組織培養(yǎng)解答

1、離體無性繁殖的五個階段一、培養(yǎng)物的建立二、誘導(dǎo)外植體的生長與分化三、促進(jìn)中間繁殖體的增殖四、壯苗與生根五、馴化煉苗外植體的選擇與滅菌外植體的接種外植體的接種外植體的培養(yǎng)外植體的培養(yǎng)1.頂芽和腋芽的發(fā)育：指從頂芽或腋芽中萌發(fā)的單苗或多個苗。采用外源的細(xì)胞分裂素，促使具有頂芽或沒有頂芽的休眠側(cè)芽啟動生長，形成一個微型的多枝多芽的小灌木叢狀的結(jié)構(gòu)。在幾個月內(nèi)，可以將這種叢生苗的一個枝條轉(zhuǎn)接繼代，重復(fù)芽苗增殖的培養(yǎng)，從而迅速獲得無數(shù)的嫩莖。 2.1外植體的脫分化（去）脫分化（dedifferentiation）在組織培養(yǎng)中，受傷的植物樹料周圍細(xì)胞又可旺盛地進(jìn)行分裂，產(chǎn)生Callus。這種原已分化，并有

2、一定功能的這種原已分化，并有一定功能的體細(xì)胞（性體細(xì)胞（性Cell）喪失了原有的形態(tài)和機(jī)能，）喪失了原有的形態(tài)和機(jī)能，又回復(fù)到?jīng)]有分化能力的無組織的狀態(tài)。這個又回復(fù)到?jīng)]有分化能力的無組織的狀態(tài)。這個過程就是組織培養(yǎng)的去（脫）發(fā)化過程。過程就是組織培養(yǎng)的去（脫）發(fā)化過程。一經(jīng)去分化該材料又具有了分化的全能性能力。再分化的方式：1.體細(xì)胞胚 2.莖、芽，形成植株二者區(qū)別二者區(qū)別胚狀體能形成植株，而不定芽也能形成植株，二者有什么區(qū)別胚狀體能形成植株，而不定芽也能形成植株，二者有什么區(qū)別呢？呢？起源起源 胚狀體：形成的初級階段，多來自單個胚狀體：形成的初級階段，多來自單個Cell，很早就具有明顯，很早

3、就具有明顯的根端與菌端的兩極性結(jié)構(gòu)，不需誘導(dǎo)生根直接形成植株。的根端與菌端的兩極性結(jié)構(gòu)，不需誘導(dǎo)生根直接形成植株。不定芽：最初是由分生細(xì)胞團(tuán)形成單極性的生長點，發(fā)育為芽，不定芽：最初是由分生細(xì)胞團(tuán)形成單極性的生長點，發(fā)育為芽，再轉(zhuǎn)移至生根介質(zhì)中，誘導(dǎo)形成根，然后才能形成完整的植再轉(zhuǎn)移至生根介質(zhì)中，誘導(dǎo)形成根，然后才能形成完整的植株。株。與周圍與周圍Cell的聯(lián)系不同的聯(lián)系不同胚：由胚狀體發(fā)育成的小植株與周圍胚：由胚狀體發(fā)育成的小植株與周圍Callus母體組織塊幾乎沒母體組織塊幾乎沒什么結(jié)構(gòu)性聯(lián)系；小植株是獨立的，易于分離。什么結(jié)構(gòu)性聯(lián)系；小植株是獨立的，易于分離。不定芽：不定芽與母體組織和不定

4、芽：不定芽與母體組織和Callus之間有著較緊密的聯(lián)接，之間有著較緊密的聯(lián)接，包括一些維管束組織，皮層，無表皮組織等，因而不易分離。包括一些維管束組織，皮層，無表皮組織等，因而不易分離。胚狀體（embryoid）的分化，也叫體細(xì)胞胚（somatic embryo）。以胡蘿卜（cowed）為試材（模式植物）。 1）概念及例子2) 體胚的發(fā)生方式64頁3）影響體胚發(fā)生的因子65頁4）體胚的實際應(yīng)用74頁l人工種子就是將組織培養(yǎng)產(chǎn)生的體細(xì)胞胚包裹在能提供養(yǎng)分的膠囊里，再在膠囊外包上一層具有保護(hù)功能和防止機(jī)械損傷的外膜，在適宜的條件下能發(fā)芽出苗的一種類似于種子的結(jié)構(gòu)。l 在蘭科或部分球根植物培養(yǎng)中應(yīng)用

5、較多。原球莖最初是蘭花種子發(fā)芽過程中的一種形態(tài)學(xué)構(gòu)造，種子萌發(fā)初期并不出現(xiàn)胚根，只是胚逐漸膨大，以后種皮的一端破裂，脹大的胚呈小圓錐狀，稱做原球莖。常從莖尖、種子或側(cè)芽的培養(yǎng)中產(chǎn)生一些原球莖，原球莖本身可以增殖，也可萌發(fā)成小植株。 三、促進(jìn)中間繁殖體的增殖三、促進(jìn)中間繁殖體的增殖l2.3.1 中間繁殖體的增殖方式中間繁殖體的增殖方式l不同的植物種類，其生長分化的形態(tài)及特點不同，中間繁殖體的增殖方不同的植物種類，其生長分化的形態(tài)及特點不同，中間繁殖體的增殖方式也有所區(qū)別。概括起來主要有如下幾種。式也有所區(qū)別。概括起來主要有如下幾種。l1）多節(jié)莖段方式）多節(jié)莖段方式 單軸莖段方式與植物的單軸莖段方

6、式與植物的扦插方式扦插方式相同，只是前者在無菌條件下，后者相同，只是前者在無菌條件下，后者在自然條下；前者的基質(zhì)是培養(yǎng)基，后者的基質(zhì)是土壤或其他各種無土在自然條下；前者的基質(zhì)是培養(yǎng)基，后者的基質(zhì)是土壤或其他各種無土栽培基質(zhì)。但其基本原理是一致的。栽培基質(zhì)。但其基本原理是一致的。l方法方法: 將外植體剪成帶將外植體剪成帶l2枚葉片的單芽或多芽莖段，接種到伸長生長的枚葉片的單芽或多芽莖段，接種到伸長生長的培養(yǎng)基上。一個周期后腋芽萌發(fā)形成具有培養(yǎng)基上。一個周期后腋芽萌發(fā)形成具有56節(jié)的嫩枝，如此多次繼代。節(jié)的嫩枝，如此多次繼代。l2）叢生芽方式）叢生芽方式l培養(yǎng)基：為了促進(jìn)叢生芽的形成，細(xì)胞分裂素與

7、生長素的比值應(yīng)該較大。培養(yǎng)基：為了促進(jìn)叢生芽的形成，細(xì)胞分裂素與生長素的比值應(yīng)該較大。 但是細(xì)胞分裂素的濃度不宜過高，否則多次繼代后會造成外源激素在體但是細(xì)胞分裂素的濃度不宜過高，否則多次繼代后會造成外源激素在體內(nèi)的積累，而抑制內(nèi)源激素的作用，使植物生長封頂，莖細(xì)弱，葉片細(xì)小內(nèi)的積累，而抑制內(nèi)源激素的作用，使植物生長封頂，莖細(xì)弱，葉片細(xì)小卷曲，形成類似蓮座狀的結(jié)構(gòu)。所以，在進(jìn)行培養(yǎng)時，要注意激素的搭配卷曲，形成類似蓮座狀的結(jié)構(gòu)。所以，在進(jìn)行培養(yǎng)時，要注意激素的搭配比例，或與其它種類的細(xì)胞分裂素進(jìn)行一定輪次的交替使用，增加生產(chǎn)的比例，或與其它種類的細(xì)胞分裂素進(jìn)行一定輪次的交替使用，增加生產(chǎn)的穩(wěn)定

8、性，降低無效苗消耗。穩(wěn)定性，降低無效苗消耗。 但增殖過程中要盡量避免基部愈傷組織上形成的不定芽，尤其不能將不但增殖過程中要盡量避免基部愈傷組織上形成的不定芽，尤其不能將不定芽用于中間繁殖體的繼代增殖，以增加生產(chǎn)的穩(wěn)定性。定芽用于中間繁殖體的繼代增殖，以增加生產(chǎn)的穩(wěn)定性。 不同植物種類，甚至不同品種，叢生芽的增殖能力差異比較大，進(jìn)行大不同植物種類，甚至不同品種，叢生芽的增殖能力差異比較大，進(jìn)行大規(guī)模的商業(yè)化生產(chǎn)時，應(yīng)注意及時調(diào)整培養(yǎng)基，減少各種無效消耗。這種規(guī)模的商業(yè)化生產(chǎn)時，應(yīng)注意及時調(diào)整培養(yǎng)基，減少各種無效消耗。這種繁殖方式是目前生產(chǎn)中應(yīng)用最普遍的類型。繁殖方式是目前生產(chǎn)中應(yīng)用最普遍的類型。

9、l應(yīng)用：這種方式與短枝扦插型類似，遺傳性狀穩(wěn)定，而且成苗速度快，繁應(yīng)用：這種方式與短枝扦插型類似，遺傳性狀穩(wěn)定，而且成苗速度快，繁殖量大，適合于大規(guī)模的商業(yè)化生產(chǎn)，適合叢生型植物種類，如非洲菊、殖量大，適合于大規(guī)模的商業(yè)化生產(chǎn)，適合叢生型植物種類，如非洲菊、菊花、玉簪、萱草等。菊花、玉簪、萱草等。l3）不定芽再生方式）不定芽再生方式l方法：從離體培養(yǎng)的葉片、莖段方法：從離體培養(yǎng)的葉片、莖段(不帶腋芽不帶腋芽)直接再生不直接再生不定芽或在脫分化所形成的大量愈傷組織塊上再分化出定芽或在脫分化所形成的大量愈傷組織塊上再分化出大量小不定芽，將不定芽轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基，同時將能大量小不定芽，將不定芽轉(zhuǎn)入生根

10、培養(yǎng)基，同時將能再生不定芽的器官或愈傷組織塊再繼代培養(yǎng)，如此反再生不定芽的器官或愈傷組織塊再繼代培養(yǎng)，如此反復(fù)可達(dá)到快速、大量繁殖的目的。復(fù)可達(dá)到快速、大量繁殖的目的。l應(yīng)用應(yīng)用1：但是通過這種方式再生的植株在遺傳：但是通過這種方式再生的植株在遺傳上的穩(wěn)定性較差（分化部分已詳述），而且隨上的穩(wěn)定性較差（分化部分已詳述），而且隨著繼代次數(shù)的增加，愈傷組織再生植株的能力著繼代次數(shù)的增加，愈傷組織再生植株的能力會下降，甚至完全消失。會下降，甚至完全消失。l應(yīng)用應(yīng)用2： 因此這種增殖方式在植物組織培養(yǎng)中因此這種增殖方式在植物組織培養(yǎng)中應(yīng)用不多，只見于一些特殊的種類或特殊的用應(yīng)用不多，只見于一些特殊的種

11、類或特殊的用途，如秋海棠葉片培養(yǎng)、轉(zhuǎn)基因月季葉圓片培途，如秋海棠葉片培養(yǎng)、轉(zhuǎn)基因月季葉圓片培養(yǎng)等。養(yǎng)等。l4）原球莖途徑）原球莖途徑l原球莖途徑是蘭科和其他球根植物特有的一種再生方式。原球莖途徑是蘭科和其他球根植物特有的一種再生方式。l方法：在蘭花組織培養(yǎng)中，常從莖尖或側(cè)芽的培養(yǎng)中產(chǎn)生一些原球莖，方法：在蘭花組織培養(yǎng)中，常從莖尖或側(cè)芽的培養(yǎng)中產(chǎn)生一些原球莖，原球莖本身可以萌發(fā)成小植株，也可作為中間繁殖體進(jìn)行增殖。原球莖本身可以萌發(fā)成小植株，也可作為中間繁殖體進(jìn)行增殖。 原球莖的增殖速度非?？?，無性增殖應(yīng)在轉(zhuǎn)綠前將原球莖切割成原球莖的增殖速度非?？?，無性增殖應(yīng)在轉(zhuǎn)綠前將原球莖切割成小塊，也可以給

12、予針刺等損傷，或在液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，來加快小塊，也可以給予針刺等損傷，或在液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，來加快其增殖進(jìn)程。其增殖進(jìn)程。 原球莖經(jīng)過一段時間培養(yǎng)后逐漸轉(zhuǎn)綠，并長出毛狀假根，葉原基原球莖經(jīng)過一段時間培養(yǎng)后逐漸轉(zhuǎn)綠，并長出毛狀假根，葉原基發(fā)育成幼葉。待苗長到一定高度時可以轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)，形成完整的植發(fā)育成幼葉。待苗長到一定高度時可以轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)，形成完整的植株。株。 應(yīng)用：目前，這種增殖方式是蘭科和部分球根植物組培生產(chǎn)中使用的方應(yīng)用：目前，這種增殖方式是蘭科和部分球根植物組培生產(chǎn)中使用的方式。式。l5）胚狀體途徑）胚狀體途徑l通過體細(xì)胞胚的發(fā)生來進(jìn)行無性系的大通過體細(xì)胞胚的發(fā)生來進(jìn)行無性系

13、的大量繁殖具有極大的潛力，其特點是成苗量繁殖具有極大的潛力，其特點是成苗數(shù)量多、速度快、結(jié)構(gòu)完整。在生產(chǎn)中數(shù)量多、速度快、結(jié)構(gòu)完整。在生產(chǎn)中應(yīng)用此方式作為中間繁殖體進(jìn)行增殖的應(yīng)用此方式作為中間繁殖體進(jìn)行增殖的很少。很少。l1）無機(jī)養(yǎng)分l2） 有機(jī)養(yǎng)分l (1) 維生素及肌醇 l (2)腺瞟呤l (3)糖l3）植物生長調(diào)節(jié)劑l4）繼代周期和繼代次數(shù)l5）其它條件 l（1）光照 l（2）溫度 l當(dāng)繼代繁殖一定數(shù)量后，培養(yǎng)室的容量就會飽和，必須分流進(jìn)入當(dāng)繼代繁殖一定數(shù)量后，培養(yǎng)室的容量就會飽和，必須分流進(jìn)入壯苗、生根培養(yǎng)階段。因此，在生產(chǎn)中，繼代的次數(shù)與繁殖的數(shù)壯苗、生根培養(yǎng)階段。因此，在生產(chǎn)中，繼

14、代的次數(shù)與繁殖的數(shù)量要計劃準(zhǔn)確，即繁殖了一定的數(shù)量又不超過繼代限度，達(dá)到工量要計劃準(zhǔn)確，即繁殖了一定的數(shù)量又不超過繼代限度，達(dá)到工廠化育苗規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)的最佳效益。廠化育苗規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)的最佳效益。l4.1瓶內(nèi)生根壯苗瓶內(nèi)生根壯苗1.降低無機(jī)鹽濃度：培養(yǎng)基內(nèi)礦物元素濃度高時有利于發(fā)生降低無機(jī)鹽濃度：培養(yǎng)基內(nèi)礦物元素濃度高時有利于發(fā)生莖葉，較低時有利于生根，所以生根培養(yǎng)基多采用莖葉，較低時有利于生根，所以生根培養(yǎng)基多采用1/2基本培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基或或1/3、 1/4大量元素培養(yǎng)基。大量元素培養(yǎng)基。 2.生長素有利于誘導(dǎo)生根：生長素有利于誘導(dǎo)生根：IAA、IBA、NAA等。當(dāng)小植株等。當(dāng)小植株生出生出3-5條

15、水平根，每條根長條水平根，每條根長2-3cm時，為最適宜的出瓶煉苗階段。時，為最適宜的出瓶煉苗階段。 3.增加光照強(qiáng)度，提高組培苗的自養(yǎng)能力，加強(qiáng)光合作用。增加光照強(qiáng)度，提高組培苗的自養(yǎng)能力，加強(qiáng)光合作用。 4.降低糖的濃度，減少糖的供應(yīng)，促其自養(yǎng)，加強(qiáng)光合作用。降低糖的濃度，減少糖的供應(yīng)，促其自養(yǎng)，加強(qiáng)光合作用。 l4.2 瓶外生根l 在有些植物中，把在離體條件下形成的紙條當(dāng)做微型插條處理，把使其在適當(dāng)?shù)幕|(zhì)中生根。l 把插條的基部切口先用促進(jìn)生根的物質(zhì)（生長素、生根粉）處理，在將其扦插在適當(dāng)?shù)幕|(zhì)中。l4.3無根苗的嫁接l 當(dāng)瓶內(nèi)誘導(dǎo)生根困難或市場拒絕自根苗時，嫁接就是非常好的方法。l 1

16、.瓶內(nèi)嫁接，也叫微型嫁接：l 接穗：0.1-0.2mm長的莖尖。l 砧木：瓶內(nèi)帶根的無菌苗。l 2.瓶外嫁接，應(yīng)用在無籽西瓜，瓠子為砧木，三倍體無籽西瓜為接穗。l要選擇恰當(dāng)?shù)姆N植介質(zhì)，以利植物疏松、透水、通氣，同時具有適宜的保水性、容易滅菌處理，不利于雜菌滋生等也是選擇介質(zhì)的重要條件。l一般來說，無土栽培所用的基質(zhì)均可用于試管苗的移栽，常用粗粒狀蛭石(過細(xì)的蛭石粉并不適宜)、珍珠巖、粗沙、爐灰渣、谷殼(或谷炭殼)、鋸木屑、腐殖土、泥炭土、水草等。或者根據(jù)植物種類的特性，將它們以一定的比例混合應(yīng)用，應(yīng)用最多的例子是取蛭石和泥炭土按1：1比例混合。l試管苗生長的環(huán)境是無菌的，為了防止微生物的侵染，

17、要在移栽前對基質(zhì)進(jìn)行消毒。一般用5%的高錳酸鉀水溶液消毒，也可用其他殺菌劑或高溫處理。l管理過程中不要澆水過多，過多的水應(yīng)迅速瀝除，以利根系的呼吸，有助于生根成活。這些介質(zhì)中，尤其是有機(jī)基質(zhì)一般不要重復(fù)使用，如重復(fù)使用，在使用前應(yīng)用清水浸泡，洗去其中的鹽份和其他有害物質(zhì)，并進(jìn)行暴曬或高壓滅菌。1)適量的潔凈度適量的潔凈度 試管苗原來的環(huán)境是無菌的，出瓶種植環(huán)境難以保持完試管苗原來的環(huán)境是無菌的，出瓶種植環(huán)境難以保持完全無菌，但應(yīng)盡量減少雜茵大量滋生，才能保證試管苗過渡成活。除全無菌，但應(yīng)盡量減少雜茵大量滋生，才能保證試管苗過渡成活。除栽培基質(zhì)要預(yù)先滅菌外，進(jìn)行噴霧或澆水時，適當(dāng)使用一定濃度的殺

18、栽培基質(zhì)要預(yù)先滅菌外，進(jìn)行噴霧或澆水時，適當(dāng)使用一定濃度的殺菌劑可以有效地保護(hù)幼苗，預(yù)防病蟲害發(fā)生，如百茵清、多菌靈、甲菌劑可以有效地保護(hù)幼苗，預(yù)防病蟲害發(fā)生，如百茵清、多菌靈、甲基托布津等藥劑?；胁冀虻人巹?。l2）適宜的濕度）適宜的濕度 在試管或培養(yǎng)瓶中的小苗，因濕度大，莖葉表面防止在試管或培養(yǎng)瓶中的小苗，因濕度大，莖葉表面防止水分散失的角質(zhì)層等幾乎全無，根系也不發(fā)達(dá)或無根，出瓶種植后很水分散失的角質(zhì)層等幾乎全無，根系也不發(fā)達(dá)或無根，出瓶種植后很難保持水分平衡，即使根的周圍有足夠的水分也不行。所以，只有提難保持水分平衡，即使根的周圍有足夠的水分也不行。所以，只有提高周圍的空氣濕度高周圍的空

19、氣濕度(達(dá)達(dá)90%100%)，使葉面的蒸騰減少，盡量接近試管，使葉面的蒸騰減少，盡量接近試管或培養(yǎng)瓶培養(yǎng)中的條件，使小苗始終保持挺拔的姿態(tài)。尤其在移栽最或培養(yǎng)瓶培養(yǎng)中的條件，使小苗始終保持挺拔的姿態(tài)。尤其在移栽最初的初的10天內(nèi)，保持周圍空氣的高濕度天內(nèi)，保持周圍空氣的高濕度(達(dá)達(dá)90%100%)比基質(zhì)中的水分更比基質(zhì)中的水分更重要。隨著小苗逐漸成活，降低空氣濕度，并保持基質(zhì)中適宜的持水重要。隨著小苗逐漸成活，降低空氣濕度，并保持基質(zhì)中適宜的持水量。若不及時移栽，要定期施以稀薄的營養(yǎng)液，供小苗生長所需。量。若不及時移栽，要定期施以稀薄的營養(yǎng)液，供小苗生長所需。l3）適宜的光照度）適宜的光照度

20、試管苗原來是有糖等營養(yǎng)供應(yīng)的，出瓶后要靠自己試管苗原來是有糖等營養(yǎng)供應(yīng)的，出瓶后要靠自己進(jìn)行光合作用維持生存，而葉片的光合功能尚不健全，光照不能太強(qiáng)，進(jìn)行光合作用維持生存，而葉片的光合功能尚不健全，光照不能太強(qiáng)，以漫射光為好，最好能夠調(diào)節(jié)，隨苗的壯弱、喜光或喜陰、種植成活以漫射光為好，最好能夠調(diào)節(jié)，隨苗的壯弱、喜光或喜陰、種植成活的程度而定。約在的程度而定。約在150040001x甚至達(dá)甚至達(dá)10,0001x之間。光線過強(qiáng)會使葉之間。光線過強(qiáng)會使葉綠素受到破壞，引起葉片失綠、發(fā)黃或發(fā)白，使小苗成活延緩。過強(qiáng)綠素受到破壞，引起葉片失綠、發(fā)黃或發(fā)白，使小苗成活延緩。過強(qiáng)的光線還能刺激蒸騰作用加強(qiáng)，使水分平衡的矛盾更加尖銳，使小苗的光線還能刺激蒸騰作用加強(qiáng)，使水分平衡的矛盾更加尖銳，使小苗有灼燒傷害，引起大量死苗。有灼燒傷害，引起大量死苗。l4）適宜的溫度）適宜的溫度 7.胚乳培養(yǎng)