第五章固定化酶

1、第五章第五章 固定化酶與固定化細胞固定化酶與固定化細胞第一節(jié)第一節(jié) 酶的固定化酶的固定化 一、固定化酶一、固定化酶（immobilized enzyme）：是指在一定空間內(nèi)呈閉鎖狀態(tài)閉鎖狀態(tài)存在的酶，能連續(xù)進行反應，反應后的酶可以回收重復使用。 優(yōu)點： 極易將固定化酶與底物、產(chǎn)物分開，簡化了提純工藝，提高酶的使用效率； 在大多數(shù)情況下，能夠提高酶的穩(wěn)定； 可以在較長時間內(nèi)進行反復分批反應 和裝柱連續(xù)反應； 酶反應過程能夠加以嚴格控制； 較游離酶更適合于多酶反應。泵泵儲罐反應產(chǎn)物離心機離心機消消旋旋反反應應器器固定化酶柱子晶體 L-AlaL-Ala A-D-AlaA-L-Ala A-D-Ala

2、1物理吸附法 酶被物理吸附于不溶性載體的一種固定化方法。 常用載體：活性碳、氧化鋁、硅膠、淀粉、纖維素、樹脂。 優(yōu)點：操作簡單，酶活性中心不易被破壞和酶高級結(jié)構(gòu)變化少，酶活力損失很少。 缺點：酶與載體相互作用力弱、酶易脫落等。二二 、固定化方、固定化方法法2離子結(jié)合法離子結(jié)合法 酶通過離子鍵離子鍵結(jié)合于具有離子交換劑的水不溶性載體的固定化方法。 常用載體：各種陰、陽離子交換劑。 如如CM-CM-纖纖維素、維素、DEAE-DEAE-纖維素、纖維素、DEAE-DEAE-葡聚糖凝膠等葡聚糖凝膠等 優(yōu)點：操作簡單，酶活性中心不易被破壞和酶高級結(jié)構(gòu)變化少，酶活力損失很少。 缺點：載體和酶的結(jié)合力 比較弱

3、，酶易脫落。3.共價結(jié)合法共價結(jié)合法 酶與載體以共價鍵結(jié)合的固定化方法。 將載體有關基團活化，然后與酶有關基團發(fā)生偶聯(lián)反應。 在載體上接上一個雙功能試劑（常用的如戊二醛），然后將酶偶聯(lián)上去。 優(yōu)點：酶與載體結(jié)合牢固，不易輕易脫落。 缺點：反應條件苛刻，操作復雜，易引起酶蛋白高級結(jié)構(gòu)變化，破壞部分活性中心。常用載體： 多糖、多孔玻璃、聚酯、聚胺、尼龍等 酶的功能團有：氨基或、羧基、巰基、羥基、咪唑基、酚基等。常用的活化方法：常用的活化方法：1）重氮化法：載體：含有芳香族氨基。酶的反應基團：游離氨基、咪唑基、酚基等。2）溴化氰法： 載體：含羥基，即多糖類物質(zhì)。 酶的反應基團：氨基3 3）疊）疊氮法

4、氮法 對含有羧基的載體，與肼作用生成含有酰肼的載體，再與亞硝酸活化，生成疊氮化合物。最后于酶偶聯(lián) 。4交聯(lián)法交聯(lián)法 用雙功能或多功能試劑使酶與酶之間交聯(lián)的固定化方法。 不使用載體 常用的交聯(lián)劑：戊二醛、異氰酸酯、雙重氮聯(lián)苯胺等。 酶的反應基團：N末端的-氨基或賴氨酸-氨基、酚基、 巰基和咪唑基等。優(yōu)點：結(jié)合牢固，可以長時間使用缺點：因交聯(lián)反應激烈，酶分子多個基團被交聯(lián)，酶活損失大，顆粒較小，機械強度差，使用不便。5.包埋法包埋法 酶分子包埋在高分子凝膠或高分子半透膜中。 載體：聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、淀粉、明膠、膠原、海藻酸和卡拉膠等高分子化合物網(wǎng)格型網(wǎng)格型 微囊型微囊型 聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺：

5、 丙烯酰胺單體、交聯(lián)劑和懸浮在緩沖溶液中的酶混合，然后加入聚合催化系統(tǒng)使之開始聚合，結(jié)果就在酶分子周圍形成交聯(lián)的高聚物網(wǎng)絡。海藻酸鈉：海藻酸鈉： 可被多價離子Ca2+、Al3+凝膠化 。卡拉膠：卡拉膠： 冷卻成膠或與二、三價金屬離子成膠。 優(yōu)點：很少改變酶的局級結(jié)構(gòu)，酶活回收率較高。 缺點：有時酶也易失活，只適合作用于小分子底物和產(chǎn)物的酶。 三、固定化酶的性質(zhì)三、固定化酶的性質(zhì) (一一)固定化后酶活力的變化固定化后酶活力的變化 固定化酶的活力在多數(shù)情況下比天然酶小。原因： 酶分子在固定化過程中，空間構(gòu)象會有所變化，甚至影響了活性中心的氨基酸； 固定化后，空間位阻會直接影響到活性中心對底物的定位

6、作用； 擴散阻力使底物分子與酶的接近受阻；(二二)固定化對酶穩(wěn)定性的影響固定化對酶穩(wěn)定性的影響1固定化酶表現(xiàn)在熱穩(wěn)定性提高；2對各種有機試劑及酶抑制劑的穩(wěn)定性提高。3對不同pH穩(wěn)定性、對蛋白酶穩(wěn)定性、貯存穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性都有提高。 青霉素?；赣诓煌瑴囟认卤厍嗝顾仵；赣诓煌瑴囟认卤?小時小時 穩(wěn)定性提高的原因：穩(wěn)定性提高的原因： 固定化后酶分子與載體多點連接，可防止酶分子伸展變形。 酶活力的緩慢釋放。 抑制蛋白酶的降解, 阻擋了外界不利因素對酶的侵襲.（三）固定化酶的最適溫度變化（三）固定化酶的最適溫度變化最適溫度提高。（四）固定化酶的最適（四）固定化酶的最適pH變化變化對底物作用的最

7、適pH和酶活力-pH曲線常常發(fā)生偏移。原因：微環(huán)境表面電荷性質(zhì)的影響。 帶負電荷載體：最適pH較游離酶偏高，即向堿性偏移。 帶正電荷的載體：最適pH向酸性偏移。(五五)固定化酶的米氏常數(shù)固定化酶的米氏常數(shù)(Km)變化變化 中性載體：固定化酶的表觀Km值上升。 載體與底物電荷相同：表觀Km值顯著上升； 載體與底物電荷相反：Km ？四、影響固定化酶性能的因素四、影響固定化酶性能的因素1構(gòu)象改變、立體屏蔽構(gòu)象改變、立體屏蔽 構(gòu)象改變：指固定化過程及酶和載體的相互作用，引起了酶的活性中心構(gòu)象發(fā)生改變，從而導致酶活性改變的種效應。 立體屏蔽立體屏蔽：指由于載體的孔徑太小，或是由于固定化的方式與位置不當，

8、給酶的活性中心或/和調(diào)節(jié)中心造成了空間障礙，底物與效應物等無法直接和酶接觸，從而影響酶活性的一種效應。 2分配效應和擴散限制效應分配效應和擴散限制效應 分配效應：是由于固定化載體所帶電荷及的親、疏水性、使酶的底物、產(chǎn)物以及其他效應物在微觀環(huán)境與宏觀體系間發(fā)生了不等分配，改變了酶反應系統(tǒng)的組成平衡，從而影響酶反應速度的一種因素。 擴散限制效應擴散限制效應：指底物、產(chǎn)物以及其他效應物的遷移和運轉(zhuǎn)速度受到限制的一種效應。 外擴散限制：外擴散限制：指上述物質(zhì)從宏觀體系穿過包圍在固定化酶顆粒周圍的近乎停滯的液膜層(Nernst層)到顆粒表面所受的限制。 內(nèi)擴散限制：內(nèi)擴散限制：指上述物質(zhì)從顆粒表面到顆粒

9、內(nèi)部酶所在位點所受到的限制。第二節(jié)第二節(jié)評價固定化酶評價固定化酶(細胞細胞)的指標的指標 一、固定化酶(細胞)的活力 固定化酶(細胞)催化某一特定化學反應的能力。 活力單位：定義為每毫克干重固定化酶(細胞)每分鐘轉(zhuǎn)化底物(或生產(chǎn)產(chǎn)物)的量，表示為molmolminmin-1-1mgmg-1-1。 如是酶膜、酶管、酶板，則以單位面積的反應初速度來表示即molmin-1cm-2。二、偶聯(lián)率二、偶聯(lián)率：載體結(jié)合酶量（或酶活）的百分數(shù) %100-加入蛋白量溶液中殘留的蛋白量加入的蛋白量偶聯(lián)效率%100-加入總活力溶液中殘留活力加入總活力偶聯(lián)效率三、活力回收和相對活力三、活力回收和相對活力 活力回收：固

10、定化酶活力占溶液酶活力的百分數(shù)%100溶液酶活力固定化酶活力活力回收 相對活力：固定化酶活力與同量蛋白量的溶液酶活力的比值%100殘留酶活力溶液酶總活力固定化酶活力相對活力四、固定化酶（細胞）的半衰期四、固定化酶（細胞）的半衰期 t1/2 ：固定化酶（細胞）的活力下降為最初活力1/2所經(jīng)歷的連續(xù)工作時間；衡量操作穩(wěn)定性的指標。 Fig. 2. Kinetic of ROL adsorption on the silica aerogels. The activity was measured using olive oil emulsion as substrate at pH 8.5 and

11、 37 C.Immobilization of Rhizopus oryzae lipase on silica aerogels by adsorption: Comparison with the free enzymePore size of macroporous polystyrene microspheres affects lipase immobilizationFig. 4. Effect of pH on the (A) activity and (B) stability of the free and immobilized ROL. Enzymes activitie

12、s were assayed at 37 C using 10 ml olive oil emulsion as substrate.Enzymes were incubated 1 h at different pH for stability study.Immobilization of Rhizopus oryzae lipase on silica aerogels by adsorption: Comparison with the free enzyme第三節(jié)輔酶的固定化1.需輔酶的酶的固定化 直接將酶蛋白共價結(jié)合于載體，向反應系統(tǒng)補充輔酶。 將輔酶固定化，然后將酶蛋白親和吸附上

13、去； 將酶蛋白和輔酶共固定化； 輔酶直接偶聯(lián)于酶上制成酶輔酶絡合物， 2輔酶的固定化 載體結(jié)合法 輔酶分子本身具備不參與催化活性的的功能團； 引入適當?shù)墓δ軋F（羧基、氨基） 包埋法 需高分子化。磷酸吡哆醛的偶聯(lián)基團NAD(P)的偶聯(lián)基團3輔酶物質(zhì)的再生及偶聯(lián)酶系的固定化輔酶物質(zhì)的再生及偶聯(lián)酶系的固定化獨立進行形式 共組合形式圖55(A)是由蘋果酸脫氫酶(MDH)、乳酸脫氫酶(LDH)和檸檬酸縮和酶(CS)組成的NAD+NADH再生偶聯(lián)酶系統(tǒng)；圖55(B)是由乙酸激酶(AK)、谷胱甘肽合成酶(GSHS)組成的ADPATP再生偶聯(lián)酶系統(tǒng)。第四節(jié)細胞的固定化 固定化細胞保持了胞內(nèi)酶系的原始狀態(tài)和天然

14、環(huán)境，因而更穩(wěn)定； 省去酶的分離純化工作，減少酶的活性損失，固定化細胞的制備與使用都比固定化酶更簡便； 可以作為單一的酶發(fā)揮作用，也可利用它所包含的復合酶系完成一部分代謝乃至整個發(fā)酵過程，特別適合需要輔助因子參與的合成代謝過程； 1.優(yōu)點：優(yōu)點： 縮短了發(fā)酵生產(chǎn)周期,固定化細胞的密度大，；穩(wěn)定性好，可以較長時間反復使用或連續(xù)使用；發(fā)酵液中含菌體較少，有利于產(chǎn)品分離純化，提高產(chǎn)品質(zhì)量。 利用的僅是胞內(nèi)酶； 細胞內(nèi)多種酶的存在，會形成不需要的副產(chǎn)物； 細胞膜、細胞壁和載體都存在著擴散限制作用 2.局限性：局限性：3.固定化細胞的分類固定化細胞的分類 4固定化方法固定化方法直接固定化法(適用于微生物

15、細胞) 在沒有載體的情況下，借助物理或化學方法（加熱、冰凍、絮凝劑等）將細胞直接固定的方法。吸附法包埋法共價與交聯(lián)三、固定化對細胞性質(zhì)的影響三、固定化對細胞性質(zhì)的影響 1.固定化對微生物生長速率的影響 微生物經(jīng)過固定化后 ，其生長參數(shù)可能降低、可能增加、也可能不發(fā)生變化。a. 降低 ：傳質(zhì)限制引起的；微環(huán)境的變化 ,也可能導致微生物生長速率降低。b.增加 ：固定化載體對微生物提供的保護作用。免受高剪切力的作用 ，限制抑制性底物的局部濃度 2. 固定化對微生物活性的影響 激活代謝活性；提高微生物次級代謝產(chǎn)物 3.對酶活的影響 由于細胞內(nèi)環(huán)境的相對恒定和細胞的“緩沖作用”，固定化對細胞內(nèi)酶產(chǎn)生的影

16、響在某些方面不象固定化酶那樣明顯。第五節(jié)：固定化酶（細胞）的應用第五節(jié)：固定化酶（細胞）的應用（一）固定化酶在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應用（二）固定化酶在醫(yī)藥治療上的應用（二）固定化酶在醫(yī)藥治療上的應用（三）固定化酶在分析化學中的應用（三）固定化酶在分析化學中的應用 酶法分析：是以酶作為分析工具或分析試劑，用以測定樣品。 酶傳感器：將酶與電化學傳感器相連接來測定底物濃度的電極，也稱為酶電極。酶傳感器工作原理示意圖酶傳感器工作原理示意圖酶傳感器主要由固定化酶膜和變換器組成：酶傳感器主要由固定化酶膜和變換器組成：固定化酶膜：固定化酶膜：選擇性地選擇性地“識別識別”并催化被檢測物質(zhì)并催化被檢測物質(zhì)發(fā)生化學反應

17、；發(fā)生化學反應；變換器：變換器：把催化反應中底物或產(chǎn)物的變量轉(zhuǎn)換成電把催化反應中底物或產(chǎn)物的變量轉(zhuǎn)換成電信號，通過儀表顯示出來。信號，通過儀表顯示出來。 葡萄糖酶電極 酶電極示意圖D葡萄糖葡萄糖O2 D葡萄糖酸葡萄糖酸1，5內(nèi)酯內(nèi)酯H2O2半透膜酶膠層感應電極GlucoseGluconic acidGlucose oxidaseOxygenHydrogen peroxideMembraneElectrode 根據(jù)反應中消耗的根據(jù)反應中消耗的O O2 2、生成的葡萄糖酸和、生成的葡萄糖酸和H H2 2O O2 2的量，的量，可以用氧電極、可以用氧電極、pHpH電極和電極和H H2 2O O2 2

18、電極來測定葡萄糖的含量。電極來測定葡萄糖的含量。 手掌型葡萄糖手掌型葡萄糖(glucose)(glucose)分析儀分析儀酶傳感器應用實例 測定對象酶檢測用電極葡萄糖麥芽糖半乳糖尿素尿酸膽甾醇中性脂質(zhì)L-氨基酸L-精氨酸L-谷氨酸L-天（門）冬酰胺L-賴氨酸青霉素苦杏仁苷硝基化合物亞硝基化合物葡萄糖苷酶淀粉酶半乳糖酶脲酶尿酸酶膽甾醇氧化酶蛋白脂酶L-氨基酸酶精氨酸酶谷氨酸脫氫酶天（門）冬酰胺酶賴氨酸脫羧酶青霉素酶苦杏仁苷酶硝基還原酶-亞硝基還原酶亞硝基還原酶H2O2，O2，I-，pHPtPtNH3,CO2，pHO2H2O2，O2PHH2O2，O2，I-，NH3NH3CO2，,NH4+NH4+C

19、O2，,pHCN-NH4+NH3第六節(jié)第六節(jié) 固定化技術的改進固定化技術的改進 固定化酶的不足之處： 固定化時，酶活力有損失； 增加了生產(chǎn)的成本； 適用于小分子底物，對大分子底物不適宜； 一、傳統(tǒng)固定化技術的改善一、傳統(tǒng)固定化技術的改善 1采用光、輻射、聲等物理新技術來改善固定化條件的方法，以減少酶在固定化過程中活性的損失。 光敏樹脂包埋法：如光敏聚乙烯醇光照聚合，條件溫和、易控制交聯(lián)度、固定化時間短。 帶光敏性基團的載體共價固定法 等離子體引發(fā)丙烯酰胺聚合包埋固定化 超聲波固定化方法 低溫下60Co輻照冰凍態(tài)水溶性單體與酶的水溶液混合體時將使單體聚合與酶固定化同步完成，其回到常溫時因冰融化而

20、形成的多孔結(jié)構(gòu)非常有利于底物與產(chǎn)物的擴散。 2. 添加化學試劑來改善固定化載體的添加化學試劑來改善固定化載體的性質(zhì)。性質(zhì)。 改善固定化酶的通透性：加入能夠溶出或被微生物分解的試劑。 將光敏預聚物、卡拉膠、海藻酸鈉和酶混勻滴入CaCl2溶液中，光照聚合包埋，然后將固化酶通過浸入生理鹽水或磷酸鹽緩沖液,分別溶出卡拉膠或海藻酸鈉，即得通透性改善了的（PVA）載體。提高固定化酶機械性能提高固定化酶機械性能；添加化學試劑對原有的固定化載體進行硬化處理。 添加聚丙烯酰胺一類聚合物可加強瓊脂載體的強度。 在 PVA凝膠制備過程中加入少量活性炭粉末 ,有提高強度增加傳質(zhì)速度的效果 瓊脂-陶瓷雙介質(zhì)包埋：用于細

21、胞固定，瓊脂是細菌最適培養(yǎng)基 ,有利于保持菌體生物的活性，而陶瓷粒則能增加固定化細胞的強度。 有機聚合物涂縛在無機載體上，兼具了兩者的優(yōu)點 3 定向固定化技術定向固定化技術 把酶和載體在酶的特定位點上連接起來 ，使酶在載體表面按一定的方向排列，使它的活性位點面朝固體表面的外側(cè)排列，有利于底物進入到酶的活性位點，酶的活力和固定量都有顯著提高。 4多種固定化方法聯(lián)用多種固定化方法聯(lián)用 采取吸附 -交聯(lián)法、包埋-交聯(lián)法，細胞凝聚-交聯(lián)法、包埋-共價結(jié)合法、二次包埋法等提高固定化產(chǎn)物的多方面的性能。 包埋包埋 -交聯(lián)法：交聯(lián)法：先用明膠包埋 ,再用戊二醛交聯(lián)，穩(wěn)定性有極大提高。 吸附吸附-交聯(lián)法交聯(lián)法：離子交換樹脂吸附后再用多功能基化合物交聯(lián)，可提高固定化酶的活性及穩(wěn)定性，機械性能也較好。 二次包埋法：二次包埋法：聚丙烯酰胺凝膠交聯(lián)過程中放熱及單體和交聯(lián)劑自身的毒性造成細胞及酶的失活現(xiàn)象，先用瓊脂包埋細胞 ,再用 PAM包埋的二次固定法。 5多酶聯(lián)合固定化技術多酶聯(lián)合固定化技術 充分利用其各自特點 ，把不同來源的酶和整個細胞的生物催化性能結(jié)合一起。 輔酶再生蘋果酸脫氫酶(MDH)、乳酸脫氫酶(LDH)和檸檬酸縮和酶(CS)組成的NAD+NADH再生偶聯(lián)酶系統(tǒng)；乙酸激酶(AK)、谷胱甘肽合成酶(GSHS)組成的ADPATP再生偶聯(lián)酶