第三章 載體與宿主的選擇

1、第三章第三章 基因工程載體及宿主基因工程載體及宿主第一節(jié)第一節(jié) 用于基因克隆的載體質(zhì)粒（plasmid）噬菌體或病毒DNA考斯質(zhì)粒（cosmid）與噬菌粒人造染色體載體載體的功能及特征真核細(xì)胞的克隆載體1 載體的功能及特征載體的功能運(yùn)送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供必要的條件載體應(yīng)具備的條件具有針對(duì)受體細(xì)胞的親緣性或親和性（可轉(zhuǎn)移性） 具有合適的篩選標(biāo)記 具有較高的外源DNA的載裝能力 具有多種單一的核酸內(nèi)切酶識(shí)別切割位點(diǎn) 具有與特定受體細(xì)胞相適應(yīng)的復(fù)制位點(diǎn)或整合位點(diǎn) 2 質(zhì)粒2.1 質(zhì)粒的定義質(zhì)粒（質(zhì)粒（Plasmid）：細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)一種自我

2、復(fù)制的環(huán)狀雙鏈）：細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)一種自我復(fù)制的環(huán)狀雙鏈DNA分分子，能穩(wěn)定地獨(dú)立存在于染色體外，并傳遞到子代，一般不整合子，能穩(wěn)定地獨(dú)立存在于染色體外，并傳遞到子代，一般不整合到宿主染色體上?，F(xiàn)在常用的質(zhì)粒大多數(shù)是經(jīng)過改造或人工構(gòu)建到宿主染色體上?，F(xiàn)在常用的質(zhì)粒大多數(shù)是經(jīng)過改造或人工構(gòu)建的，常含抗生素抗性基因，是重組的，常含抗生素抗性基因，是重組DNA技術(shù)中重要的工具。技術(shù)中重要的工具。雙螺旋共價(jià)閉合雙螺旋共價(jià)閉合環(huán)（環(huán)（SC構(gòu)型）構(gòu)型）開環(huán)雙螺旋開環(huán)雙螺旋（OC構(gòu)型）構(gòu)型）線狀雙螺旋線狀雙螺旋（L構(gòu)型）構(gòu)型）大腸桿菌的質(zhì)粒主要有大腸桿菌的質(zhì)粒主要有F質(zhì)粒（大腸桿菌致育因子）質(zhì)粒（大腸桿菌致育因子

3、）、 Col質(zhì)粒（大腸桿菌素因子）、質(zhì)粒（大腸桿菌素因子）、 R質(zhì)粒（抗藥性因質(zhì)粒（抗藥性因子）、降解質(zhì)粒等。子）、降解質(zhì)粒等。隱蔽性質(zhì)粒隱蔽性質(zhì)粒多表型質(zhì)粒多表型質(zhì)粒2.2 質(zhì)粒的基本特征質(zhì)粒是生物細(xì)胞內(nèi)固有的、能獨(dú)立于寄主染色體而自主復(fù)制、并被穩(wěn)定遺傳的一類核酸分子。質(zhì)粒廣泛存在于細(xì)菌細(xì)胞中，在霉菌、藍(lán)藻、酵母和一些動(dòng)植物細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了質(zhì)粒。絕大多數(shù)的質(zhì)粒是DNA型的，少量線型或RNA質(zhì)粒。絕大多數(shù)的天然DNA質(zhì)粒具有共價(jià)、封閉、環(huán)狀的分子結(jié)構(gòu)，即cccDNA（covalently closed circular DNA）質(zhì)粒DNA的分子量范圍：1 - 300 kb2.2.1質(zhì)粒的自主復(fù)制

4、性質(zhì)粒能利用寄主細(xì)胞的DNA復(fù)制系統(tǒng)進(jìn)行自主復(fù)制質(zhì)粒DNA上的復(fù)制子結(jié)構(gòu)決定了質(zhì)粒與寄主的對(duì)應(yīng)關(guān)系根據(jù)在每個(gè)細(xì)胞中的分子數(shù)（拷貝數(shù)）多寡，質(zhì)粒可分為兩大復(fù)制類型：嚴(yán)緊型復(fù)制控制的質(zhì)粒 1 - 3 拷貝 （stringent plasmid）松弛型復(fù)制控制的質(zhì)粒 10 - 60 拷貝 （relaxed plasmid）不同類型質(zhì)粒其本質(zhì)是是否受宿主細(xì)胞不穩(wěn)定的復(fù)制起始蛋白不同類型質(zhì)粒其本質(zhì)是是否受宿主細(xì)胞不穩(wěn)定的復(fù)制起始蛋白控制?？刂啤＜词故峭毁|(zhì)粒，其拷貝數(shù)在不同的寄主細(xì)胞間和不同的生長即使是同一質(zhì)粒，其拷貝數(shù)在不同的寄主細(xì)胞間和不同的生長環(huán)境也可能有很大的變化。環(huán)境也可能有很大的變化。 目前

5、公認(rèn)的用于闡釋質(zhì)粒用于闡釋質(zhì)粒DNA復(fù)制控制機(jī)理的分子模型有兩復(fù)制控制機(jī)理的分子模型有兩種：其一是種：其一是自體阻遏蛋白質(zhì)模型自體阻遏蛋白質(zhì)模型（autorepressor model），其二），其二是是抑制蛋白質(zhì)稀釋模型抑制蛋白質(zhì)稀釋模型（inhibitor dilution model）。前者的核心）。前者的核心內(nèi)容是，阻遏蛋白質(zhì)的合成受負(fù)反饋（內(nèi)容是，阻遏蛋白質(zhì)的合成受負(fù)反饋（negative feedback）機(jī)理）機(jī)理調(diào)節(jié)，而且其濃度是恒定的。后者的關(guān)鍵論點(diǎn)是，阻遏蛋白質(zhì)是調(diào)節(jié)，而且其濃度是恒定的。后者的關(guān)鍵論點(diǎn)是，阻遏蛋白質(zhì)是組成型合成，其濃度同質(zhì)粒的拷貝數(shù)成正比。組成型合成，其濃

6、度同質(zhì)粒的拷貝數(shù)成正比。（1）抑制蛋白質(zhì)稀釋模型）抑制蛋白質(zhì)稀釋模型它認(rèn)為質(zhì)粒它認(rèn)為質(zhì)粒DNA的復(fù)的復(fù)制，是受一種由質(zhì)粒制，是受一種由質(zhì)粒DNA編碼的抑制蛋白質(zhì)編碼的抑制蛋白質(zhì)Cop調(diào)控調(diào)控的。細(xì)胞中的。細(xì)胞中Cop蛋白質(zhì)的濃蛋白質(zhì)的濃度是同質(zhì)粒分子的拷貝數(shù)度是同質(zhì)粒分子的拷貝數(shù)成正比，它抑制質(zhì)粒成正比，它抑制質(zhì)粒DNA復(fù)制活性的作用方式有兩復(fù)制活性的作用方式有兩種途徑：一種是通過同質(zhì)種途徑：一種是通過同質(zhì)粒粒DNA的復(fù)制起點(diǎn)（的復(fù)制起點(diǎn)（oir）結(jié)合，直接地抑制質(zhì)粒結(jié)合，直接地抑制質(zhì)粒DNA的復(fù)制；另一種是通的復(fù)制；另一種是通過阻斷起始蛋白質(zhì)過阻斷起始蛋白質(zhì)Rep的合的合成，間接地抑制質(zhì)粒成

7、，間接地抑制質(zhì)粒DNA的合成。的合成。（2）自體阻遏蛋白質(zhì)模型）自體阻遏蛋白質(zhì)模型在抑制蛋白質(zhì)稀釋模型提出若干年之后在抑制蛋白質(zhì)稀釋模型提出若干年之后，L.Sompayrac和和O.Maaloe也提出了另外一也提出了另外一種解釋質(zhì)粒種解釋質(zhì)粒DNA復(fù)制機(jī)理的自體阻遏蛋白復(fù)制機(jī)理的自體阻遏蛋白質(zhì)模型。質(zhì)模型。這個(gè)模型對(duì)質(zhì)粒這個(gè)模型對(duì)質(zhì)粒DNA復(fù)制控制機(jī)理有復(fù)制控制機(jī)理有兩種解釋：兩種解釋：1.質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的復(fù)制是由一種叫做起始蛋的復(fù)制是由一種叫做起始蛋白質(zhì)白質(zhì)Rep引發(fā)的。引發(fā)的。Rep蛋白質(zhì)編碼基因蛋白質(zhì)編碼基因rep和和自體阻遏蛋白質(zhì)編碼基因自體阻遏蛋白質(zhì)編碼基因atr是屬于同一個(gè)是屬于同

8、一個(gè)操縱子，它們共轉(zhuǎn)錄成同一個(gè)操縱子，它們共轉(zhuǎn)錄成同一個(gè)mRNA分子。分子。自體阻遏蛋白質(zhì)通過同啟勸子自體阻遏蛋白質(zhì)通過同啟勸子-操縱基因區(qū)操縱基因區(qū)（P/O）的結(jié)合作用，調(diào)節(jié)質(zhì)粒）的結(jié)合作用，調(diào)節(jié)質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄作用，以維持細(xì)胞中作用，以維持細(xì)胞中Arr和和Rep蛋白質(zhì)處于蛋白質(zhì)處于恒定的水平。而后，由恒定的水平。而后，由Atr蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)產(chǎn)生蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)產(chǎn)生的的Rep蛋白質(zhì)，則是通過同復(fù)制起點(diǎn)（蛋白質(zhì)，則是通過同復(fù)制起點(diǎn)（ori）的結(jié)合，來引發(fā)質(zhì)粒的結(jié)合，來引發(fā)質(zhì)粒DNA的復(fù)制的復(fù)制圖（圖（a）。2. Rep蛋白質(zhì)是一種具有雙重功能的蛋蛋白質(zhì)是一種具有雙重功能的蛋白質(zhì)。它既具有自體阻遏蛋

9、白質(zhì)的功能，可白質(zhì)。它既具有自體阻遏蛋白質(zhì)的功能，可同同P/O區(qū)結(jié)合而抑制轉(zhuǎn)錄作用；同時(shí)又具有區(qū)結(jié)合而抑制轉(zhuǎn)錄作用；同時(shí)又具有起始蛋白質(zhì)的功能，能對(duì)復(fù)制起點(diǎn)（起始蛋白質(zhì)的功能，能對(duì)復(fù)制起點(diǎn)（ori）發(fā)生作用，引發(fā)質(zhì)粒發(fā)生作用，引發(fā)質(zhì)粒DNA進(jìn)行復(fù)制進(jìn)行復(fù)制圖（圖（b）2.2.2 質(zhì)粒的不相容性任何兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，不能同時(shí)存在于一個(gè)細(xì)胞中，這種現(xiàn)象稱為質(zhì)粒的不相容性，不相容性的質(zhì)粒組成不相容性群。以大腸桿菌的質(zhì)粒為例：ColE1、pMB1 擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容pSC101、F、RP4 擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容p15A及其衍生質(zhì)粒擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相

10、容質(zhì)粒的不相容性：分子機(jī)制兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，在復(fù)制時(shí)受到同一種拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的干擾，致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)不同，其中拷貝數(shù)多的質(zhì)粒在以后的細(xì)胞分裂周期中更具優(yōu)勢(shì)。兩種含有不同復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，在復(fù)制時(shí)各受自己的拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)恒定，因此在經(jīng)過若干復(fù)制周期和細(xì)胞分裂周期后仍能共處于同一細(xì)胞內(nèi)。2.2.3 質(zhì)粒的可轉(zhuǎn)移性革蘭氏陰性菌的質(zhì)?？煞殖蓛纱箢悾航雍闲唾|(zhì)粒 能在天然條件下自發(fā)地從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞（接合作用），如F、Col、R質(zhì)粒等非接合型質(zhì)粒 不能在天然條件下獨(dú)立地發(fā)生接合作用如Col、R的其它成員值得注意的是，某些非接合型質(zhì)粒（C

11、olE1）在接合型質(zhì)粒的存在和協(xié)助下，也能發(fā)生DNA轉(zhuǎn)移，這個(gè)過程由 bom 和mob 基因決定.接合型質(zhì)粒接合型質(zhì)粒分子量大分子量大嚴(yán)緊型復(fù)制嚴(yán)緊型復(fù)制 非接合型質(zhì)粒非接合型質(zhì)粒分子量小分子量小松弛型復(fù)制松弛型復(fù)制 在一般情況下，質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移能力與分子大小及復(fù)制型間有一在一般情況下，質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移能力與分子大小及復(fù)制型間有一定的相關(guān)性?，F(xiàn)歸納如下：定的相關(guān)性?，F(xiàn)歸納如下：2.2.4 攜帶特殊的遺傳標(biāo)記野生型的質(zhì)粒DNA上往往攜帶一個(gè)或多個(gè)遺傳標(biāo)記基因，這使得寄主生物產(chǎn)生正常生長非必需的附加性狀，包括：物質(zhì)抗性 抗生素、重金屬離子、毒性陰離子、有機(jī)物物質(zhì)合成 抗生素、細(xì)菌毒素、有機(jī)堿這些標(biāo)記

12、基因?qū)NA重組分子的篩選具有重要意義2.3 質(zhì)粒DNA的分離純化實(shí)驗(yàn)室一般使用下列三種方法制備質(zhì)粒DNA： 氯化銫密度梯度離心法 質(zhì)粒DNA純度高、周期長、設(shè)備要求高、溴乙錠污染堿溶法 質(zhì)粒DNA純度底、快速、操作簡(jiǎn)便沸水浴法 質(zhì)粒DNA純度、操作周期介于氯化銫法和堿溶法之間氯化銫密度梯度離心法： 用含有EDTA的緩沖液懸浮菌體 加溶菌酶裂解細(xì)菌細(xì)胞壁 加CsCl和溴乙錠超速離心過夜在紫外燈下吸取cccDNA稀釋沉淀cccDNAproteinsocDNAL-DNAcccDNARNAs堿溶法： 用含有EDTA的緩沖液懸浮菌體 加溶菌酶裂解細(xì)菌細(xì)胞壁 加NaOH和SDS的混合溶液，去膜釋放內(nèi)含物

13、 加高濃度的醋酸鉀溶液，沉淀染色體，去除染色體DNA及大部分蛋白質(zhì) 離心取上清液，用苯酚-氯仿萃取，去除痕量的蛋白質(zhì)乙醇或異丙醇沉淀水相質(zhì)粒DNA用無DNase的RNase去除殘余的RNA cccDNAL-DNAocDNAD-DNAT-DNA堿變性法質(zhì)粒提取的原理： 根據(jù)共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA與線性染色體DNA片斷之間，在拓?fù)鋵W(xué)上的差異而發(fā)展出來的。 在pH值12.012.5范圍內(nèi)時(shí)，線性的DNA會(huì)被變性而共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA卻不會(huì)被變性。 通過冷卻或恢復(fù)中性pH值使之復(fù)性，線性染色體形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而cccDNA可以準(zhǔn)確迅速復(fù)性，通過離心去除線性染色體，獲得含有cccDNA的上清液，最后用乙

14、醇沉淀，獲得質(zhì)粒DNA。沸水浴法： 用含有EDTA和Triton X-100的緩沖液懸浮菌體 加溶菌酶裂解細(xì)菌細(xì)胞壁 沸水浴40秒鐘離心，用無菌牙簽挑去沉淀物 乙醇或異丙醇沉淀質(zhì)粒DNA2.4 質(zhì)粒的構(gòu)建天然存在的野生型質(zhì)粒由于分子量大、拷貝數(shù)低、單一酶切位點(diǎn)少、遺傳標(biāo)記不理想等缺陷，不能滿足克隆載體的要求，因此往往需要以多種野生型質(zhì)粒為基礎(chǔ)進(jìn)行人工構(gòu)建。目前實(shí)驗(yàn)室使用的大腸桿菌質(zhì)粒大多是由少數(shù)幾個(gè)野生型質(zhì)粒構(gòu)建的：pSC101 8.8 kb 拷貝數(shù) 5 四環(huán)素抗性標(biāo)記基因 TcrColE1 6.5 kb 拷貝數(shù) 20 - 30 大腸桿菌內(nèi)毒素標(biāo)記基因 E1RSF2124 ColE1衍生質(zhì)粒

15、氨芐青霉素抗性標(biāo)記基因 Apr載體改造和構(gòu)建的原則載體改造和構(gòu)建的原則去掉不必要的DNA區(qū)段。減少限制酶的識(shí)別位點(diǎn)，一種酶只保留一個(gè)。（單一的限制性酶切位點(diǎn)）。加入易于撿出的選擇性標(biāo)記基因。對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行安全性改造，要求質(zhì)粒不能隨便轉(zhuǎn)移。改造或增加基因表達(dá)的調(diào)控序列。2.5 質(zhì)粒的分類人工構(gòu)建的質(zhì)粒根據(jù)其功能和用途可分成如下幾類： 高拷貝質(zhì)粒 突變拷貝數(shù)控制基因 拷貝數(shù)1000-3000 擴(kuò)增基因低拷貝質(zhì)粒 來自pSC101 拷貝數(shù)小于10 表達(dá)某些毒性基因溫敏質(zhì)粒 在不同溫度下表現(xiàn)出拷貝數(shù)、整合等不同性質(zhì)測(cè)序質(zhì)粒 含有測(cè)序通用引物互補(bǔ)序列和多酶接頭polylinker整合質(zhì)粒 裝有整合促進(jìn)基因及

16、位點(diǎn) 便于外源基因的整合穿梭質(zhì)粒 裝有針對(duì)兩種不同受體的復(fù)制子 便于基因克隆表達(dá)質(zhì)粒 裝有強(qiáng)化外源基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄、翻譯、純化的元件探針質(zhì)粒 裝有報(bào)告基因 便于啟動(dòng)子等元件的克隆篩選2.6 重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體松弛型復(fù)制 pBR3224363 bpOrigin of ReplicationROPROISal IBamH ITcrPvu IPst IPst IEcoR ICla IHind IIIHind IIBal IApr2.6.1 pBR322質(zhì)粒載體 氯霉素可擴(kuò)增拷貝數(shù) 50 - 100 / cell用于基因克隆 P49-53pSC101pSE2124pMB1重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體2.6

17、.2 pUC18 / 19 拷貝數(shù) 2000 - 3000 / cell用于基因克隆和測(cè)序 裝有多克隆位點(diǎn)（MCS）正選擇顏色標(biāo)記 lacZBamHIpUC182686 bpAprlacZoriGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT396452EcoRISstIKpnISmaIXbaISalIPstISphIHindIIIP53-54重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體pUC18 / 19：正選擇標(biāo)記 lacZ 的顯色原理pUC18/19PlaclacZMCSb-半乳糖苷酶的a-肽段OHHHOHHOHHOHCH2OHONClBrCl

18、BrClBrONN5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷X-galIPTG（異丙基硫代半乳糖苷，與乳糖結(jié)構(gòu)類似但不能被-半乳糖苷酶降解）重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體2.6.3 pGEM-3Z多拷貝裝有兩個(gè)噬菌體的強(qiáng)啟動(dòng)子裝有多克隆位點(diǎn)（MCS）正選擇顏色標(biāo)記 lacZ用于外源基因的高效表達(dá) 注意：T7和SP6啟動(dòng)子特異性地由噬菌體DNA編碼的RNA聚合2743 bpMCSlacZPT7oriAprpGEM-3ZPSP6酶所識(shí)別，因此相應(yīng)的受體菌必須表達(dá)噬菌體RNA聚合酶，如：E.coli BL21（DE3）等P55-56穿梭質(zhì)粒載體：人工構(gòu)建的具有穿梭質(zhì)粒載體：人工構(gòu)建的具有2種不同復(fù)制起點(diǎn)和

19、選擇標(biāo)記，在種不同復(fù)制起點(diǎn)和選擇標(biāo)記，在2種寄主內(nèi)都能存活和復(fù)制，并可攜帶外源基因往返穿梭的質(zhì)粒載體種寄主內(nèi)都能存活和復(fù)制，并可攜帶外源基因往返穿梭的質(zhì)粒載體大腸桿菌大腸桿菌-枯草桿菌穿梭質(zhì)粒載體枯草桿菌穿梭質(zhì)粒載體 如如pBE2 大腸桿菌大腸桿菌-釀酒酵母穿梭質(zhì)粒載體釀酒酵母穿梭質(zhì)粒載體 如如 pPIC9K 大腸桿菌大腸桿菌-動(dòng)物細(xì)胞穿梭質(zhì)粒載體動(dòng)物細(xì)胞穿梭質(zhì)粒載體 如如 pMT2 p562.6.4 穿梭質(zhì)粒載體穿梭質(zhì)粒載體大腸桿菌大腸桿菌-植物細(xì)胞穿梭質(zhì)粒載體植物細(xì)胞穿梭質(zhì)粒載體 如如 Ti 質(zhì)粒質(zhì)粒 3 噬菌體或病毒DNA噬菌體或病毒是一類非細(xì)胞微生物，能高效率高特異性地侵染宿主細(xì)胞，然

20、后或自主復(fù)制繁殖，或整合入宿主基因組中潛伏起來，而且在一定的條件下上述兩種狀態(tài)還會(huì)相互轉(zhuǎn)化。噬菌體或病毒的上述特性使得它們的DNA能被開發(fā)成為基因工程的有用載體，因?yàn)椋焊咝实母腥拘阅苁雇庠椿蚋咝?dǎo)入受體細(xì)胞自主復(fù)制繁殖性能使外源基因在受體細(xì)胞中高效擴(kuò)增3.1 大腸桿菌的 l 噬菌體3.1.1 l 噬菌體的生物學(xué)特性： 生物結(jié)構(gòu)l 噬菌體是大腸桿菌的溫和型噬菌體l 噬菌體由外殼包裝蛋白和l-DNA組成 l-DNA全長48502個(gè)核苷酸l-DNA上至少有61個(gè)基因l 噬菌體生物學(xué)特性： 生物結(jié)構(gòu)5 TCCAGCGGCGGGG33CCCGCCGCTGGA 5 COSCOScos頭部合成基因尾部合

21、成基因溶菌控制基因晚期控制基因DNA合成控制基因阻遏基因早期控制基因阻遏基因重組基因刪除與整合基因l l - DNAl 噬菌體生物學(xué)特性： 感染周期E.coli吸附LamB受體注入復(fù)制包裝裂解l 噬菌體生物學(xué)特性： 感染周期體內(nèi)包裝100個(gè)左右的拷貝包裝范圍為原DNA的75 - 105%即 36 - 51 kbDAl 噬菌體生物學(xué)特性： 溶原狀態(tài) l噬菌體感染大腸桿菌后，除能裂解細(xì)胞外，也可能將其DNA直接整合到宿主細(xì)胞的染色體DNA上，并不產(chǎn)生子代噬菌體顆粒，這種情況為溶原狀態(tài)。整合主要由l-DNA上的cI和int兩基因的產(chǎn)物所激活，而這兩個(gè)基因的開放與關(guān)閉又取決于宿主細(xì)胞本身的性質(zhì)。人們可

22、以根據(jù)需要改變l-DNA或宿主細(xì)胞的性質(zhì)，使噬菌體或處于溶菌狀態(tài)，或處于溶原狀態(tài) DNA重組技術(shù)一般需要l噬菌體進(jìn)入溶菌狀態(tài)3.1.2 l-DNA載體的構(gòu)建： 野生型l-DNA包裝的上限為51kb，本身長度為48.5kb，只有當(dāng)插入的外源DNA片段不大于2.5kb時(shí)，才能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒。因此縮短野生型l-DNA的長度，可以提高裝載量。其實(shí)野生型l-DNA上約有40-50%的片段是復(fù)制和裂解所非必需的。根據(jù)切除的多少，可將l-DNA分成兩大類載體： 插入型載體取代型載體DNA大小是野生噬菌體的大小是野生噬菌體的75-105%(37-51kb)，才能被包裝成，才能被包裝成噬菌體噬菌體

23、（1）縮短長度）縮短長度l-DNA載體的構(gòu)建：縮短長度 插入型載體體外包裝插入位點(diǎn)體外包裝插入片段載體長度 37 kb插入片段大?。? - 14 kb（51 37）l-DNA載體的構(gòu)建：縮短長度 取代型載體體外包裝體外包裝插入片段最小裝載長度 10 kb（36 51）載體長度 26 kb插入片段最大裝載長度 25 kb（2） 刪除重復(fù)的酶切位點(diǎn)野生型的l-DNA鏈上有5個(gè)EcoRI位點(diǎn)和7個(gè)HindIII位點(diǎn)，不利于重組操作，必須刪除至1 - 2個(gè)同時(shí)，為了便于各種來源的DNA片段的克隆，還需要增加一些單一的酶切位點(diǎn)除了簡(jiǎn)單的切割外，還需要采用定點(diǎn)突變技術(shù)去除或增添酶位點(diǎn)（3） 加裝選擇標(biāo)記與

24、質(zhì)粒不同，野生型l-DNA上缺少合適的選擇標(biāo)記，因此加裝選擇標(biāo)記是l-DNA克隆載體構(gòu)建的重要內(nèi)容l-DNA克隆載體上的選擇標(biāo)記主要有下列兩類：免疫功能類標(biāo)記顏色反應(yīng)類標(biāo)記加裝選擇標(biāo)記 imm434 imm434基因編碼一種阻止l-噬菌體進(jìn)入溶菌循環(huán)的阻遏物。含有完整標(biāo)記基因的l-載體進(jìn)入受體細(xì)胞后，建立溶原狀態(tài)，細(xì)菌生長緩慢，形成渾濁斑； 當(dāng)外源DNA插入到標(biāo)記基因中，基因滅活， l-重組分子便進(jìn)入溶菌循環(huán)，形成透明斑加裝選擇標(biāo)記 lacZ lacZ基因編碼b-半乳糖苷酶，能催化無色的X-gal生成藍(lán)色化合物。當(dāng)外源基因插入到lacZ基因中，基因滅活，不能合成藍(lán)色化合物；而空載體l-DNA則

25、產(chǎn)生藍(lán)色透明斑構(gòu)建琥珀密碼子的突變體 琥珀型突變（sup)是指由CAG（Gln）向UAG（stop）的突變。大腸桿菌的某些菌株含有特異性的校正基因，其編碼產(chǎn)物校正tRNA能專一性地糾正這一突變。 將野生型l-DNA上D和E兩個(gè)頭部包裝蛋白的基因中的CAG密碼子突變成UAG。當(dāng)這種l-DNA進(jìn)入一般的大腸桿菌菌株后，不能合成有活性的頭部蛋白，也就不能被包裝和裂解細(xì)菌，這樣就可以阻止有害重組體的生物污染及擴(kuò)散，而基因工程實(shí)驗(yàn)中使用的受體則是具有琥珀型突變體校正功能的菌株 3.1.3 l-DNA載體的主要類型：插入滅活型載體Charon2、Charon6、lgt11取代型載體lEMBL4、lgtlc

26、、lNM762、Charon40正選擇型載體lEMBL1、lL47、l1059野生型的l噬菌體不能在P2噬菌體溶源性的細(xì)菌中繁殖（Spi+），這種生長抑制表型受l-DNA上的red和gam兩個(gè)基因控制。若將外源DNA取代red和gam，重組噬菌體便擁有Spi-表型，能在P2噬菌體溶源性的大腸桿菌受體菌中繁殖，并形成透明斑3.1.4 l-DNA重組分子的體外包裝l-DNA重組分子需在體外人工包裝成有感染力的噬菌體重組顆粒，方可高效導(dǎo)入受體細(xì)胞用于體外包裝的蛋白質(zhì)可直接從感染了l噬菌體的大腸桿菌中提取，現(xiàn)已商品化。這些包裝蛋白通常分為相互互補(bǔ)的兩部分：一部分缺少E組份，另一部分則缺少D組份。包裝時(shí)

27、，當(dāng)且僅當(dāng)這兩部分包裝蛋白與重組l-DNA分子混合后，包裝才能有效進(jìn)行，任何一種蛋白包裝液被重組l-DNA污染后，均不能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒，這也是基于安全而設(shè)計(jì)的3.1.5 l-DNA及其重組分子的分離純化將大腸桿菌在含有麥芽糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期 加入l噬菌體或重組l噬菌體的懸浮液，37培養(yǎng)1小時(shí) 用新鮮培養(yǎng)基稀釋，繼續(xù)培養(yǎng)4 -12小時(shí)。這時(shí)噬菌體顆粒 密度已達(dá)1013 -1014 / L，大腸桿菌細(xì)胞已完全裂解 超速離心，沉淀噬菌體 苯酚抽提，釋放l-DNA 乙醇或異丙醇沉淀l-DNA 3.1.6 l-DNA作為載體的優(yōu)點(diǎn)l-DNA可在體外包裝成噬菌體顆粒，能高效轉(zhuǎn)染大腸

28、桿菌 l-DNA載體的裝載能力為25 kb，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于質(zhì)粒的裝載量 重組l-DNA分子的篩選較為方便 重組l-DNA分子的提取較為簡(jiǎn)便 l-DNA載體適合克隆和擴(kuò)增外源DNA片段，但不適合表達(dá) 外源基因3.2 大腸桿菌的M13單鏈?zhǔn)删wDNAM13噬菌體的生物學(xué)特性： 生物結(jié)構(gòu)M13噬菌體的外型呈絲狀M13 噬菌體由外殼包裝蛋白和正鏈DNA組成 M13 DNA全長6407個(gè)核苷酸M13 DNA上至少有10個(gè)基因2700個(gè)外殼蛋白分子M13 噬菌體不裂解宿主細(xì)胞，但抑制其生長 大腸桿菌的M13單鏈?zhǔn)删wDNAM13噬菌體的生物學(xué)特性： 感染周期+ DNA（+）DNARFDNARFDNARFDNA-

29、 DNAIIV大腸桿菌的M13單鏈?zhǔn)删wDNAM13 DNA載體的構(gòu)建：III VI I IV II X V VII IX VIII野生型M13RF-DNAIII VI I IV II X V VII IX VIIIM13mp系列載體lacZpolylinker大腸桿菌的M13單鏈?zhǔn)删wDNAM13 DNA載體的特點(diǎn)：使克隆的DNA片段以特定單鏈的形式輸出受體細(xì)胞外這在DNA定向突變中非常有用M13重組分子篩選簡(jiǎn)便被M13噬菌體感染的受體細(xì)胞生長緩慢，形成混濁斑，易于辨認(rèn)挑選。而且重組分子越大，混濁斑的混濁度亦越大 但M13-DNA載體的最大缺陷是裝載量小，只有1.5 kb 與動(dòng)植物受體細(xì)胞相

30、適應(yīng)的載體一般選擇相應(yīng)動(dòng)植物的病毒基因組DNA。 動(dòng)植物病毒種類繁多，每一種動(dòng)植物都有多種特異性的病毒。按照基因組的結(jié)構(gòu)，可將動(dòng)植物病毒分成四大類： 單鏈DNA病毒雙鏈DNA病毒單鏈RNA病毒雙鏈RNA病毒 RNA病毒在自我復(fù)制時(shí)大多存在相應(yīng)的DNA中間反應(yīng)物，這些中間體可作為載體進(jìn)行常規(guī)的DNA重組。4 考斯質(zhì)粒與噬菌粒 l-DNA載體和M13-DNA載體的裝載量最大分別為25 kb和1.5 kb，但在很多情況下，往往需要克隆更大的外源DNA片段，考斯質(zhì)粒和噬菌粒載體的構(gòu)建就是為了進(jìn)一步提高噬菌體DNA的裝載量。 在包裝上限固定的條件下，大幅度縮短噬菌體DNA的長度，就能同步增加載體的裝載能

31、力。將噬菌體DNA與包裝有關(guān)的序列與質(zhì)粒組裝在一起，既能最大限度地縮短載體的長度，同時(shí)又能保證重組DNA分子在體外仍被包裝成有感染力的顆粒，這便是構(gòu)建考斯質(zhì)粒和噬菌粒載體的思路。當(dāng)然，由于考斯質(zhì)粒和噬菌粒不再攜帶包裝蛋白基因，因此重組DNA分子在細(xì)胞內(nèi)不能形成噬菌體顆粒。4.1 考斯質(zhì)粒（cosmid）考斯質(zhì)粒載體的構(gòu)建：考斯質(zhì)粒是一類人工構(gòu)建的含有l(wèi)-DNA cos序列和質(zhì)粒復(fù)制子的特殊類型的載體1978年Collins和Hohn發(fā)明構(gòu)建pHC796400 bpTcrl fragmentcosoriAprPstIBamHISalIcos site - carrying plasmid1.8

32、kb的l-DNA片段 + pBR322片段裝載范圍為31 - 45 kb考斯質(zhì)粒（cosmid）考斯質(zhì)粒載體的特點(diǎn)：能像l-DNA那樣進(jìn)行體外包裝，并高效轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞 裝載量大（45 kb）且克隆片段具有一定的大小范圍能像質(zhì)粒那樣在受體細(xì)胞中自主復(fù)制重組操作簡(jiǎn)便，篩選容易不能體內(nèi)包裝，不裂解受體細(xì)胞4.2 噬菌粒（phagemid or phasmid）噬菌粒載體的特點(diǎn)：噬菌粒是一類人工構(gòu)建的含有單鏈?zhǔn)删w包裝序列、復(fù)制子以及質(zhì)粒復(fù)制子、克隆位點(diǎn)、標(biāo)記基因的特殊類型的載體能像M13-DNA那樣體外包裝，并高效轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞 裝載量比常規(guī)的M13mp系列要大很多（10 kb）能像質(zhì)粒那樣在受體細(xì)胞

33、中自主復(fù)制重組操作簡(jiǎn)便，篩選容易通過克隆雙鏈DNA能獲得同等長度的單一單鏈DNA噬菌粒（phagemid or phasmid）重要的噬菌粒載體：pUC118 / 119pUC118 pUC18 + M13間隔區(qū) IGpUC119 pUC19 + M13間隔區(qū) IG500 個(gè)拷貝3200 bpMCSlacZlacIoriAprM13-IGpUC118 / 119表示M13輔助噬菌體DNA噬菌粒（phagemid or phasmid）重要的噬菌粒載體：pBluescript 體外轉(zhuǎn)錄載體pBluescript = pUC + f1-ori + PT3 + PT72958 bpMCSlacZPT

34、7oriAprf1-oripBluescriptPT3噬菌體啟動(dòng)子PT3和PT7強(qiáng)化外源基因的轉(zhuǎn)錄提取出來的單鏈DNA重組分子在噬菌體RNA聚合酶的存在下，又可實(shí)現(xiàn)外源基因的體外轉(zhuǎn)錄5 人造染色體載體 人類、動(dòng)物、植物的全基因組序列分析往往需要克隆數(shù)百甚至上千 kb 的DNA片段， 此時(shí)考斯質(zhì)粒和噬菌粒載體的裝載量也遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足需要。 將細(xì)菌接合因子或酵母菌染色體上的復(fù)制區(qū)、分配區(qū)、穩(wěn)定區(qū)與質(zhì)粒組裝在一起，即可構(gòu)成染色體載體。當(dāng)大片段的外源DNA克隆在這些染色體載體上后，便形成重組人造染色體，它能像天然染色體那樣，在受體細(xì)胞中穩(wěn)定的復(fù)制并遺傳。 目前常用的人造染色體載體包括：細(xì)菌人造染色體（B

35、AC）酵母人造染色體（YAC）5.1 細(xì)菌人造染色體（Bacterial Artificial Chromosomes BAC）細(xì)菌人造染色體通常是在大腸桿菌性因子F質(zhì)粒的基礎(chǔ)上構(gòu)建的，其裝載量范圍在50 - 300 kb之間各種類型的pBACs在大腸桿菌受體菌只能維持單一拷貝pBACs主要適用于：克隆大型基因簇（gene cluster）結(jié)構(gòu)構(gòu)建動(dòng)植物基因文庫oriS, repE - F for plasmid replication and regulation of copy number. parA and parB for partitioning F plasmid DNA to

36、daughter cells during division and ensures stable maintenance of the BAC. A selectable markers for antibiotic resistance, some BACs also have lacZ at the cloning site for blue/white selection. T7 & Sp6 phage promoters for transcription of inserted genes.5.2 酵母人造染色體（Yeast Artificial Chromosomes Y

37、AC）YAC載體應(yīng)含有下列元件： 酵母染色體的端粒序列 酵母人造染色體的構(gòu)建：pYAC4CEN4EcoRIURA3TELBamHITELoriAprTRP1ARS1酵母染色體的復(fù)制子 酵母染色體的著絲粒序列 酵母系統(tǒng)的選擇標(biāo)記大腸桿菌的復(fù)制子 大腸桿菌的選擇標(biāo)記YAC載體的裝載量為350 - 400 kb酵母人造染色體（Yeast Artificial Chromosomes YAC）酵母人造染色體的使用：pYAC4CENEcoRIURATELBamHITELoriAprTRPARSEcoRIEcoRIEcoRIBamHI連接轉(zhuǎn)化酵母菌重組酵母染色體插入大小質(zhì)粒載體0-3k噬菌體載體0-10k

38、或10-25kM13噬菌體載體1.5k粘粒載體20-45k人工染色體50-400kn6 真核細(xì)胞的克隆載體6.1 酵母細(xì)胞中基因克隆常用載體酵母細(xì)胞中基因克隆常用載體（1）能在大腸桿菌中克隆，并且具有較高的拷貝數(shù)。這樣可使外源基）能在大腸桿菌中克隆，并且具有較高的拷貝數(shù)。這樣可使外源基因轉(zhuǎn)化到酵母細(xì)胞之前先在大腸桿菌中擴(kuò)增；因轉(zhuǎn)化到酵母細(xì)胞之前先在大腸桿菌中擴(kuò)增；（2）含有在酵母中便于選擇的遺傳標(biāo)記。有些還攜帶用于大腸桿菌的）含有在酵母中便于選擇的遺傳標(biāo)記。有些還攜帶用于大腸桿菌的抗菌素抗性標(biāo)記；抗菌素抗性標(biāo)記；（3）含有合適的限制酶切位點(diǎn)，以便外源基因的插入。共有三種類型）含有合適的限制酶切

39、位點(diǎn)，以便外源基因的插入。共有三種類型的載體的載體 1.整合型載體（整合型載體（YIP） 2.復(fù)制型載體（復(fù)制型載體（YRP） 3.附加體型載體（附加體型載體（YEP）YIP型載體是由大腸桿菌質(zhì)粒和酵母的型載體是由大腸桿菌質(zhì)粒和酵母的DNA片段構(gòu)成的。如片段構(gòu)成的。如Pyeleu10是由是由ColEI質(zhì)粒和酵母質(zhì)粒和酵母DNA提供的亮氨酸基因（提供的亮氨酸基因（Leu2+）片段構(gòu)成，在細(xì)菌中復(fù)制、擴(kuò)增，進(jìn)入酵母后可整合）片段構(gòu)成，在細(xì)菌中復(fù)制、擴(kuò)增，進(jìn)入酵母后可整合表達(dá)。表達(dá)。YIP型載體的特點(diǎn)是轉(zhuǎn)化率低型載體的特點(diǎn)是轉(zhuǎn)化率低(只有只有1-10轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)化子/微克微克DNA)，但轉(zhuǎn)化子遺傳性穩(wěn)定

40、穩(wěn)定，多用于遺傳分析工作。，但轉(zhuǎn)化子遺傳性穩(wěn)定穩(wěn)定，多用于遺傳分析工作。YRP型載體是帶有選擇標(biāo)記和復(fù)制子的酵母的型載體是帶有選擇標(biāo)記和復(fù)制子的酵母的DNA片段插入到大腸片段插入到大腸桿菌質(zhì)粒中構(gòu)成的。因?yàn)樗瑫r(shí)含有大腸桿菌和酵母的自主復(fù)制桿菌質(zhì)粒中構(gòu)成的。因?yàn)樗瑫r(shí)含有大腸桿菌和酵母的自主復(fù)制基因，所以能在兩種細(xì)胞中存在和復(fù)制?？梢栽趦煞N截然不同的基因，所以能在兩種細(xì)胞中存在和復(fù)制?？梢栽趦煞N截然不同的生物細(xì)胞中復(fù)制的載體稱為穿梭載體（生物細(xì)胞中復(fù)制的載體稱為穿梭載體（Shuttle Vector）.穿梭載穿梭載體在基因工程中廣泛使用。體在基因工程中廣泛使用。 YRP型載體轉(zhuǎn)化率高，拷貝也高

41、，型載體轉(zhuǎn)化率高，拷貝也高，但不穩(wěn)定，易丟失但不穩(wěn)定，易丟失YEP型載體型載體一般由大腸桿菌質(zhì)粒、2m質(zhì)粒以及酵母染色體的選擇標(biāo)記構(gòu)成。2m質(zhì)粒含有自主復(fù)制起始區(qū)（Ori）和STB區(qū),STB序列能夠使質(zhì)粒在供體細(xì)胞中維持穩(wěn)定。利用2m質(zhì)粒，人們已經(jīng)構(gòu)建出許多YEP型載體。 YEP型載體對(duì)酵母具有很高的轉(zhuǎn)化活性，一般為103-105轉(zhuǎn)化子/微克DNA。比YRP型載體更穩(wěn)定，拷貝數(shù)也高（25-100個(gè)/細(xì)胞），是基因克隆中的常用載體。 6.2 植物基因克隆的載體植物基因克隆的載體Ti質(zhì)粒質(zhì)粒Ti質(zhì)粒存在于能夠引起質(zhì)粒存在于能夠引起植物形成冠癭瘤的植物形成冠癭瘤的土壤農(nóng)桿菌中。這土壤農(nóng)桿菌中。這種腫

42、瘤的形成是由種腫瘤的形成是由Ti質(zhì)粒決定的，故質(zhì)粒決定的，故稱為誘導(dǎo)腫瘤的質(zhì)稱為誘導(dǎo)腫瘤的質(zhì)粒（粒（Tumor inducing plasmid），簡(jiǎn)稱，簡(jiǎn)稱Ti質(zhì)粒。質(zhì)粒。T-DNA的染色體整合機(jī)制的染色體整合機(jī)制農(nóng)桿菌介導(dǎo)法農(nóng)桿菌介導(dǎo)法大腸桿菌質(zhì)粒大腸桿菌篩選標(biāo)記農(nóng)桿菌篩選標(biāo)記多克隆位點(diǎn)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌農(nóng)桿菌細(xì)菌接合T-DNA區(qū)同源整合農(nóng)桿菌感染植物根部細(xì)胞T-DNA區(qū)整合在植物細(xì)胞基因組上共整合轉(zhuǎn)化程序共整合轉(zhuǎn)化程序LBRBT-DNA外源基因植物細(xì)胞篩選標(biāo)記 Kmr大腸桿菌-農(nóng)桿菌穿梭質(zhì)粒大腸桿菌篩選標(biāo)記農(nóng)桿菌篩選標(biāo)記農(nóng)桿菌ori大腸桿菌ori二元整合轉(zhuǎn)化程序二元整合轉(zhuǎn)化程序6.3

43、SV40病毒（猿猴空泡病毒病毒（猿猴空泡病毒40）呈小型）呈小型20面體，環(huán)狀面體，環(huán)狀DNA，外殼蛋，外殼蛋白由白由VP1、VP2、VP3構(gòu)成。構(gòu)成。受納細(xì)胞（受納細(xì)胞（permissive cell）：能使細(xì)胞裂解釋放感染性病毒顆粒）：能使細(xì)胞裂解釋放感染性病毒顆粒，并使寄主細(xì)胞裂解，如猿猴細(xì)胞，并使寄主細(xì)胞裂解，如猿猴細(xì)胞 。非受納細(xì)胞（非受納細(xì)胞（non permissive cell）：不產(chǎn)生感染性病毒顆粒，但）：不產(chǎn)生感染性病毒顆粒，但能整合到細(xì)胞染色體中產(chǎn)生癌變，如小鼠或倉鼠的細(xì)胞能整合到細(xì)胞染色體中產(chǎn)生癌變，如小鼠或倉鼠的細(xì)胞 。SV40病毒載體病毒載體 1. 取代型重組病毒載體取代型重組病毒載體2. 重組的病毒重組的病毒-質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體取代型的重組病毒載體取代型的重組病毒載體（recombinant Virus Vector）,其特其特點(diǎn)是外源點(diǎn)是外源DNA直接插入在缺陷型的病毒基因組上。插入直接插入在缺陷型的病毒基因組上。插入的外源的外源DNA片段在大小同被取代的病毒基因組區(qū)段是等片段在大小同被取代的病毒基因組區(qū)段是等同的，這樣形成的重組體同的，這樣形成的重組體DNA能夠在哺乳動(dòng)物的受納細(xì)能夠在哺乳動(dòng)物的受納細(xì)胞中增殖，并被包裝成病毒顆粒。但為了補(bǔ)充被取代的胞中增殖，并被包裝成病毒顆粒。但為了補(bǔ)充被取代的病毒基因組病毒基因組DNA的功能，必須使用一種與之互補(bǔ)