物分子之間的氫鍵減弱，而與水分子形成氫鍵，水分子還能使溶質分子的離子鍵解離，這就是所謂的水合作用。水合作用促使蛋白質、核酸、多糖等生物大分子與水形成了水合分子或水合離子，從而促使它們溶解于水或水溶液中。三、提取效率四、影響提取的因素（一）溫度 多

15、數物質的溶解度隨提取溫度的升高而增加。另外較高的溫度可以降低物料的粘度，有利于分子擴散和機械攪拌，所以對耐熱成分的提取可以用加熱的方法。對不耐熱的生物活性物質的提取，一般在010進行提取。(二)酸堿度 多數生化物質在中性條件下較穩(wěn)定，pH值一般應控制在49范圍內，為了增加目的物的溶解度，往往要避免在目的物的等電點附近進行提取。 巧妙地選擇溶劑系統(tǒng)的pH值，不但直接影響目的物與雜質溶解度，還可以抑制有害酶類的水解破壞作用，防止降解，提高收率。（三）鹽濃度 鹽溶作用 鹽析作用五、提取方法（一）用酸、堿、鹽水溶液提?。ǘ┍砻婊钚詣┨崛?表面活性劑分子兼有親水與疏水基團，分布于油水界面時，有分散、乳

16、化和增溶作用。表面活性劑分陰離子型、陽離子型與非離子型。離子型表面活性劑作用強，但是易引起蛋白質等生物大分子的變性，非離子型表面活性劑變性作用小，適合于用水、鹽系統(tǒng)無法提取的蛋白質或酶的提取。（三）有機溶劑提取 1.固液提取 丙酮從動物腦中提取膽固醇， 溶劑分級提?。喝缦扔帽?，再用乙醇，最后用乙醚提取。石油醚，氯仿，乙酸乙酯，正丁醇，甲醇。 丙酮粉 2.液液萃取 液液萃取是利用溶質在兩個互不混溶的溶劑中溶解度的差異，將溶質從一個溶劑相向另一個溶劑相轉移的操作。（分配系數和溶劑用量） 溶劑萃取的注意事項： （1）pH 在萃取操作中正確選擇pH值很重要。因為在水溶液中某些酸、堿物質會解離，在萃取

17、時改變了分配系數，直接影響提取效率。（2）鹽析 加入中性鹽如硫酸銨，氯化鈉等可以使一些生化物質的溶解度減少，這種現象稱為鹽析。在提取液中加入中性鹽，可以促使生化物質轉入有機相，從而提高萃取率。（3）溫度 一般在室溫下或低溫下進行萃取操作。（4）乳化 在液液萃取時，常發(fā)生乳化作用，使有機溶劑與水相分層困難。去乳化的常用方法有：過濾與離心，輕輕攪動，改變兩相的比例；加熱，加電解質，加吸附劑。 液液萃取時溶劑的選擇：（1）選用的溶劑必須具有較高的選擇性，各種溶質在所選的溶劑之間分配系數差異愈大愈好。（2）選用的溶劑，在萃取后，溶質與溶劑要容易分離與回收。 (3)兩種溶劑的密度相差不大時容易形成乳化，

18、不利于萃取液的分離。（4）要選用無毒，不易燃燒的價廉易得的溶劑。 第三節(jié)第三節(jié) 生物活性物質的濃縮與干燥生物活性物質的濃縮與干燥一、生物活性物質的濃縮（一）鹽析濃縮 硫酸銨沉淀蛋白質（二）有機溶劑沉淀濃縮 在生物大分子的水溶液中，逐漸加入乙醇，丙酮等有機溶劑，可以使生化物質的溶解度明顯降低，從溶液中沉淀出來。（三）用葡聚糖凝膠（Sephadex）濃縮（四）用聚乙二醇透析濃縮（五）超濾濃縮（六）真空減壓濃縮與薄膜濃縮 真空減壓濃縮在藥物生產中使用較為普遍，具有生產規(guī)模較大，蒸發(fā)溫度較低，蒸發(fā)速度較快等優(yōu)點。 薄膜濃縮器的加速蒸發(fā)的原理是增加汽化表面積。使液體形成薄膜而蒸發(fā)，成膜的液體具有較大的表

19、面積，熱傳播快而均勻，沒有液體靜壓的影響，能較好地防止物料的過熱現象。 二、干燥 干燥的目的：提高藥物或藥劑的穩(wěn)定性，以利于保存和運輸；達到規(guī)格標準；便于進一步處理。 水分在物料中分：表面水，毛細管中的水，細胞內的水。（一）減壓干燥（二）噴霧干燥（三）冷凍干燥 第四節(jié)第四節(jié) 生化物質的分離純化方法生化物質的分離純化方法一、生物制藥中分離制備方法的特點 生物制藥中分離、制備方法有以下特點：（1）生物材料組成非常復雜。一種生物材料常含成千上萬成分，各種化合物的形狀、大小、分子量和理化性質都各不相同。沒有固定操作方法。（2）有些化合物在生物材料中含量極微，只達萬分之一，甚至百萬分之一。因此，分離操作

20、步驟多，不易獲得高收率。（3）生物活性物質離開生物體后，易變性，破壞，分離進程必須十分小心的保護這些化合物的生理活性。（難點）（4）生物制藥的分離方法幾乎都在溶液中進行，各種參數（溫度，pH，離子強度）對溶液中各種組分的綜合影響常常無法固定，以致許多實驗設計理論性不強。（5）為了保護目的物的生理活性及結構上的完整性，生物制藥中的分離方法多采用溫和的逐級分離方法。親和層析分離具有分離的專一性，高效性。（6）生物產品最后均一性的證明與化學純度的概念不完全相同，因生物分子對環(huán)境反應十分敏感，結構與功能關系比較復雜。二、生物制藥中分離制備方法的基本原理生物大分子分離純化的主要原理：（1）根據分子形狀和

21、大小不同進行分離。如差速離心與超離心、膜分離（透析，電滲析）與超濾，凝膠過濾法。（2）根據分子電離性質的差異性進行分離。如離子交換法，電泳法，等電聚焦法。（3）根據分子極性大小及溶解度不同進行分離。如溶劑提取法，逆流分配法，分配層析法，鹽析法，等電點沉淀法，及有機溶劑分級沉淀法。（4）根據物質吸附性質的不同進行分離。如選擇性吸附法與吸附層析法。（5）根據配體特異性進行分離親和層析法。三、分離純化的基本程序和實驗設計 生物體內某一組分，特別是未知結構的組分的分離制備設計大致上分為五個基本階段：（1）確定制備物的研究目的及建立相應的分析鑒定方法；（2）制備物理化性質穩(wěn)定性的預備試驗；（3）材料處理

22、及抽提方法的選擇；（4）分離純化方法的摸索；（5）產物均一性測定。提取是分離純化目的物的第一步，所選的溶劑應對目的物具有最大的溶解度，并盡量減少雜質進入提取液。分離純化是生化制備的核心操作。分離策略：1.分離純化早期使用方法的選擇 分離純化的早期，由于提取液中的成分復雜，目的物濃度較稀，與目的物理化性質相似的雜質多，所以不宜選擇分辨能力較高的純化方法。早期分離純化用萃取，沉淀，吸附等一些分辨力低的方法較為有利，這些方法負荷能力大，分離量多兼有分離提純和濃縮的作用，為進一步分離純化創(chuàng)造良好的基礎。 一個特異性方法的分辨力愈高，便意味著提純步驟愈簡化，收率愈高。2.各種分離純化方法的使用程序 生化

23、物質的分離都是在液相中進行，故分離方法主要依據物質的分配系數，分子量大小，離子電荷性質及數量和外加環(huán)境條件的差別等因素為基礎。而每一種方法又都是在特定條件下發(fā)揮作用。因此，在相同或相似條件下連續(xù)使用同一種分離方法就不太適宜。 在安排純化方法順序時，還要考慮到有利于減少工序，提高效率。（鹽析吸附，吸附鹽析） 對于一未知物通過各種方法的交叉應用，有助于進一步了解目的物的性質。3.分離后期的保護性措施 在分離操作的后期必須注意避免產品的損失，主要損失途徑是器皿的吸附，操作過程樣品液體的殘留，空氣氧化和某些事先無法了解的因素。四、分離純化方法步驟優(yōu)劣的綜合評價 每一個分離純化步驟的好壞，除了從分辨能力

24、和重現性兩方面考慮，還要注意方法本身的回收率，特別是制備某些含量很少的物質時，回收率的高低十分重要。 對每一步驟方法的優(yōu)劣，體現在所得產品重量與活性平衡關系上。例如酶的分離純化，每一步驟產物重量與活性關系，通過測定酶的比活力及溶液中蛋白質濃度的比例。五、制備物均一性的鑒定 均一性是指所獲得的制備物只有一種完全相同的成分。（純度鑒定） 生物分子純度的鑒定方法很多，常用的有溶解度法、化學組成分析法，電泳法，免疫學方法，離心沉降分析法，各種色譜法，生物功能測定法，以及質譜法。 第五節(jié)第五節(jié) 生物制藥中試放大工藝設計生物制藥中試放大工藝設計一、生物制藥中試放大工藝特點 中試放大是由小試轉入工業(yè)化生產的過渡性研究工作，對小試工藝能否成功地進入規(guī)模生產至關重要。這些研究工作都是圍繞如何提高收率，改進操作，提高質