細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)_(2)

1、細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)細(xì)胞是生命活動(dòng)的基本單位細(xì)胞是生命活動(dòng)的基本單位n1665年英國(guó)學(xué)者Robert Hooke，用自制的顯微鏡觀察軟木的薄片，第一次發(fā)現(xiàn)植物的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，并首次借用拉丁文Cella（小室）詞。n1838年德國(guó)植物學(xué)家施萊登和動(dòng)物學(xué)家施旺確立了“細(xì)胞學(xué)說(shuō)”的基本原則。n（）細(xì)胞是有機(jī)體，動(dòng)植物都是由細(xì)胞發(fā)育來(lái)的；n（）每個(gè)細(xì)胞都作為一個(gè)相對(duì)的獨(dú)立單位，有自己 的“生命”。n（）新的細(xì)胞可以通過(guò)老的細(xì)胞繁殖產(chǎn)生。n進(jìn)化論，遺傳學(xué)和細(xì)胞學(xué)說(shuō)定為現(xiàn)代生物學(xué)的三大基 石，而細(xì)胞學(xué)說(shuō)又是后二者的基石。細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng) 從生物體內(nèi)取出細(xì)胞（組織），模擬體內(nèi)生理環(huán)境，在無(wú)菌、適當(dāng)溫度和一定營(yíng)養(yǎng)條件

2、下，使之生存、生長(zhǎng)并維持其結(jié)構(gòu)和功能的方法 。細(xì)胞（組織），包括器官培養(yǎng)終歸是離體培養(yǎng)，缺少生物整體的嚴(yán)密聯(lián)系，不能代表整個(gè)機(jī)體。在進(jìn)行醫(yī)學(xué)生物實(shí)驗(yàn)過(guò)程及對(duì)結(jié)果的評(píng)估是都必須考慮這些。細(xì)胞培養(yǎng)的基本概念n 傳代：傳代：n 細(xì)胞在培養(yǎng)器皿中生長(zhǎng)一定時(shí)間后，被分開(kāi)接種到新的培養(yǎng)器皿中。n 原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)n 取自體內(nèi)新鮮組織并置于體外條件下生長(zhǎng)的細(xì)胞在傳代之前稱(chēng)為原代培養(yǎng)。 n細(xì)胞培養(yǎng)：使用單個(gè)細(xì)胞懸液n組織培養(yǎng)：使用組織塊（0.51立方毫米）或薄片（厚0.2 毫米）n器官培養(yǎng)：使用器官原基或器官的一部分或整個(gè)器宮原代培養(yǎng)細(xì)胞的生命歸宿n原代培養(yǎng)期n傳代期n衰退期n有限細(xì)胞系，無(wú)限細(xì)胞系 n細(xì)胞系

3、 cell linen細(xì)胞株 cell strain 培養(yǎng)細(xì)胞的特性n 培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)方式n貼附生長(zhǎng)：n 必須貼附于支持物表面才能生長(zhǎng)。見(jiàn)于各種實(shí)體瘤細(xì)胞n懸浮生長(zhǎng)：n 于懸浮狀態(tài)下即可生長(zhǎng)，不需要貼附于支持物表面。見(jiàn)于各種造血系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞 每代貼附生長(zhǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程n游離期n貼壁期n潛伏期n對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期n停止期（平臺(tái)期）n游離期：n 細(xì)胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮 狀態(tài)也稱(chēng)懸浮期。此時(shí)細(xì)胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。n 10分鐘一4小時(shí)n貼壁期：n 細(xì)胞附著于底物上，游離期 結(jié)束。細(xì)胞株平均在10分鐘一4小時(shí)貼壁。n 底物：膠原、玻璃、塑料、其它細(xì)胞等n 血清中有促使細(xì)胞貼壁的冷析球蛋白和纖粘素、膠原等

4、糖蛋白（生長(zhǎng)基質(zhì)），這些帶正電荷的糖蛋白的促貼壁因子先吸附于底物上，懸浮細(xì)胞再與吸附有促貼壁因子的附著。n進(jìn)口塑料培養(yǎng)瓶涂有生長(zhǎng)基質(zhì)（化學(xué)合成的功能基團(tuán)）n潛伏期n 此時(shí)細(xì)胞有生長(zhǎng)活動(dòng)，而無(wú)細(xì)胞分裂。細(xì)胞株潛伏期一般為624小時(shí)。n對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期：n 細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間變化成倍增長(zhǎng)，活力最佳，最適合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。n停止期（平臺(tái)期）：n 細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)瓶壁后，細(xì)胞雖有活力但不再分裂n 機(jī)制：接觸抑制、密度依賴(lài)性細(xì)胞生長(zhǎng)狀況的觀察細(xì)胞周期0Count 200 400 600 8001000DNA content研究細(xì)胞動(dòng)力學(xué)、細(xì)胞的研究細(xì)胞動(dòng)力學(xué)、細(xì)胞的DNA合成代謝和合成代謝和有絲分裂。每一個(gè)增值過(guò)程都要經(jīng)過(guò)一

5、個(gè)周有絲分裂。每一個(gè)增值過(guò)程都要經(jīng)過(guò)一個(gè)周期來(lái)進(jìn)行，包括：期來(lái)進(jìn)行，包括：有絲分裂期（有絲分裂期（M期）期）分裂間期（生長(zhǎng)期）：生長(zhǎng)前期（分裂間期（生長(zhǎng)期）：生長(zhǎng)前期（G1)、DNA合成期（合成期（S）、生長(zhǎng)后期（）、生長(zhǎng)后期（G2）細(xì)胞周期的檢測(cè)方法流式細(xì)胞儀測(cè)定法流式細(xì)胞儀測(cè)定法培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的條件n1 細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)需要n2 細(xì)胞的生存環(huán)境 溫度: 37 O2 CO2: 5% CO2 +H2O H2CO3 H+ + HCO3- pH: 7.2-7.4 滲透壓n 3 無(wú)污染n 4 無(wú)毒 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)用品：實(shí)驗(yàn)用品：n超凈工作臺(tái)，壓力蒸汽消毒器，電熱干燥箱，濾器，酸缸nCO2培養(yǎng)箱n倒置顯微鏡n酶

6、標(biāo)儀、微孔板震蕩器n液氮罐n自動(dòng)雙重純水蒸餾器，純水儀n耗材：培養(yǎng)瓶，吸管，電動(dòng)吸引器，培養(yǎng)板， 凍存管n壓力蒸汽消毒器：壓力蒸汽消毒器：濕熱消毒，用途廣n電熱干燥箱：電熱干燥箱：干熱消毒（160 ，2小時(shí)）。主要用干玻璃 器皿消毒 n濾器：濾器：過(guò)濾除菌：大多數(shù)培養(yǎng)用液，如人工合成培養(yǎng)基、血清、 酶液等均采用濾過(guò)法除菌 n超凈工作臺(tái)：超凈工作臺(tái)：為細(xì)胞操作提供無(wú)菌環(huán)境n紫外燈紫外燈 ：紫外線消毒。 主要用于培養(yǎng)室空氣、操作臺(tái)、塑料 培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板等表面消毒 超凈臺(tái)n n超凈工作臺(tái)的工作原理是利用鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動(dòng)空氣遁過(guò)高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過(guò)工作臺(tái)面，使工作臺(tái)

7、內(nèi)構(gòu)成無(wú)菌環(huán)境。 濾 器高壓滅菌鍋n不同壓力蒸汽所達(dá)溫度不同壓力蒸汽所達(dá)溫度壓力（磅）溫度（度）5108.410115.215121.020126.025130.430134.5 CO2培養(yǎng)箱nCO2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為37 ，5CO2 。n使用CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)注意的問(wèn)題：n 用螺旋口瓶培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，需將瓶蓋微松，以保證通氣。n 保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈。定期消毒箱內(nèi)留蒸餾水3000毫升于蒸餾水槽中以保持箱內(nèi)濕度，避兔培養(yǎng)液蒸發(fā)。常用消毒方法及選擇常用消毒方法及選擇消毒物品壓力蒸汽干熱過(guò)濾紫外線化學(xué)氣體化學(xué)消毒劑電力輻射抗生素培養(yǎng)室/工作臺(tái) 玻璃制品 金屬器械 塑料制品 橡膠制品 培養(yǎng)用液 棉

8、布類(lèi) 自動(dòng)雙重純水蒸餾器 純水儀酶標(biāo)儀 微孔板震蕩器培 養(yǎng) 板 培養(yǎng)瓶n 常用玻璃器皿清洗n浸泡（自來(lái)水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（浸泡（自來(lái)水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（24小時(shí)）、小時(shí)）、n流水沖洗、蒸溜水浸泡和沖洗、流水沖洗、蒸溜水浸泡和沖洗、50烘干烘干清潔液的配制2 細(xì)胞培養(yǎng)用液的配制水：新鮮配置的三蒸水或去離子水平衡鹽溶液：無(wú)Ca2+、Mg2+的緩沖液 PBS：NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4 0.20 加水至1000 mln消化液：n 胰蛋白酶作用于與賴(lài)氨酸或精氨酸相連接的肽健，除去細(xì)胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細(xì)胞骨架，從而使

9、細(xì)胞分離。 n 胰蛋白酶液濃度越高，作用越強(qiáng)，但超過(guò)一定限度會(huì)損傷細(xì)胞。n 胰蛋白酶是一種黃白色粉末，用無(wú)Ca2+、Mg2+的PBS緩沖液配制常用的胰蛋白酶液濃度是0.25。用濾器過(guò)濾除菌。n胰蛋白酶液消化時(shí)間：2-10分鐘。n用含血清培養(yǎng)液終止其對(duì)細(xì)胞的消化作用 培養(yǎng)基n培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外細(xì)胞生存和生長(zhǎng)的溶液，分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。n天然培養(yǎng)基：天然培養(yǎng)基：n天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。n優(yōu)點(diǎn)：營(yíng)養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好n缺點(diǎn)：來(lái)源受限。n 成分復(fù)雜，影響對(duì)某些實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物的提取和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析。n 易發(fā)生支原體污染 合成培養(yǎng)基n 合成培養(yǎng)基是根據(jù)細(xì)胞生存

10、所需物質(zhì)的種類(lèi)和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。目前已設(shè)計(jì)出許多種培養(yǎng)基，如TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。n 合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無(wú)機(jī)鹽和其它一些輔助物質(zhì)。n 優(yōu)點(diǎn)：標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相對(duì)固定。 成本低 n 缺點(diǎn)： 缺少某些成分，不能完全滿(mǎn)足體外細(xì)胞生長(zhǎng)需要。 n人工合成培養(yǎng)基只能維持細(xì)胞生存，要想使細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖，還需補(bǔ)充一定量的天然培養(yǎng)基（如血清）。 n血清中含有：n多種蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等）n多種金屬離子； n激素； 促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等。n各種生長(zhǎng)因子n轉(zhuǎn)移蛋白n不明成分n一般說(shuō)來(lái)含5小牛血清的培養(yǎng)基

11、對(duì)大多數(shù)細(xì)胞可以維持細(xì)胞不死但支持細(xì)胞生長(zhǎng)一般需加 10血清n對(duì)于血清支持細(xì)胞生長(zhǎng)的生物學(xué)效應(yīng)已得到證明，但對(duì)血清中的復(fù)雜成分至今尚未完全清楚n血清中不僅存在促細(xì)胞生長(zhǎng)因子，同對(duì)也存在細(xì)胞生長(zhǎng)抑制因子或毒性因子，因此在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞所反映的生物學(xué)特性是細(xì)胞和復(fù)雜血清因子的綜合反應(yīng)。n在生長(zhǎng)因子、蛋白質(zhì)工程、基因表達(dá)調(diào)控等研究領(lǐng)域，迫切需要用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞n無(wú)血清培養(yǎng)基的主要研制策略：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中補(bǔ)充各種必需因子，如激素、生長(zhǎng)因子 、結(jié)合蛋白 、貼壁和擴(kuò)展因子 等。n無(wú)血清培養(yǎng)基由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和替代血清的補(bǔ)充成分組成。n1975年，Sato首次成功地用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)了垂體細(xì)胞株

12、，近20多年來(lái)已報(bào)道了幾十種細(xì)胞系在無(wú)血清培養(yǎng)基中成功地生長(zhǎng)和增殖。n無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基的使用保證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性、可重復(fù)性和穩(wěn)定性，減少了細(xì)胞污染，簡(jiǎn)化了提純和鑒定各種細(xì)胞產(chǎn)物的程序。n向無(wú)清培養(yǎng)液中能促進(jìn)細(xì)胞系生長(zhǎng)的補(bǔ)加物都是獨(dú)特的。適用于某種細(xì)胞株的培養(yǎng)液，很可能不適合另一種細(xì)胞株的生長(zhǎng)。即使同源組織的不同細(xì)胞株，所需補(bǔ)加物也不同。 無(wú)血清培養(yǎng)基尚處于研究階段，難以推廣。 目前，絕大多數(shù)人工合成培養(yǎng)基使用時(shí)還需添加血清 n血清質(zhì)量好壞是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。n常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、馬血清等，其中以胎牛血清質(zhì)量最好。n優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn)：透明，淡黃色，無(wú)沉淀物，無(wú)細(xì)菌、支

13、原體、病毒污染。n血清的滅活（消除補(bǔ)體活性）：56 ，30 分鐘n血清的消毒：過(guò)濾除菌n抗菌素的使用：n 在培養(yǎng)液配制后，培養(yǎng)液內(nèi)常加適量抗菌素，以抑制可能存在的細(xì)菌的生長(zhǎng)。n 通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用。培養(yǎng)基內(nèi)青霉素、鏈霉素最終使用濃度為每毫升100單位。n 慶大霉素：每毫升100單位方便、廣譜、穩(wěn)定完全培養(yǎng)基的組成n基礎(chǔ)培養(yǎng)基 80一95n血清 5一20n碳酸氫鈉 2.0 g/Ln青、鏈霉素 各100單位毫升培養(yǎng)基的配制 RPMI-1640培養(yǎng)粉 1袋 碳酸氫鈉 2.0 g 青、鏈霉素 各100單位毫升 加三蒸水 至 1000ml, 過(guò)濾除菌。 調(diào)節(jié)pH值至7.2 加血清（終濃度 10

14、） 無(wú)菌技術(shù)概念n【操作野消毒】n無(wú)菌培養(yǎng)室每天都要用0.2%的新潔爾滅拖洗地面次(拖布要專(zhuān)用)， 紫外線照射消毒30-50min，超凈工作臺(tái)臺(tái)面每次實(shí)驗(yàn)前要用75酒精擦洗。 然后紫外線消毒30min。在工作臺(tái)面消毒時(shí)切勿將培養(yǎng)細(xì)胞和培養(yǎng)用液同 時(shí)照射紫外線，消毒時(shí)工作臺(tái)面上用品不要過(guò)多或重疊放置，否則會(huì)遮擋射線降低消毒效果。些操作用具如移液器、廢液缸、污物盒、試管架等用75%酒精擦洗后置于臺(tái)內(nèi)同時(shí)紫外線消毒。【洗手和著裝】n原則上和外科手術(shù)相同。平時(shí)僅做觀察不做培養(yǎng)操作時(shí)，可穿著細(xì)胞培養(yǎng)室內(nèi)紫外線照射30min的清潔工作服。在利用超凈臺(tái)工 作時(shí)，因整個(gè)前臂要伸入箱內(nèi)，應(yīng)著長(zhǎng)袖的清潔工作服，并

15、于開(kāi)始 操作前要用75酒精消毒手。如果實(shí)驗(yàn)過(guò)程中手觸及可能污染的物 品和出入培養(yǎng)室都要重新用消毒液洗手。進(jìn)入原代培養(yǎng)室需徹底洗 手還要戴口罩、著消毒衣帽。【火焰消毒】n在無(wú)菌環(huán)境進(jìn)行培養(yǎng)或做其它無(wú)菌工作時(shí)，首先要點(diǎn)燃酒精燈。以后一切操作，如按裝吸管帽、打開(kāi)或封閉瓶 口等，都需在火焰近處并經(jīng)過(guò)燒灼進(jìn)行。體外培養(yǎng)細(xì)胞的常見(jiàn)問(wèn)題體外培養(yǎng)細(xì)胞的分型n（一）貼附型：n大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞貼附生長(zhǎng)，屬于貼壁依賴(lài)性細(xì)胞，判斷細(xì)胞形態(tài)時(shí)不能按照體內(nèi)組織學(xué)標(biāo)推判定，僅大致分成以下 四型：成纖維細(xì)胞型：n胞體呈梭型或不規(guī)則三角形，中央有卵圓形核， 胞質(zhì)突起，生長(zhǎng)時(shí)呈放射狀。除真正的成纖維細(xì) 胞外，凡由中胚層間充質(zhì)起源的

16、組織，如心肌、 平滑肌、成骨細(xì)胞、血管內(nèi)皮等常呈本型狀態(tài)。 另外，凡培養(yǎng)中細(xì)胞的形態(tài)與成纖維類(lèi)似時(shí)皆可 稱(chēng)之為成纖維細(xì)胞。n名稱(chēng)：凡在培養(yǎng)中形態(tài)與成纖維細(xì)胞類(lèi)似的n來(lái)源：由中胚層間充質(zhì)組織起源的組織如：n真正的成纖維細(xì)胞，心肌，平滑肌，成骨細(xì)胞，n血管內(nèi)皮n形態(tài)：似體內(nèi)成纖維細(xì)胞的形態(tài)，胞體梭形或不規(guī)則n三角形，胞質(zhì)向外伸出23個(gè)長(zhǎng)短不等的突起，n中有卵圓形核n生長(zhǎng)特點(diǎn)：排列成放射狀，漩渦狀，并不緊靠連成片，n細(xì)胞細(xì)胞接觸易斷開(kāi)而單獨(dú)行動(dòng)，游離的單獨(dú)n的成纖維樣細(xì)胞，常有幾個(gè)伸長(zhǎng)的細(xì)胞突起成纖維細(xì)胞2、上皮型細(xì)胞：n細(xì)胞呈扁平不規(guī)則多角形，中央有圓形核，細(xì)胞彼此緊密相連成單層膜。生長(zhǎng)時(shí)呈膜狀移

17、動(dòng)，處于膜邊緣 的細(xì)胞總與膜相連，很少單獨(dú)行動(dòng)。起源于內(nèi)、外胚 層的細(xì)胞如皮膚表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、 肺泡上皮等皆成上皮型形態(tài)。n名稱(chēng)：僅形態(tài)上似體內(nèi)，實(shí)際上不完全相同n來(lái)源：來(lái)源于外胚層、內(nèi)胚層細(xì)胞, 如：n皮膚及其衍生物,消化道，乳腺，肺泡, 上皮性腫瘤n形態(tài)：類(lèi)似體內(nèi)的上皮細(xì)胞扁平，不規(guī)則多角形，中有圓形核n生長(zhǎng)特點(diǎn)：易相連成片，相靠緊密相連成薄層鋪石狀n生長(zhǎng)時(shí)呈膜狀移動(dòng)，很少脫離細(xì)胞群而單個(gè)活動(dòng)上皮型細(xì)胞3、游走細(xì)胞型：n呈散在生長(zhǎng)，一般不連成片，胞質(zhì)常突起，呈活躍游走或變形運(yùn)動(dòng)，方向不規(guī)則。此型細(xì)胞不穩(wěn)定，有時(shí)難以 和其他細(xì)胞相區(qū)別。小鼠腹腔分離的單核巨噬細(xì)胞4、多型細(xì)胞

18、型n有一些細(xì)胞，如神經(jīng)細(xì)胞難以確定其規(guī)律和穩(wěn)定的形態(tài)，可統(tǒng)歸于此類(lèi)。（二）懸浮型n見(jiàn)于少數(shù)特殊的細(xì)胞，如某些類(lèi)型的癌細(xì)胞及白血病細(xì)胞。胞體圓形，不貼于支持物上，呈懸浮生長(zhǎng)。這類(lèi)細(xì)胞容易大量繁殖。n概念：培養(yǎng)時(shí)不貼附于底物而呈懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)或以機(jī)械方法使保持懸浮狀態(tài)下生長(zhǎng)n來(lái)源：自血，脾或骨髓，尤以血中白細(xì)胞癌腫瘤細(xì)胞n特點(diǎn)：在懸浮中生長(zhǎng)良好細(xì)胞圓形，單個(gè)或小細(xì)胞團(tuán)n優(yōu)點(diǎn)：生存空間大，提供數(shù)量大，傳代方便(不需消化)，易于收獲，可獲得穩(wěn)定狀態(tài)n缺點(diǎn)：觀察不方便，很多細(xì)胞不能懸浮生長(zhǎng)(尤以正常細(xì)胞)細(xì)胞傳代方法n 根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)的恃點(diǎn)，傳代方法有3種。n 1. 懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代n 離心法傳代：離心（1

19、000轉(zhuǎn)/分）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。n 直接傳代法：懸浮細(xì)胞沉淀在瓶壁時(shí)，將上清培養(yǎng)液去除l2一23，然后用吸管直接吹打形成細(xì)胞懸液再傳代。n 2 . 半懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代 此類(lèi)細(xì)胞部分呈現(xiàn)貼壁生長(zhǎng)現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹 打法使紉胞從瓶壁脫落下來(lái)，進(jìn)行傳代。n 3. 貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代 采用酶消化法傳代。常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液。貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代方法：n1 、吸光培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液n2 、加入1-2 ml 0.25的胰蛋白酶液(以消化液能覆蓋整個(gè)瓶底為準(zhǔn)）靜置2-10 min（顯微鏡下動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)）。n3 、 吸去胰蛋白酶液，加入培養(yǎng)液。n4 、用吸管吸取瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)

20、吹打瓶壁細(xì)胞，形成細(xì)胞懸液。n5、 吸取1/101/40細(xì)胞懸液，接種于新的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。n6 、加適量新鮮培養(yǎng)液于接種了細(xì)胞懸液的新培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。n7、 將后者放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞傳代培養(yǎng)消化法n培養(yǎng)細(xì)胞的取材n取材的基本要求：n盡快培養(yǎng)n嚴(yán)格無(wú)菌操作n減少對(duì)細(xì)胞的機(jī)械損傷n去除壞死組織，避免組織塊干燥n培養(yǎng)液營(yíng)養(yǎng)豐富n易培養(yǎng)的組織成功率高n詳細(xì)記錄原代細(xì)胞的培養(yǎng)取材的基本器材和用品n眼科組織彎剪、彎鑷、手術(shù)刀n小瓶裝無(wú)血清培養(yǎng)基、Hanks液n小燒杯n培養(yǎng)皿各部位組織的取材n皮膚和黏膜n內(nèi)臟和實(shí)體瘤n血細(xì)胞n骨髓、羊水、胸水、腹水內(nèi)細(xì)胞n鼠胚組織n雞胚組織組織材料的分離n細(xì)胞懸液的分離方法：血液

21、、羊水、胸水、腹水等細(xì)胞懸液離心分離，5001000r/min，510minn組織塊的分離方法n機(jī)械分散法n剪切分離法n消化分離法機(jī)械分散法n纖維成分很少的組織，如腦組織、部分胚胎組織以及一些腫瘤組織。方法： 1.剪刀剪切，吸管反復(fù)吹打分散組織細(xì)胞。 2.組織放在注射器內(nèi)通過(guò)針頭壓出。 3.注射器針芯擠壓通過(guò)不銹鋼篩網(wǎng)（50目、200目、400目）剪切分離法n組織塊移植培養(yǎng)時(shí)，將組織剪成或切成小塊（1cm3）用眼科剪反復(fù)剪切組織至糊狀，吸取培養(yǎng)液反復(fù)吹打，低速離心去上清，再分離培養(yǎng)。消化分離法胰蛋白酶消化法n用于消化細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織，如胚胎、上皮、肝、腎等，同時(shí)也用于培養(yǎng)的細(xì)胞。npH 、

22、溫度、濃度、組織塊大小和硬度。n0.10.5%，常用0.25%npH= 8n5mm3胚胎類(lèi)軟組織， 0.25%胰蛋白酶，37，20-30min即可。n鈣、鎂離子及血清對(duì)胰蛋白酶有抑制作用。n分次消化nEDTA較胰蛋白酶緩和，從組織環(huán)境中吸取鈣、鎂離子，破壞組織的完整性。n0.02%，用不含鈣、鎂離子的BSS配置。n不能被血清中和，用洗滌、離心方法去除。n胰蛋白酶與EDTA聯(lián)合使用提高效果，1:1或1:2細(xì)胞計(jì)數(shù)n血細(xì)胞計(jì)數(shù)器：手工計(jì)數(shù)細(xì)胞nCoulter計(jì)數(shù)儀：人工計(jì)數(shù)細(xì)胞計(jì)數(shù)： 1、將血球計(jì)數(shù)板及蓋片擦拭干凈，并將蓋片蓋在計(jì)數(shù)板上。 2、將細(xì)胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿(mǎn)蓋片和計(jì)

23、 數(shù)板之間。 3、靜置3分鐘。 4、鏡下觀察，計(jì)算計(jì)數(shù)板四大格細(xì)胞總數(shù)，壓線細(xì)胞只計(jì)左側(cè)和 上方的。然后按下式計(jì)算： 細(xì)胞數(shù)/ml4大格細(xì)胞總數(shù)/ 410000 注意：鏡下偶見(jiàn)由兩個(gè)以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按單個(gè)細(xì)胞計(jì) 算，若細(xì)胞團(tuán)占10%以上，說(shuō)明分散不好，需重新制備細(xì)胞懸液。培養(yǎng)細(xì)胞活力測(cè)定n細(xì)胞活力測(cè)定是腫瘤體外研究中應(yīng)用最廣的技術(shù)手段之一。 n任何培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)生長(zhǎng)的細(xì)胞都由死細(xì)胞和活細(xì)胞組成，從形態(tài)上區(qū)別死、活細(xì)胞是困難的。n1 細(xì)胞克隆形成率實(shí)驗(yàn) 單個(gè)細(xì)胞在體外增殖6代以上，其后代所組成的細(xì)胞群體形成肉眼可見(jiàn)的克隆?？寺⌒纬勺溆脕?lái)表示細(xì)胞的增殖能力 n 克隆形成率比克隆形成數(shù)接種細(xì)胞數(shù)n

24、缺點(diǎn)：操作繁瑣n優(yōu)點(diǎn)：精確、可靠臺(tái)盼藍(lán)法n活細(xì)胞不被染色，死細(xì)胞染成藍(lán)色，用活細(xì)胞占n細(xì)胞中的百分比表示細(xì)胞活力 。四唑鹽（MTT）比色法n四唑鹽（MTT）商品名為噻唑藍(lán)n 四唑鹽比色法的原理：活細(xì)胞中脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶干水的藍(lán)紫色產(chǎn)物（formazan)，并沉淀在細(xì)胞中，而死細(xì)胞沒(méi)有這種功能。二甲亞砜（DMSO）能溶解沉積在細(xì)胞中藍(lán)紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與所含的formazan量成正比。再用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值n MTT法簡(jiǎn)單快速、準(zhǔn)確，廣泛應(yīng)用于新藥篩選、細(xì)胞毒牲試 驗(yàn)、腫瘤放射敏感性實(shí)驗(yàn)等。n操作步驟n （1）單細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板；103-104細(xì)胞/孔，每孔培養(yǎng)基總量20

25、0微升（96孔培養(yǎng)板每孔容積370微升），37、5nCO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時(shí)間（根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康臎Q定培養(yǎng)時(shí)間）n （2）加入2毫克毫升的MTT液（50微升孔）；繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)。n （3）吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液后，加入DMSO液（150微升孔），將培養(yǎng)板置于微孔板扳蕩器上振蕩10分鐘，使結(jié)晶物溶解。n （4）酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔OD值（檢測(cè)波長(zhǎng)為570 nm）。記錄結(jié)果，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線其他染色方法n未固定凋亡細(xì)胞染色：AO/EB雙染色法：n致密濃染黃綠色：早期凋亡細(xì)胞，n致密濃染鮮紅色：晚期凋亡細(xì)胞，n鮮紅色膨大狀：壞死細(xì)胞n凋亡細(xì)胞固定后染色觀察：nMGG染色法：玻片晾干后用MGG染液染色20 min，光鏡觀

26、察nHoechst3325染色法nHE染色法其他：nAnnexin V /PI雙染法：正?；罴?xì)胞Annexin V 、PI均低染；凋亡細(xì)胞Annexin V高染、PI低染；壞死細(xì)胞Annexin V/PI均高染nTUNEL染色：檢測(cè)細(xì)胞凋亡nCFSE染色：檢測(cè)細(xì)胞增殖AO/EB雙染色原理：AO能夠透過(guò)細(xì)胞膜，把細(xì)胞核內(nèi)的DNA染成綠色，細(xì)胞漿內(nèi)的RNA 呈桔紅色。早期凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜尚完整，細(xì)胞漿發(fā)生固縮，細(xì)胞核固縮或碎裂，因此呈致密濃染的黃綠色，有的還可見(jiàn)碎塊狀。晚期凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜通透 性增加，EB能夠通過(guò)，使其呈鮮紅色固縮體或碎塊。壞死細(xì)胞不僅細(xì)胞膜不完 整，而且線粒體腫脹，為鮮紅色的膨

27、大細(xì)胞。方法：25 Ld離壁漂浮的細(xì)胞懸液與2 l AO染液(100 g/ml)和2 l EB染液(100 g/ml)混合后滴片，立即用熒光顯微鏡觀察。n結(jié)果：大部分細(xì)胞主要呈致密濃染的黃綠色染色或黃綠色碎片(早期凋亡細(xì)胞)；部分細(xì)胞呈致密濃染的鮮紅色染色或鮮紅色碎片(晚期凋亡細(xì)胞)；少部分為鮮紅色的膨大細(xì)胞。而在正常對(duì)照細(xì)胞主要呈細(xì)胞核綠色淡染，細(xì)胞漿桔黃或桔紅色。壞死對(duì)照大部分為鮮紅色的膨大細(xì)胞。MGG染色nMGG由May-Grunwald染料和Giemsa染料組成。前者化學(xué)名為曙紅亞甲基藍(lán)，對(duì)胞質(zhì)著色較好；后者對(duì)胞核著色較好。因此MGG染色，可兼兩者的優(yōu) 點(diǎn)，常用于細(xì)胞涂片染色。n正常細(xì)

28、胞呈細(xì)胞漿淡藍(lán)色，細(xì)胞核粉紅色著色。實(shí)驗(yàn)組的大部分細(xì)胞固縮變圓，整個(gè)細(xì)胞呈深藍(lán)色。壞死對(duì)照為外形不規(guī)則的淡藍(lán)色膨大細(xì)胞。TUNEL 技術(shù)nTUNEL 是末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT）介導(dǎo)的dUTP 原位切口末端標(biāo)記（terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling TUNEL） 技術(shù)，是原位檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況的一種基本方法。細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，染色體DNA 會(huì)發(fā)生斷裂，DNA雙鏈斷裂或只要一條鏈上出現(xiàn)缺口而產(chǎn)生的一系列DNA的3- OH

29、末端可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和 熒光素、過(guò)氧化物酶、堿性磷酸化酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記到DNA的3-末 端，從而可進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測(cè)。細(xì)胞凍存和復(fù)蘇n細(xì)胞低溫冷凍貯存是細(xì)胞室的常規(guī)工作。細(xì)胞凍存與細(xì)胞傳代保存相比可以減少入力、經(jīng)費(fèi)，減少污染，減少細(xì)胞生物學(xué)特性變化。凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融n當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細(xì)胞器脫水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。n如果緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反結(jié)晶就大，大結(jié)晶會(huì)造成細(xì)胞膜、綱胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過(guò)程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)

30、晶。慢凍程序n標(biāo)準(zhǔn)程序： 當(dāng)溫度在-25 以上時(shí)， 12 /min 當(dāng)溫度達(dá)-25 以下時(shí)， 510 /min 當(dāng)溫度達(dá)-100時(shí)，可迅速放入液氮中 細(xì)胞凍存器n簡(jiǎn)易程序：n 將冷凍管（管口要朝上）放入紗布袋內(nèi)，紗布袋系以線繩，通過(guò)線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，按每分鐘溫度下降12 的速度，在40分鐘內(nèi)降至液氮表面，停30分鐘后，直接投人液氮中。低溫保護(hù)劑的應(yīng)用n在細(xì)胞凍存時(shí)加入溫保護(hù)劑，能大大提高凍存效果。n常用的低溫保護(hù)劑是DMSO，它是一種滲透性保護(hù)劑，可迅速透入細(xì)胞，提高胞膜對(duì)水的通透性，降低冰點(diǎn)，延緩凍結(jié)過(guò)程，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷。細(xì)胞凍存方法n1.預(yù)先配制凍存液： 含20%血清培養(yǎng)基 10% DMSO n2. 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，加入適量?jī)龃嬉? 用吸管吹打制成細(xì)胞懸液（1106 5 106細(xì)胞/ml)n3 .加入1ml細(xì)胞于凍存管中，密封后標(biāo)記冷凍細(xì)胞