生物物質(zhì)分離工程實(shí)驗(yàn)(10級版本).

1、生物物質(zhì)分離工程實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)須知：1、認(rèn)真預(yù)習(xí)理解每個(gè)實(shí)驗(yàn)的目的、原理、操作關(guān)鍵步驟和注意事項(xiàng)。2、按時(shí)上課，遲到20分鐘以上者建議重做實(shí)驗(yàn)；上實(shí)驗(yàn)課時(shí)須帶實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)、記錄本和筆等。3、分組后應(yīng)固定，不能隨意更換，不大聲喧鬧，遵守實(shí)驗(yàn)室規(guī)則。4、實(shí)驗(yàn)前由教師講解實(shí)驗(yàn)原理、實(shí)驗(yàn)具體操作方法以及如何寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告。5、每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束，每組的實(shí)驗(yàn)用具要清洗，并卻待老師檢查實(shí)驗(yàn)結(jié)果后，方能離開實(shí)驗(yàn)室。6、學(xué)生每次實(shí)驗(yàn)要寫出規(guī)范實(shí)驗(yàn)報(bào)告，報(bào)告數(shù)據(jù)必須如實(shí)記錄。7、教師根據(jù)實(shí)驗(yàn)操作情況、打掃衛(wèi)生情況、實(shí)驗(yàn)報(bào)告及最后考核給出成績（總分100份）。（說明：生物工程專業(yè)本課程實(shí)驗(yàn)總學(xué)時(shí)為32個(gè)，因此安排11個(gè)實(shí)驗(yàn)生物技術(shù)專

2、業(yè)本課程實(shí)驗(yàn)總學(xué)時(shí)為16個(gè)，因此安排6個(gè)實(shí)驗(yàn)，做前6個(gè)實(shí)驗(yàn)）2012年2月實(shí)驗(yàn)一 有機(jī)溶劑萃取法中pH對表觀分配系數(shù)的影響（第一次實(shí)驗(yàn)）一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?.通過實(shí)驗(yàn)，加深對表觀分配系數(shù)的理解并掌握其測定方法。22.以紅霉素為實(shí)驗(yàn)對象，了解pH在萃取工藝中的重要性。二、實(shí)驗(yàn)原理1.紅霉素為大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，呈弱堿性，在不同pH條件下，在水溶液和有機(jī)溶液中溶解度不同，故能達(dá)到不同程度的分配。表觀分配系數(shù)是指在一定溫度和壓力下，當(dāng)分配達(dá)到平衡時(shí)溶質(zhì)在萃取相和萃余相中總濃度之比，可通過實(shí)驗(yàn)方法測定。對于弱電解質(zhì)，溶液的pH對表觀分配系數(shù)影響很大。一元弱堿性物質(zhì)溶液pH對表觀分配系數(shù)K的關(guān)系式見式（1

3、-6-4）式中：K0熱力學(xué)分配系數(shù)，在一定的溫度和壓力下是常數(shù)pk化合物電離平衡常數(shù)的負(fù)對數(shù)由上式可知，隨溶液pH升高，K值增大，有利于紅霉素萃取到有機(jī)溶劑中。反之，K值減小，可將紅霉素從有機(jī)相反萃取到水相。2.利用紅霉素在冰醋酸中被濃鹽酸水解后，與對二甲氨基苯甲醛形成有色物質(zhì)，并在486nm波長處有最大吸收值的特性，可測定其化學(xué)效價(jià)，從而計(jì)算出表現(xiàn)分配系數(shù)。三、實(shí)驗(yàn)器材與試劑（一）器材精密電子天平，60ml分液漏斗，分光光度計(jì)，恒溫水浴鍋，pH酸度計(jì)，移液管，燒杯，量筒，試管，50ml容量瓶，稱量瓶和溫度計(jì)等。（二）試劑紅霉素成品，乙酸丁酯或乙酸乙酯，氯化銨，氨水，95%乙醇，冰醋酸，濃鹽酸

4、，對二甲氨基苯甲醛等。四、操作方法（一）溶液配制1.pH9.0氯化銨緩沖液：稱取NH4Cl固體70g，溶于蒸餾水中，加濃氨水48ml，再用蒸餾水稀釋至1L。2.紅霉素原液：A液：稱取紅霉素成品25mg于小燒杯中，加入2ml95%乙醇，溶解后，用去離子水稀釋并定容至50ml。測pH值（用pH酸度計(jì)或精密pH試紙）。B液：稱取紅霉素成品25mg于小燒杯中，加入2ml95%乙醇，溶解后，用pH9.0氯化銨緩沖液稀釋并定容至50ml。測pH值（用pH酸度計(jì)或精密pH試紙）。3.顯色劑：取對二甲氨基苯甲醛適量，加冰醋酸溶解使成0.5%（W/V）的溶液。4. 紅霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液：精密稱取紅霉素標(biāo)準(zhǔn)品適量，加9

5、5%乙醇溶解，制成0.2mg/ml的溶液。5.鹽酸-冰醋酸混合液：鹽酸、冰醋酸按體積比為2：1的比例配成。（二）萃取法測定表觀分配系數(shù)1.將上述已配制好的紅霉素A液和B液各吸取15ml于2只分液漏斗中，再分別加入15ml乙酸丁酯或乙酸乙酯，振搖10min。2.靜置片刻，使其分層，放出下層水相（萃余液），用pH酸度計(jì)或精密pH試紙分別測定其pH，并測定操作溫度。3.用下述方法測定原液A和B以及2只分液漏斗下相液（萃余液）的化學(xué)效價(jià)。4.用下式計(jì)算不同pH的表觀分配系數(shù)：（三）紅霉素的化學(xué)效價(jià)測定方法1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：在移液管中分別吸取紅霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液0.3、0.6、0.9、1.2、1.5ml分別

6、置于試管中，加冰醋酸4.0ml，顯色劑1.0ml，再加鹽酸-冰醋酸混合液至總體積為10ml，搖勻，置30水浴鍋中保溫10min（溫度時(shí)間要準(zhǔn)確，顏色為紅色），取出，冷卻后在486nm波長下比色，用其余的試劑作為空白比照。以吸光度值（A）為縱坐標(biāo)，吸取的樣品量（mg）為橫坐標(biāo)作圖，并線性回歸。2.原液效價(jià)和萃余液效價(jià)的測定（1）取紅霉素A、B原液各0.5ml，置于試管中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線的操作方法，比色后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算原液效價(jià)。（2）另取溶劑萃取系統(tǒng)中的二個(gè)萃余相若干ml，同上操作，比色后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算原液效價(jià)。參考值A(chǔ)萃余相取1.5-2.0ml，B萃余相取3ml左右。2.測定A、B兩種萃取系統(tǒng)中

7、萃余液的pH.（如果pH計(jì)不穩(wěn)定，改為精密的pH試紙）五、結(jié)果分析與討論（試驗(yàn)報(bào)告上要預(yù)留空間，等理論課學(xué)過后再補(bǔ)上）1.計(jì)算不同平衡pH時(shí)的表觀分配系數(shù)K和紅霉素的真分配系數(shù)K0.2.根據(jù)紅霉素的理化性質(zhì)，分析pH影響其表觀分配系數(shù)K值的原因。實(shí)驗(yàn)二 雙水相萃取系統(tǒng)的相圖制作（第一次實(shí)驗(yàn)）一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵笳莆沼脻狳c(diǎn)法制作雙水相系統(tǒng)相圖的方法，加深對相圖的認(rèn)識。二、實(shí)驗(yàn)原理兩水相形成的條件和定量關(guān)系可用相圖來表示，相圖是研究雙相萃取的基礎(chǔ)。相圖是一條雙節(jié)線，當(dāng)成相組分的配比取在曲線下方時(shí)，系統(tǒng)為均勻的單相，混合后溶液澄清透明，稱為均相區(qū)；在曲線的上方時(shí)，能自動分成兩相，稱為兩相區(qū)；若配比取在

8、曲線上，則混合后，溶液恰好從澄清變?yōu)榛鞚帷Ｈ?、?shí)驗(yàn)試劑和器材：（NH4）2 SO4溶液、PEG400、蒸餾水、漩渦振蕩器（或大試管）、微量滴管裝置（或帶刻度滴管，滴定記錄滴數(shù)，換算成體積）、電子天平、微量注射器、大試管、移液管等四、實(shí)驗(yàn)步驟1、 精確配置43.00（g/ml）的（NH4）2 SO4溶液，測定其密度為1.172 g/ml。2、 精確稱取PEG400液體0.700g加入干燥的試管中，按表格第1號數(shù)據(jù)，用移液管加入0.5ml蒸餾水（水的密度按1g/ml計(jì)算），再緩慢滴加已配制好的（NH4）2 SO4溶液，并不斷在混合器上混合，觀察溶液的澄清程度，直至試管內(nèi)溶液開始出現(xiàn)混濁為止（呈霧狀

9、，不是沉淀），記錄（NH4）2 SO4溶液的加入量（ml），并根據(jù)密度值求出重量（g）。（注意要緩慢滴加，不要滴過，否則又要重新稱量）3、 然后，按下表的第2號數(shù)據(jù)加水，使其澄清，繼續(xù)向試管滴加，使其再次達(dá)到混濁，如此按下表3、4反復(fù)操作。4、 計(jì)算每次達(dá)到混濁時(shí)PEG在系統(tǒng)總量中的百分含量（），以PEG的重量百分比濃度為縱坐標(biāo)，以（NH4）2 SO4的重量百分比濃度為橫坐標(biāo)作圖，即得到一條雙節(jié)線的相圖。（按下表數(shù)據(jù)加入、記錄和計(jì)算）序數(shù)加水量（g）加（NH4）2 SO4溶液的量（記錄滴數(shù)，按0.040.05ml/滴換算）（ml）純（NH4）2 SO4的累計(jì)量（g）溶液累計(jì)總量（水硫酸銨PEG

10、） （g）PEG的重量百分比濃度（NH4）2 SO4的重量百分比濃度10.520.130.140.150.160.170.180.1（一般到第5次以后就較難觀察，少數(shù)組可滴至第8次，但至少要加5次）五、結(jié)果分析與討論 簡述相圖的特點(diǎn)和作用？實(shí)驗(yàn)三 雙水相萃取系統(tǒng)中高聚物和鹽對相體積比的影響（第二次實(shí)驗(yàn)）一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?、 了解雙水相系統(tǒng)形成的機(jī)理及常用的雙水相系統(tǒng)。2、 掌握雙水相系統(tǒng)中相比的測定方法。3、 鞏固離心機(jī)的操作方法及注意事項(xiàng)。二、實(shí)驗(yàn)原理雙水相系統(tǒng)通常是由水溶性的兩種聚合物組成或一種水溶性聚合物與一種鹽組成,與一般分離純化技術(shù)相比,雙水相技術(shù)具有處理容量大、能耗低、易連續(xù)化操

11、作和工程放大等優(yōu)點(diǎn)，在蛋白質(zhì)、酶、核酸等生物大分子的分離純化等方面受到廣泛重視，是一種有發(fā)展?jié)摿Φ囊子诠I(yè)化應(yīng)用的生物分離技術(shù)。常用的雙水相系統(tǒng)有：聚乙二醇（PEG）/葡聚糖（DEXTRAN）、PEG/磷酸鹽、PEG/硫酸銨等。分成兩相后，上下相體積比稱為相比，相比增加，上相和下相相對組成的差別就增大，這將會極大地影響產(chǎn)物如酶在兩相中的分配系數(shù)，使酶富集于上相。三、實(shí)驗(yàn)試劑和器材：（NH4）2 SO4固體、PEG400液體、PEG4000固體、糖化酶濾液（濃度為5%10%均可）、蒸餾水、帶刻度離心管、電子天平（或臺秤）、臺式離心機(jī)等四、實(shí)驗(yàn)步驟：1、在四只10ml刻度離心管中，用電子天平準(zhǔn)確稱

12、取以下藥品到每個(gè)離心管中。（1） （NH4）2 SO4固體1.30g， PEG400液體2.00g （2） （NH4）2 SO4固體1.30g， PEG4000固體2.00g （3） （NH4）2 SO4固體1.50g，PEG400液體1.80g （4） （NH4）2 SO4固體1.10g， PEG4000固體2.20g先把PEG4000固體稱好后碾碎再加到離心管中，這樣比較好溶解。2、然后再用移液管分別在上述四只試管中各加入糖化酶上清液0.5ml，然后加水，直到總量為8.00g。3、旋緊試管口，用力振搖數(shù)分鐘，使（NH4）2 SO4或PEG4000固體完全溶解，并使兩相充分混合，以使酶在兩相

13、中的分配達(dá)到平衡。4、用臺式離心機(jī)3000轉(zhuǎn)/分鐘離心分離10 min后，應(yīng)觀察到明顯兩相。（注意離心前對角線上的離心管一定要先平衡，若不平衡，可在套管中滴加少量水；再者，離心機(jī)轉(zhuǎn)速在啟動前打到零擋，啟動后再慢慢加速到3000轉(zhuǎn)/分鐘，離心機(jī)停止轉(zhuǎn)動前不能打開離心機(jī)的蓋子）。5、分別讀出上、下相體積，并求出四個(gè)相體積比R值（即R1、R2、R3、R4）。四只離心管的上下相糖化酶的含量的測定，由實(shí)驗(yàn)四、五來完成。五、結(jié)果分析與討論1、簡述雙水相系統(tǒng)的主要應(yīng)用？ 2、相比對分配系數(shù)有何影響？實(shí)驗(yàn)四 雙水相萃取系統(tǒng)中相體積比對蛋白質(zhì)分配系數(shù)的影響（第二次實(shí)驗(yàn)）一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵螅?、 掌握蛋白質(zhì)在雙水

14、相系統(tǒng)中分配系數(shù)的測定方法。2、 了解蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán)的顯色反應(yīng)原理及應(yīng)用。3、 進(jìn)一步鞏固可見分光光度計(jì)的操作及制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。二、實(shí)驗(yàn)原理：雙水相萃取技術(shù)是分離純化蛋白質(zhì)混合物等生物大分子的有效方法。利用生物物質(zhì)在兩相中不同的分配，可以實(shí)現(xiàn)它們的分離；生物大分子在雙水相中上相和下相的濃度比被定義為分配系數(shù)（K=Ct/Cb）；分配行為受聚合物分子大小、成相濃度、PH、無機(jī)鹽種類等因素影響?？捡R斯亮藍(lán)與蛋白質(zhì)可結(jié)合形成藍(lán)色復(fù)合物，在595nm有最大光吸收，并且在低濃度時(shí)，吸光值與蛋白質(zhì)濃度服從比爾定律。三、實(shí)驗(yàn)試劑和器材： 牛血清蛋白溶液、考馬斯亮藍(lán)染色液（G-250）、蒸餾水、相體積比實(shí)驗(yàn)中

15、分離得到的上下相、可見分光光度計(jì)、恒溫水浴鍋、移液管、試管及試管架等四、實(shí)驗(yàn)步驟：（1）制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：取6支試管，用移液管分別準(zhǔn)確加入牛血清蛋白溶液（120g /ml）體積為0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00ml，然后均用蒸餾水稀釋至1.00ml。再分別加入5.00ml考馬斯亮藍(lán)染色液，混勻。于251的恒溫水浴鍋中保溫10min（為防止試管歪倒或混淆，可把水浴鍋蓋子打開，將試管同試管架一起水浴）。冷卻后，于595nm進(jìn)行測定吸光值，以裝有1.0ml蒸餾水的試管為對照。然后，以以試管中中蛋白質(zhì)總量（g）為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)的吸光值（OD595nm）為縱坐標(biāo)作圖，得標(biāo)準(zhǔn)曲線。（

16、注意所得6點(diǎn)至少應(yīng)有3點(diǎn)在同一直線上，否則標(biāo)準(zhǔn)曲線不可用，應(yīng)參照其他組線性較好的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算）（2）樣品測定：（若顏色太深，一般要重新取樣品再做）上相溶液：用吸管吸取上相液Xml，蒸餾水定容至1.00ml，按（1）法測定吸光值。下相溶液：用吸管慢慢插入離心管底部，吸取下相液Yml，蒸餾水定容至1.00ml，按（1）法測定吸光值。（以上樣品取的ml，往往要根據(jù)具體情況來調(diào)整。參考值：1、3只刻度離心管，上相取0.1ml，下相取0.4 ml，2、4只刻度離心管，上相取0.3ml，下相取0.3 ml）可按下表操作：1（作為對照）2345678牛血清蛋白溶液0.000.200.400.600.80

17、1.00（取上相液Xml）（取下相液Yml）蒸餾水1.000.800.600.400.200.001-X1-Y考馬斯亮藍(lán)染色液5.005.005.005.005.005.005.005.00251的恒溫水浴鍋中保溫10min蛋白質(zhì)總量（g）需計(jì)算0據(jù)OD值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查據(jù)OD值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查595nm吸光值0五、結(jié)果分析與討論1、相比和分配系數(shù)如何影響蛋白質(zhì)的收率？2、要想獲得準(zhǔn)確實(shí)驗(yàn)結(jié)果，應(yīng)注意哪些問題？3、PEG分子量如何影響蛋白質(zhì)的分配系數(shù)？ 實(shí)驗(yàn)六離子交換樹脂的預(yù)處理及總交換容量的測定（第三次實(shí)驗(yàn)）一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?、通過實(shí)驗(yàn)加深對離子交換樹脂的重要性能之一總交換容量的認(rèn)識。2、掌握

18、離子交換樹脂的作用原理。3、學(xué)會離子交換樹脂的預(yù)處理方法。4、熟悉靜態(tài)法、動態(tài)法測定離子交換樹脂總交換容量的操作方法。二、實(shí)驗(yàn)原理交換容量是離子交換樹脂質(zhì)量的重要標(biāo)志，本實(shí)驗(yàn)測定的是離子交換樹脂的總交換量也叫最大或極限交換量，它是指樹脂經(jīng)過100/105干燥至恒重后，每克或水中每樹脂具有的可交換離子的總數(shù)，單位為mol克（干樹脂）或（濕樹脂）即（mol/g或mL）離子交換樹脂交換量最簡單的測定方法是酸堿滴定法。氫型陽離子交換樹脂與堿作用時(shí)生成水，為一不可逆反應(yīng)、故可用于靜態(tài)法測定交換容量。 陰離子交換樹脂不能采用類似的方法測定，應(yīng)用氯型樹脂，當(dāng)它與aO作用時(shí)，生成al，這一反應(yīng)為可逆反應(yīng)，故宜

19、采用動態(tài)法測定樹脂交換容量。（NHCl）aO=（）Oal根據(jù)滴定流出液中Cl含量來測定其總交換容量。三、試劑與器材1、試劑：aOH、Cl、0.1Mal標(biāo)準(zhǔn)溶液、MCl標(biāo)準(zhǔn)溶液、MaO溶液、甲基橙指示劑、Cr指標(biāo)劑、蒸餾水、0.1MAgNO3標(biāo)準(zhǔn)溶液、732陽離子交換樹脂、717陰離子交換樹脂、330弱堿環(huán)氧系陰離子交換樹脂。2、器材：恒流泵、層析柱、滴定管、精密天平、烘箱、容量瓶、三角瓶四、操作方法1、離子交換樹脂預(yù)處理（老師已經(jīng)做了）分別稱取732，717樹脂，加水倒入層析柱中，流加50mLNaOH溶液，流速滴秒，結(jié)束后滴加100mL去離子水，流速可大一些，結(jié)束后再流加50mLCl溶液，流速

20、滴秒，最后流加100去離子水，如此重復(fù)三次。2、靜態(tài)法測定732離子交換樹脂交換量（）精確稱取處理好并抽干的氫型陽離子樹脂732克，60下烘干至恒重，按下式計(jì)算含水量 其中：W1-烘干前樹脂量W2-烘干后樹脂量（）另取處理好的樹脂克放入三角瓶中，吸取40 mL 0.1M NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液加入樹脂中，放置24 hrs (實(shí)際放置2hrs左右)、要求樹脂全部浸入溶液中，然后用吸管分別取出10 mL放入二只三角瓶中，以甲基橙12滴作指示劑，用0.1M Cl標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定溶液由無色變?yōu)榧t色（剛好至磚紅色，約7 mL左右）為滴定終點(diǎn)，取兩次滴定的平均值，按下式計(jì)算732樹脂交換總量。總交換容量（mol/克

21、干樹脂）其中：G濕樹脂總量（克） W樹脂含水量500.1M NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積（實(shí)際40mL） N10.1MNaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的摩爾濃度 N20.1M HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液的摩爾濃度 5總交換溶液體積/取樣檢測溶液體積的倍數(shù)（實(shí)際為4倍） V20.1MHCl標(biāo)準(zhǔn)溶液的用量（mL） 3、動態(tài)法測定717離子交換樹脂交換量（）精確稱取處理好的并抽干的氯型陰離子樹脂717克，105下烘干至恒重，按下式計(jì)算含水量（W）（）另取克樹脂，加水裝入柱中，裝柱時(shí)應(yīng)注意不應(yīng)使樹脂層中有氣泡存在，然后通入NNaSO溶液進(jìn)行交換，用250mL三角瓶收集流出液，流速約為80滴/min，直到氯離子全部交換下來為止，量出流出

22、液的總體積（要參加計(jì)算），然后吸取25mL流出液，用0.1M AgNO3溶液滴定（約1-3 mL），以K2CrO4為指示劑，溶液由淡黃色變?yōu)榧t色為滴定終點(diǎn)，取兩次滴定平均值。（當(dāng)流出液為200ml左右時(shí)，接一滴流出液在黑色比色板上，加一滴AgNO3， 看是否出現(xiàn)有白色沉淀，若有沉淀，則繼續(xù)交換，若無，則表示交換完全，停止交換） 計(jì)算：總交換容量（mol/克干樹脂）其中：VAgNO3用量（mL） NAgNO3當(dāng)量濃度G濕樹脂重（g） W樹脂含水量（） 10流出液總體積/滴定用流出液體積25 mL（視具體情況而定，不一定是10倍）（3）330弱堿環(huán)氧系陰離子交換樹脂的總交換容量的測定方法同步驟（2

23、）。（NaSO溶液約150 mL）五、結(jié)果分析與討論 1、陰離子交換樹脂為什么一般采用氯型樹脂并用動態(tài)法測定其總交換容量2、兩種方法中,HCl、AgNO3標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)起的作用是什么？寫出方程式？3、717和330樹脂總交換容量的測定方法有什么不同嗎？實(shí)驗(yàn)七 大網(wǎng)格吸附樹脂吸附等溫線的制作（第三次實(shí)驗(yàn)）一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?. 了解大孔吸附樹脂吸附的原理。2. 學(xué)會吸附等溫線的制作。二、 實(shí)驗(yàn)原理固體從溶液中的吸附，是溶質(zhì)和溶劑分子爭奪表面的凈結(jié)果，即在固液界面上總是被溶質(zhì)和溶劑兩種分子占滿。如果不考慮溶劑的吸附，當(dāng)固體吸附劑與溶液中的溶質(zhì)達(dá)到平衡時(shí)，其吸附量m應(yīng)與溶液中溶質(zhì)的濃度和溫度有關(guān)。當(dāng)溫度

24、一定時(shí)吸附量只和濃度有關(guān)，m=f(c),這個(gè)函數(shù)關(guān)系稱為吸附等溫線。吸附等溫線表示平衡吸附量，并可用來推斷吸附劑結(jié)構(gòu)、吸附熱和其他理化特性。本實(shí)驗(yàn)采取XAD大孔樹脂對水溶液中苯酚的吸附行為來繪制吸附等溫線。三、試劑與器材試劑：苯酚、去離子水、XAD大孔樹脂儀器：1L容量瓶一個(gè)、250ml容量瓶5個(gè)、250ml錐形瓶5個(gè)、紫外及可見分光光度計(jì)、 搖床四、 操作方法1.大孔樹脂的預(yù)處理（老師已處理）將新購的大孔樹脂放在燒杯中，加入足量的水，使其溶漲至體積不在增加為止，然后倒入內(nèi)有少許水的交換柱，使管內(nèi)樹脂量不超過管長的 1/2以上，水在柱內(nèi)的高度沒過樹脂。裝好柱后，先緩慢地讓水從柱的底部流入反洗，

25、并逐漸加速，使樹脂全部移動，直至樹脂內(nèi)的氣泡全部趕出，同時(shí)懸浮不潔 物、破碎及過小顆粒從管頂逸出為止。然后再用甲醇或95%乙醇或丙酮浸泡24h后再上柱用95%乙醇沖洗，直至無色并澄清后，再用水洗至無醇味即可，也可將樹脂與有機(jī)溶劑一起在水浴上回流，直到洗滌液加水混合后不呈白色渾濁為止，最后用水洗掉所用的有機(jī)溶劑，備用。2.苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 準(zhǔn)確稱取1g苯酚置于1L容量瓶中，用去離子水定容。以其為母液再配制濃度分別為、10、20、30、40、50mg/L的苯酚水溶液250ml。用紫外及可見分光光度計(jì)在270nm處檢測溶液的吸光度。以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。3.取5個(gè)250m

26、l的錐形瓶，分別加入干燥的XAD樹脂0.25g，然后分別加入質(zhì)量濃度為10、20、30、40、50mg/L的苯酚溶液各100ml。以150r/min的振蕩速度在25下振蕩24h(實(shí)際0.5 hr)以上（或用手搖瓶0.5 hr以上）。3.振蕩完以后分別取樣，在270nm處檢測苯酚的殘留濃度。平衡吸附量用下面公式計(jì)算： m=(C0-Ct)V/M 式中：m為平衡吸附量，mg/g；C0為溶液的初始濃度，mg/L；Ct為吸附平衡后溶液的濃度，mg/L；V為溶液的體積，L；M為樹脂的重量，g。4.以溶液的初始濃度C0為橫坐標(biāo)，平衡吸附量為縱坐標(biāo)作吸附等溫線。五、 結(jié)果分析與討論1. 說明大孔吸附樹脂的吸附

27、原理？2. 操作過程中應(yīng)注意的問題？本實(shí)驗(yàn)用樹脂含水量測定：732型：40%；330型：32%；717型：39.8%；大孔吸附樹脂：24.6%實(shí)驗(yàn)八 雞蛋清溶菌酶的分離與純化（第四次實(shí)驗(yàn)）一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵笳莆諒牡扒逯苽淙芫傅脑砗头椒ǎǖ入婞c(diǎn)沉淀和鹽析法）。二、實(shí)驗(yàn)原理溶菌酶存在于植物（植物漿）及動物（蛋清、白血球、淚液、脾臟及鼻粘膜處）組織中。蛋清取材方便，溶菌酶含量豐富（可達(dá)0.3），實(shí)驗(yàn)室及生產(chǎn)中均以蛋清為材料提取溶菌酶。溶菌酶作用于粘多糖，使其糖苷鍵水解，因此可溶解以粘多糖為主要成分的細(xì)菌細(xì)胞壁，起到殺菌的作用。 pI為10.8-11.3由于蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低，所以蛋白質(zhì)的

28、沉降在等電點(diǎn)附近最為顯著。若控制溶液的pH在等電點(diǎn)附近，并增加鹽的離子強(qiáng)度，使蛋白質(zhì)處于沉降前的“臨界狀態(tài)”，在適當(dāng)?shù)臏囟认拢o置若干時(shí)間，蛋白質(zhì)會以結(jié)晶的形式從溶液中析出。加入晶種，能控制晶體的形狀、大小和均勻度，若結(jié)晶液濃度太低而結(jié)晶發(fā)生困難時(shí)，可適當(dāng)加入些晶種，能使結(jié)晶順利進(jìn)行。三、實(shí)驗(yàn)試劑和器材：（1）試劑：新鮮蛋清的pH值大于8才能提取溶菌酶 新鮮蛋清、NaCl、1M的NaOH溶液、1M的鹽酸、五氧化二磷、丙酮、3醋酸溶菌酶晶種（5的無定形溶菌酶溶液10ml，加入NaCl為0.5g，再用1M的NaOH溶液調(diào)pH至9.510.0，4靜置56天，溶菌酶即結(jié)晶出來）等（2）器材： 組織搗碎

29、機(jī)（或電動攪拌機(jī)）、紗布、大燒杯、玻璃棒、冰箱、pH試紙、真空干燥器、多用循環(huán)水真空泵、布氏漏斗等四、實(shí)驗(yàn)步驟1、 生產(chǎn)工藝路線： 2、 操作方法：（3人一組，每人1個(gè)雞蛋，分離蛋清和蛋黃備用，3個(gè)蛋清和蛋黃分別倒入已稱重的燒杯，再稱出蛋清和蛋黃的總重量，蛋清要用量筒量出體積）（1） 分離蛋清和蛋黃：將蛋清與蛋黃分開，除去臍帶塊。并稱蛋清質(zhì)量W和量其體積V。（2） 攪拌蛋清：新鮮蛋清收集后用組織搗碎機(jī)（或電動攪拌機(jī)）緩慢攪拌5min（以不起大泡泡為度，避免酶受剪切力作用被破壞），或直接用玻棒輕輕攪拌半小時(shí)左右（，再用紗布過濾，取濾液備用。不做）（3） 加NaCl：每小組按20ml蛋清液：1g

30、NaCl的比例加入NaCl固體（注意NaCl要研磨碎，一點(diǎn)點(diǎn)加，邊加邊緩慢攪拌，要防止局部鹽濃度過高導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性），攪拌至完全溶解。（4） 調(diào)pH值：NaCl完全溶解后，逐滴加入1mol/L的NaOH（一定要緩慢并均勻，邊加邊緩慢攪拌，防止局部過堿，蛋白質(zhì)變性），調(diào)溶液pH為9.510.0。（用pH酸度計(jì)或精密pH試紙調(diào)）（5） 加晶種：在堿化的蛋清液中，滴加少量溶菌酶晶種，置于4冰箱中，靜置一周左右，觀察溶菌酶結(jié)晶的出現(xiàn)。（因溶菌酶濃度太低晶體不容易析出，每個(gè)小組寫好標(biāo)記再放入冰箱，以免混淆）。（6） 必要時(shí)可重結(jié)晶：一周后，離心收集溶菌酶粗品，離心機(jī)轉(zhuǎn)速4000rpm/min，離心10m

31、in。收集溶菌酶粗品，稱重（用于計(jì)算濕溶菌酶粗品的得率）。（溶菌酶粗品用3%的醋酸調(diào)溶液pH到44.5，晶體溶解后再4000rpm/min，離心10min，除去不溶物，得上清液。按上述方法再加入NaCl，并用1mol/L的NaOH調(diào)溶液pH為9.510.0后，于4冰箱中，靜置一周，進(jìn)行重結(jié)晶。此部分省略）（7） （布氏漏斗抽濾收集結(jié)晶，冷丙酮洗滌晶體除去多余水分，在P2O5的真空干燥器中進(jìn)行真空干燥（干燥器中可放一盆石蠟屑，以便吸收除去剩余的丙酮），干燥后得到溶菌酶的結(jié)晶成品，稱重，計(jì)算得率。）此步驟省略五、結(jié)果分析與討論：1、 在堿化的溶菌酶液中為什么要加入晶種？如何制得溶菌酶晶種？2、 總

32、結(jié)本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵步驟及注意事項(xiàng)？實(shí)驗(yàn)九 蛋黃中卵磷脂的分離純化和定性鑒定（第四次實(shí)驗(yàn)）一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?、 了解卵磷脂的性質(zhì)。2、 學(xué)習(xí)提取卵磷脂粗品的方法。二、實(shí)驗(yàn)原理機(jī)體的各種組織和細(xì)胞均含卵磷脂。在蛋黃（約10）、神經(jīng)、精液、腦髓、骨髓、腎上腺、心臟、蘑菇和酵母等組織內(nèi)含量很高。卵磷脂分子中具有親水基團(tuán)和疏水基團(tuán)，卵磷脂具有降低表面張力的作用；卵磷脂被譽(yù)為與蛋白質(zhì)、維生素并列的“第三營養(yǎng)素”，蛋黃卵磷脂可將膽固醇乳化為極細(xì)的顆粒，這種微細(xì)的乳化膽固醇顆?？赏高^血管壁被組織利用，而不會使血漿中的膽固醇增加，可作為藥物用于動脈粥樣硬化等疾病的綜合治療。純卵磷脂（即磷脂酰膽堿）為白色蠟狀塊，不

33、溶于水，易溶于醇、氯仿、乙醚和二硫化碳中，但不溶于丙酮，利用后一性質(zhì)可與中性脂肪分離。三、實(shí)驗(yàn)試劑和器材：（1）試劑： 新鮮蛋黃、95乙醇、10的NaOH溶液、丙酮、乙醚（2）器材： 磁力攪拌機(jī)（或玻棒）、減壓真空濃縮裝置、恒溫水浴鍋、冰箱、多用循環(huán)水真空泵、布氏漏斗、玻璃漏斗、玻璃棒、小燒杯等四、實(shí)驗(yàn)步驟1、 制備工藝路線：2、 操作方法：抽提：按照實(shí)驗(yàn)八剩下的蛋黃（3個(gè)）的質(zhì)量，加入2倍質(zhì)量的預(yù)熱至3540的95乙醇，可按體積、密度計(jì)算（不需很精確）（注意一定要緩慢的加入，邊加邊緩慢攪拌，否則會出現(xiàn)沉淀得不到抽提液），加入乙醇后，不斷攪拌1012小時(shí)（由于時(shí)間關(guān)系，具體實(shí)驗(yàn)時(shí)改為1.52小

34、時(shí)），離心得上清液（4000r/min，5分鐘）。 濃縮：將上述上清液減壓真空濃縮或沸水浴蒸發(fā)，（要做好標(biāo)記，注意要防止盛有抽提液的瓶子歪倒在水浴鍋，造成浪費(fèi)）至原體積的1/6左右。 去雜：在攪拌下加入濃縮后等體積的乙醚（要緩慢），不斷攪拌并放置2小時(shí)（由于時(shí)間關(guān)系，具體實(shí)驗(yàn)時(shí)改為10分鐘），使不溶物沉淀完全。過濾除去雜質(zhì)，收集上清液（乙醚澄清液）。注意事項(xiàng)同步驟（1）。（由于時(shí)間關(guān)系，該步驟省略） 沉淀卵磷脂：在急速攪拌下加入與上清等體積的預(yù)冷丙酮（丙酮在冰箱里），即開始出現(xiàn)卵磷脂沉淀，用滴管吸取，做鑒定。（抽濾，收集并再用丙酮洗滌，揮發(fā)去乙醚丙酮?dú)堃?，真空干燥得塊狀成品。不做） 定性鑒定卵

35、磷脂：取制品少量置于試管中，加入20的NaOH溶液約2ml，于沸水浴煮沸，卵磷脂分解生成膽堿，膽堿在堿的作用下，形成三甲胺。注意：三甲胺有明顯的魚腥味。五、結(jié)果分析與討論：5、 第一步為什么要用預(yù)熱至3540的95乙醇抽提產(chǎn)品？6、 濃縮是為了去水還是去醇？為什么要濃縮？實(shí)驗(yàn)十、十一 蘋果中多酚類物質(zhì)的分離提取及其定量檢測（第五次實(shí)驗(yàn)）-設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、了解蘋果多酚類物質(zhì)的性質(zhì)及作用 2、熟悉蘋果多酚的提取及鑒定方法二、實(shí)驗(yàn)原理性質(zhì)：蘋果多酚粉末呈黃褐色或淡褐色，其水溶液呈黃褐色，有微弱的苦味和澀味。多酚類物質(zhì)易溶于乙醇、甲醇、丙酮等有機(jī)溶劑，蘋果多酚同時(shí)還具有優(yōu)良的耐熱性和耐酸性，在pH在210、溫度為100條件下，蘋果多酚的分解率很低，易于保存。提?。憾喾宇愇镔|(zhì)在乙醇、甲醇、丙酮等有機(jī)溶劑中都有較高的溶解度，綜合考慮試劑毒性及成本等，最常用的方法是用乙醇作為溶劑浸提。有機(jī)溶劑法具有設(shè)備簡單、操作方便和成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，（最佳提取工藝為: 乙醇濃度60%，提取時(shí)間為120min，溫度為60，料液比16，提取一次,最大提取率為3.80mg /g）測定：過量酒石酸鐵在多酚溶液中與多酚反應(yīng)生成穩(wěn)定的紫褐色絡(luò)合物（可作