實(shí)驗(yàn)二、過氧化氫酶的活力和動力學(xué)常數(shù)測定

1、 實(shí)驗(yàn)二、過氧化氫酶的活力和動力學(xué)常數(shù)測定高錳酸鉀滴定法高錳酸鉀滴定法一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、?shí)驗(yàn)?zāi)康膌1.掌握過氧化氫酶活力測定的方法掌握過氧化氫酶活力測定的方法l2.了解過氧化氫酶在生物體中的作用原理了解過氧化氫酶在生物體中的作用原理l3.掌握測定酶米氏常數(shù)的基本原理和方法掌握測定酶米氏常數(shù)的基本原理和方法二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理l過氧化氫酶過氧化氫酶（CAT）屬于血紅蛋白酶，含有鐵，）屬于血紅蛋白酶，含有鐵，它能它能催化過氧化氫分解為水和分子氧催化過氧化氫分解為水和分子氧，鐵起傳遞，鐵起傳遞電子的作用，過氧化氫既是氧化劑又是還原劑。電子的作用，過氧化氫既是氧化劑又是還原劑。lR(Fe2+)+H2

2、O2 = R(Fe3+OH)lR(Fe3+OH)2+H2O2 = R(Fe2+)2+2H2O+O2l總反應(yīng)式總反應(yīng)式：2 H2O2 2H2O+O2過氧化氫酶過氧化氫酶l據(jù)此，可根據(jù)據(jù)此，可根據(jù)H2O2的消耗量或的消耗量或O2的生成量測定該酶的生成量測定該酶活力大小?；盍Υ笮?。l本次實(shí)驗(yàn)酶促反應(yīng)速度用單位時(shí)間底物的減少量表示，本次實(shí)驗(yàn)酶促反應(yīng)速度用單位時(shí)間底物的減少量表示，求出求出單位時(shí)間內(nèi)反應(yīng)前后單位時(shí)間內(nèi)反應(yīng)前后H2O2的量的量，計(jì)算出酶促反應(yīng)計(jì)算出酶促反應(yīng)速度速度。l在反應(yīng)系統(tǒng)中加入過量的在反應(yīng)系統(tǒng)中加入過量的H2O2溶液，經(jīng)酶促反應(yīng)后，溶液，經(jīng)酶促反應(yīng)后，用標(biāo)準(zhǔn)高錳酸鉀溶液（在酸性條件下

3、）滴定多余的用標(biāo)準(zhǔn)高錳酸鉀溶液（在酸性條件下）滴定多余的H2O2，即可求出消耗的，即可求出消耗的H2O2的量。的量。l5 H2O2 +2KMnO4+4H2SO4 =5O2+2KHSO4+8H2O+2MnSO4底物濃度對酶促反應(yīng)速度的影響底物濃度對酶促反應(yīng)速度的影響l在溫度、在溫度、pH及酶濃度恒定的條件下，及酶濃度恒定的條件下，底物濃度對酶促反底物濃度對酶促反應(yīng)的速度有很大的影響應(yīng)的速度有很大的影響。l底物濃度很低時(shí)，酶促反應(yīng)的速度（底物濃度很低時(shí)，酶促反應(yīng)的速度（v）隨底物濃度的增）隨底物濃度的增加迅速增加；隨著底物濃度繼續(xù)增加，反應(yīng)速度的增加開加迅速增加；隨著底物濃度繼續(xù)增加，反應(yīng)速度的增

4、加開始減慢；當(dāng)?shù)孜餄舛仍黾拥揭欢ㄖ禃r(shí)，反應(yīng)速度達(dá)到極限始減慢；當(dāng)?shù)孜餄舛仍黾拥揭欢ㄖ禃r(shí)，反應(yīng)速度達(dá)到極限值（值（Vmax）。）。l米氏方程表示底物濃度米氏方程表示底物濃度 與反應(yīng)速度的關(guān)系與反應(yīng)速度的關(guān)系 v為反應(yīng)速度為反應(yīng)速度 S為底物濃度為底物濃度vmax為最大反應(yīng)速度為最大反應(yīng)速度Km為米氏常數(shù)為米氏常數(shù)米氏常數(shù)米氏常數(shù)KmlKm等于反應(yīng)速度達(dá)到最大反應(yīng)速度一半時(shí)的底物濃度等于反應(yīng)速度達(dá)到最大反應(yīng)速度一半時(shí)的底物濃度。l在酶學(xué)分析中，在酶學(xué)分析中， Km是酶的一個(gè)基本特征常數(shù)是酶的一個(gè)基本特征常數(shù)，它包含，它包含著酶與底物結(jié)合和解離的性質(zhì)。著酶與底物結(jié)合和解離的性質(zhì)。 lKm表示酶和底物

5、之間的親和能力表示酶和底物之間的親和能力， Km值越大，親和能值越大，親和能力越弱，反之亦然。力越弱，反之亦然。l對于每一個(gè)酶促反應(yīng)，在一定條件下都有其特定的對于每一個(gè)酶促反應(yīng)，在一定條件下都有其特定的Km值，值，因此可用于因此可用于鑒別酶鑒別酶。 問題：如何測定酶的問題：如何測定酶的Km值值?l米氏方程的倒數(shù)形式，即米氏方程的倒數(shù)形式，即雙倒數(shù)作圖法雙倒數(shù)作圖法（LineweaveR-Burk法）如下：法）如下： S為底物濃度（為底物濃度（mol/L） v為反應(yīng)速度（為反應(yīng)速度（mol/L*min） vmax為最大反應(yīng)速度（為最大反應(yīng)速度（mol/L*min） Km為米氏常數(shù)（為米氏常數(shù)（m

6、ol/L）l用雙倒數(shù)法（以用雙倒數(shù)法（以1/v對對1/S作圖）作圖） 計(jì)算計(jì)算Km和和vmaxmaxmax11vSvKvm三、材料、試劑與器具三、材料、試劑與器具 1.1.材料：新鮮馬鈴薯材料：新鮮馬鈴薯2.2.試劑：試劑： 1 1）1010% % H H2 2SOSO4 4 2 2）0.2mol/L0.2mol/L磷酸緩沖液磷酸緩沖液,pH7.8,pH7.8 3 3）0.02mol/L0.02mol/L高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)液高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)液：稱?。悍Q取KMnOKMnO4 4（ARAR）3.1605g3.1605g，用新煮沸冷卻蒸餾水配制成，用新煮沸冷卻蒸餾水配制成1000mL1000mL，臨，臨用前用

7、草酸鈉標(biāo)定。用前用草酸鈉標(biāo)定。 高錳酸鉀溶液標(biāo)定高錳酸鉀溶液標(biāo)定 取取5mL 0.1mol/L的草酸和的草酸和3mL 10% H H2 2SOSO4 4溶液于錐形瓶中，溶液于錐形瓶中，加熱至（加熱至（75758585）（見冒熱氣），趁熱用（見冒熱氣），趁熱用KMnOKMnO4 4標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，剛開始反應(yīng)較慢，滴入一滴滴定，剛開始反應(yīng)較慢，滴入一滴KMnOKMnO4 4標(biāo)準(zhǔn)溶液搖動，待標(biāo)準(zhǔn)溶液搖動，待溶液褪色，再加第二滴溶液褪色，再加第二滴KMnOKMnO4 4（此時(shí)生成的（此時(shí)生成的MnMn2+2+起催化作起催化作用）。隨著反應(yīng)速度的加快，滴定速度也可逐漸加快，但用）。隨著反應(yīng)速度的加

8、快，滴定速度也可逐漸加快，但滴定中始終不能過快，不斷搖動或攪拌。滴定至溶液呈滴定中始終不能過快，不斷搖動或攪拌。滴定至溶液呈現(xiàn)微紅色并持續(xù)半分鐘不褪色即為終點(diǎn)。現(xiàn)微紅色并持續(xù)半分鐘不褪色即為終點(diǎn)。l離子反應(yīng)方程式：離子反應(yīng)方程式：2MnO2MnO4 4- -+ +5C5C2 2O O4 42-2-+16H+16H+ +2Mn 2Mn 2+2+10CO+10CO2 2+ 8H+ 8H2 20 0l計(jì)算公式：標(biāo)定的計(jì)算公式：標(biāo)定的 KMnOKMnO4 4 C=0.2/V mol/L C=0.2/V mol/L4）0.1mol/L H2O2：市售：市售30% H2O2大約等于大約等于17.6mol/

9、L，取，取30% H2O2溶液溶液5.68mL，稀釋至，稀釋至1000mL，用標(biāo)準(zhǔn)，用標(biāo)準(zhǔn)0.02 mol/L KMnO4溶液（在酸溶液（在酸性條件下）進(jìn)行標(biāo)定。性條件下）進(jìn)行標(biāo)定。5）0.1mol/L草酸鈉草酸鈉：稱取優(yōu)級純：稱取優(yōu)級純Na2C2O4 13.4g，用蒸餾水溶解后，定容至用蒸餾水溶解后，定容至1L。3.器具器具（1）恒溫水?。┖銣厮。?）研缽）研缽 三角瓶（三角瓶（50mL4） 酸式滴定管（酸式滴定管（10mL） 容量瓶（容量瓶（50mL）四、實(shí)驗(yàn)步驟四、實(shí)驗(yàn)步驟（一）酶液提?。ㄒ唬┟敢禾崛取新鮮馬鈴薯取新鮮馬鈴薯5g加入加入pH7.8的磷酸緩沖溶液少量，的磷酸緩沖溶液少量

10、，研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移至研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，用該緩沖容量瓶中，用該緩沖液沖洗研缽，并將緩沖洗液轉(zhuǎn)入容量瓶中，用同液沖洗研缽，并將緩沖洗液轉(zhuǎn)入容量瓶中，用同一緩沖液定容，一緩沖液定容，4000rpm離心離心15min，上清液即，上清液即為過氧化氫酶的粗提液。為過氧化氫酶的粗提液。注意：提酶在注意：提酶在04操作操作（二）酶活力的測定（二）酶活力的測定1.反應(yīng)反應(yīng)l取取50mL三角瓶三角瓶4個(gè)（兩個(gè)測定兩個(gè)對照），測定瓶中加個(gè)（兩個(gè)測定兩個(gè)對照），測定瓶中加入酶液入酶液2.5mL，對照瓶中加入煮死酶液，對照瓶中加入煮死酶液2.5mL，再加入，再加入2.5mL 0.1mol/L H2O2

11、，同時(shí)計(jì)時(shí)，于，同時(shí)計(jì)時(shí)，于30恒溫水浴中保恒溫水浴中保溫溫10min，立即加入，立即加入10% H2SO4 2.5mL。2.滴定滴定l用用0.02mol/L KMn4標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定H2O2，至出現(xiàn)粉紅色，至出現(xiàn)粉紅色（在（在30s內(nèi)不消失）為終點(diǎn)。內(nèi)不消失）為終點(diǎn)。注意：每瓶反應(yīng)時(shí)間要精確控制在注意：每瓶反應(yīng)時(shí)間要精確控制在10min3.計(jì)算計(jì)算l酶活力用每克鮮重樣品酶活力用每克鮮重樣品1min內(nèi)分解內(nèi)分解H2O2的毫克數(shù)表示的毫克數(shù)表示l酶活酶活(mgH2O2/gmin)=l式中：式中： A對照對照KMnO4滴定毫升數(shù)；滴定毫升數(shù)； B酶反應(yīng)后酶反應(yīng)后KMnO4滴定毫升數(shù)；滴定毫

12、升數(shù)； VT酶液總量（酶液總量（mL）；）； V1反應(yīng)所用酶液量（反應(yīng)所用酶液量（mL）；）； F W樣品鮮重（樣品鮮重（g）；）； 1.71mL 0.02mol/L的的KMnO4相當(dāng)于相當(dāng)于1.7mg H2O2().ABVFWVtT171（三）動力學(xué)常數(shù)的測定（三）動力學(xué)常數(shù)的測定（ Km和和vmax）l取取100mL錐形瓶錐形瓶5個(gè)，編號后按下表加入試劑個(gè)，編號后按下表加入試劑l各瓶分別加好各瓶分別加好H2O2和蒸餾水后，再依次加入酶液和蒸餾水后，再依次加入酶液0.5mL，混勻，記錄各瓶起始反應(yīng)的時(shí)間。，混勻，記錄各瓶起始反應(yīng)的時(shí)間。30反應(yīng)反應(yīng)5min后立即加入后立即加入10% H2SO

13、4 5.0mL終止反應(yīng)。終止反應(yīng)。試劑編號123450.1mol/L H2O2(mL)0.500.670.831.252.50蒸餾水(mL)9.008.838.678.257.001.反應(yīng)反應(yīng)l用用0.02mol/L KMnO4滴定各瓶中剩余的滴定各瓶中剩余的H2O2至微紅色，至微紅色，記錄消耗的記錄消耗的KMnO4溶液毫升數(shù)。溶液毫升數(shù)。l分別求出各瓶反應(yīng)前后的底物濃度分別求出各瓶反應(yīng)前后的底物濃度S0、S1，并計(jì)算反，并計(jì)算反應(yīng)速度應(yīng)速度v： S0=C1V1/10 S1=2.5C2V2/10 v=(C1V1-2.5C2V2)/5l以以1/v對對1/S 0作圖作圖 求出求出Km和和Vmax

14、（用（用excel作圖）作圖）2.滴定滴定3.計(jì)算計(jì)算S0為反應(yīng)前的底物濃度（為反應(yīng)前的底物濃度（mol/L）S1為反應(yīng)后的底物濃度（為反應(yīng)后的底物濃度（mol/L）C1為為H2O2的濃度（的濃度（mol/L）C2為為KMnO4用液的濃度（用液的濃度（mol/L）V1為為H2O2的體積（的體積（mL）V2為滴定消耗的為滴定消耗的KMnO4用液的體積（用液的體積（mL）v為反應(yīng)速度（為反應(yīng)速度（mmol/min）5為反應(yīng)時(shí)間（為反應(yīng)時(shí)間（min）10為反應(yīng)液體積（為反應(yīng)液體積（mL）注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)l酶的提取和存放一般需在酶的提取和存放一般需在0-4進(jìn)行。進(jìn)行。l每個(gè)三角瓶內(nèi)的酶促反應(yīng)時(shí)間要精確

15、控制在每個(gè)三角瓶內(nèi)的酶促反應(yīng)時(shí)間要精確控制在5min。l各反應(yīng)瓶的滴定終點(diǎn)微紅色應(yīng)為同一標(biāo)準(zhǔn)。各反應(yīng)瓶的滴定終點(diǎn)微紅色應(yīng)為同一標(biāo)準(zhǔn)。l使用前，應(yīng)檢查滴定管是否滲漏，滴定過程中應(yīng)使用前，應(yīng)檢查滴定管是否滲漏，滴定過程中應(yīng)該保證逐滴加入。該保證逐滴加入。n實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析：按照按照實(shí)驗(yàn)報(bào)告實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果并分析。要求記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果并分析。n研討：研討：總結(jié)本實(shí)驗(yàn)操作的關(guān)鍵環(huán)節(jié)和注意事項(xiàng)?？偨Y(jié)本實(shí)驗(yàn)操作的關(guān)鍵環(huán)節(jié)和注意事項(xiàng)。影響過氧化氫酶活力測定的因素有哪些？影響過氧化氫酶活力測定的因素有哪些？酶活力測定為什么需在進(jìn)程曲線的初速度時(shí)間范圍內(nèi)進(jìn)行酶活力測定為什么需在進(jìn)程曲線的初速度時(shí)間范圍內(nèi)進(jìn)行？米氏方程中的米氏方程中的Km有何意義及實(shí)際應(yīng)用。有何