彗星實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)

1、精選文檔· 1、凋亡細(xì)胞的觀看：看過國外此法作出的凋亡細(xì)胞彗星圖像，很秀麗，用CASP軟件分析后，其曲線呈典型的雙峰，而正常細(xì)胞為單峰。我的一些教訓(xùn)：觀看凋亡細(xì)胞最好把電壓、電流、和電泳時(shí)間均調(diào)低，否則，凋亡細(xì)胞中的DNA片斷跑的太塊，熒光下根本看不到凋亡細(xì)胞的尾巴。注：我用的是中性條件，20V，200mA,20min, 凋亡細(xì)胞觀看宜選用10V,100mA,10min。伴侶們假如有異議，請(qǐng)不吝賜教，也對(duì)我有所掛念。· 2、· 解旋20分鐘應(yīng)當(dāng)沒問題，但是我認(rèn)為您的電泳時(shí)間過長，當(dāng)然我不知道您的電泳條件（電壓、電流、），我認(rèn)為20分鐘足夠了，時(shí)間長了一是鋪張時(shí)間，

2、二是彗星圖像不好，不利于分析。您的裂解時(shí)間有點(diǎn)短了，文獻(xiàn)報(bào)道，最好不要少于1.5小時(shí)· 3、一般100ul0.5低熔點(diǎn)膠中含400個(gè)細(xì)胞就足夠了· 4、本版【圖片倉庫】子版有我做的彗星圖像，感愛好可以看看· 5、留意，CASP只讀.tif擴(kuò)展名的圖像，假如你的相機(jī)拍攝的圖像可以有.tif格式，就更好了，假如是.jpg格式，那還要在計(jì)算機(jī)中轉(zhuǎn)換一下，不過很簡潔· 6、首先，熒光染色的東西最好馬上看，否則影響結(jié)果。其次，您的染色液量我覺得多了點(diǎn)，我用2ug/ml，1ml注射器1滴就可以。第三，要忠于試驗(yàn)結(jié)果，圖象內(nèi)容不能更改，可以用ACDSEE或PHOTOS

3、HOP轉(zhuǎn)換圖象格式或大小，所以，作出來的試驗(yàn)圖象質(zhì)量要好· 7、。背景的選擇問題，假如圖片質(zhì)量好的話，背景大小不同，對(duì)結(jié)果影響不是很大，假如圖片背景亂七八糟，那背景框的選擇確定對(duì)結(jié)果產(chǎn)生很大影響。我的建議：背景框不要太大，參考我貼的那個(gè)圖。留意，背景框可以在細(xì)胞的上面或下面，假如背景框在上面時(shí)，分析后的圖像（分析后消滅一個(gè)頭、尾分明的圖像，是基本重合在細(xì)胞上的）質(zhì)量很差，很不規(guī)章，那再把背景框調(diào)到下面試試，假如還是不好，那只能說你的結(jié)果質(zhì)量不好了。背景框的選擇關(guān)鍵在于分析同一批細(xì)胞，背景框要相同，才能保持資料的可比性。結(jié)果的保存，記得好像使用說明里提到了，假如沒有提到，那就是我原創(chuàng)的

4、！呵呵，先賣個(gè)關(guān)子。FILE菜單下有一個(gè)EXPORT RESULTS（輸出結(jié)果）的按鈕，點(diǎn)擊以后，默認(rèn)是.TXT文本文件，好了，給你的輸出文件起個(gè)名字，選擇保存位置，點(diǎn)擊確定就OK了，回到你保存的輸出結(jié)果文件，發(fā)覺它是一個(gè)不行識(shí)別的文件，那就直接把它的擴(kuò)展名改成.TXT，打開它，看看你的結(jié)果，包括13個(gè)指標(biāo)，很好，這個(gè).TXT的結(jié)果文件可以被SPSS統(tǒng)計(jì)軟件直接識(shí)別，不是很便利嗎？（假如你情愿把數(shù)據(jù)一個(gè)一個(gè)地輸入統(tǒng)計(jì)軟件，我也沒意見，呵呵）。這里還有一個(gè)小竅門，在用SPSS讀取之前，最好把你的結(jié)果文件調(diào)整一下，這也是我發(fā)覺的。把全部的指標(biāo)都排列到第一行，下面的結(jié)果要和指標(biāo)一一對(duì)應(yīng)，每個(gè)數(shù)據(jù)之間

5、留空格（默認(rèn)的），行與行之間不要用回車，就是不要有空行，其實(shí)調(diào)整起來很簡潔，主要是調(diào)整.TXT文本文件閱讀框的寬度。調(diào)好后，SPSS軟件直接識(shí)別，很便利，為你節(jié)省很大工作量，不信就試試。· 8、我用雙層鋪膠法，自制微電泳槽，第一層:0.75正常熔點(diǎn)膠，100l，其次層：0.75低熔點(diǎn)膠，75l+25l淋巴細(xì)胞懸液，用槍直接把凝膠吹到自制的微電泳槽中，鋪平即可。其次層以相同的方法鋪到第一層上面，不必?fù)?dān)憂脫膠的問題。9、蓋玻片用一般的就可以了，但是可以自做的，一般的蓋玻片其實(shí)有點(diǎn)小了，假如膠很多的話，其次層膠格外厚，這樣不利于觀看細(xì)胞，而且不利于電泳。3。染色后要用雙蒸水沖洗，據(jù)我的閱歷

6、，沖要沖的格外潔凈，否則背景太亮了，拍照后不簡潔分析。但是又不能用勁的沖，否則膠很簡潔掉下來。4。電泳的時(shí)間一般是20分鐘，電壓各個(gè)細(xì)胞是不同的，你可以查查有關(guān)資料，自己做做預(yù)試驗(yàn)。一般狀況下，對(duì)比組的細(xì)胞的tail DNA%應(yīng)為10%左右，不超過20%，假如尾巴太短了，也不好。5。分析要用熒光顯微鏡的，具體的染液，有不同的激發(fā)波長。casp軟件在前面的帖子中就有。很好用的，在推舉一次哦。最好用顯微鏡自帶的相機(jī)，假如你的技術(shù)好的話，可以在目鏡照相，洗出來掃描后可以分析的。6.把EB滴加在膠上就可以了。觀看時(shí)要在暗室里。 我是用EB的，電泳后，直接在膠板上滴上一滴，然后用水沖洗，用濾紙吸去多余水

7、分，熒光顯微鏡觀看10、SCGE技術(shù)的原理：細(xì)胞核中的DNA為負(fù)超螺旋結(jié)構(gòu)，而且很致密，通常DNA雙鏈以組蛋白為核心，回旋而形成核小體。一般狀況下，偶然的DNA單鏈斷裂對(duì)核酸分子雙股結(jié)構(gòu)的連續(xù)性影響不大，而且不易釋放出來，但是，假如用去污劑破壞細(xì)胞膜和核膜，用高濃度鹽提取組蛋白，DNA殘留而形成類核。假如類核中的DNA有斷裂，斷裂點(diǎn)將引起DNA致密的超螺旋結(jié)構(gòu)松散，在類核外形成一個(gè)DNA暈圈。將類核置于電場中電泳，DNA斷片可從類核部位向陽極遷移，經(jīng)熒光染色后，在陽極方向可見形似彗星的特征性圖像，故稱“彗星試驗(yàn)”。彗星尾部即為遷移出類核的DNA片段。此時(shí)彗星尾部有可能還與頭部以單鏈或雙鏈的形式

8、相連。DNA損傷越嚴(yán)峻，導(dǎo)致DNA超螺旋結(jié)構(gòu)越松散，產(chǎn)生的斷裂點(diǎn)越多，DNA片段越小，從而在彗星尾部消滅的DNA斷片越多，則慧尾的長度、面積和熒光強(qiáng)度越大。通過測(cè)量彗星尾部的長度、面積或熒光強(qiáng)度等指標(biāo)，可以對(duì)DNA的損傷程度進(jìn)行定量分析。隨著SCGE技術(shù)的進(jìn)展，可測(cè)量的指標(biāo)也越來越多，而且更精確。目前，用于SCGE分析的指標(biāo)主要分為四類，包括外形指標(biāo)、距離指標(biāo)、強(qiáng)度指標(biāo)和矩類指標(biāo)。其中外形指標(biāo)有彗星細(xì)胞率；距離指標(biāo)包括彗星尾長、彗星全長、彗星頭部半徑、尾部半徑；強(qiáng)度指標(biāo)包括頭部DNA百分含量、尾部DNA百分含量、頭部面積、尾部面積等；矩類指標(biāo)包括尾矩、Olive尾矩等。11、H2O2是作為陽性

9、對(duì)比的吧？它是標(biāo)準(zhǔn)的斷裂劑。但是不同的細(xì)胞對(duì)它的敏感程度是不同的，我覺得前幾個(gè)數(shù)據(jù)有必要?jiǎng)h掉，30微摩爾以下的濃度應(yīng)當(dāng)是會(huì)造成斷裂的。PI染色我見過，染出來的效果也是很不錯(cuò)，是藍(lán)色的。不肯定用EB染色呀，毒性又大。12、單細(xì)胞瓊脂糖凝膠電泳（comet assay）Single Cell Agarose Gel Electrophoresis (SCGE)步驟：一、 細(xì)胞懸液的制備：1. 吸棄舊培育基，D-Hanks沖洗2遍2. 0.25%胰酶消化，待細(xì)胞變圓，間隙增大，馬上終止消化，用彎頭吸管輕輕吹打細(xì)胞，使成細(xì)胞懸液，加入離心管，1000rpm，離心10min，棄上清，以1mlD-Hank

10、s懸浮細(xì)胞，以上應(yīng)在暗室及較低溫度下進(jìn)行。各組收集細(xì)胞23×106個(gè)，必需分散成單個(gè)。懸浮于1mlPh7.4PBS中，此步在暗室及較低溫度下進(jìn)行。二、玻片制備：1. 玻片磨砂。2. 制備0.5%正常熔點(diǎn)瓊脂糖(NMPA)和0.5%低熔點(diǎn)瓊脂糖(LMPA)各20ml。用pH7.4 PBS配制。稱0.1g溶于20mlPBS，如NMA與玻片附著不緊，可上升其濃度至0.65%。鋪第一層膠：0.5%NMPA 100l于磨砂玻片面，快速蓋上蓋玻片，室溫>5min使其固化，即為第一層膠；其次層膠：37 0.5%LMPA 100l+30-50l（1-2x106）細(xì)胞懸液(10:1)混勻，快速鋪

11、于第一層膠上，蓋新蓋玻片，移入冰箱>5min，使其固化。* 余下的細(xì)胞1000g×10min離心，于0.1-0.2ml懸浮緩沖液中混勻，做Western-blot。三、細(xì)胞溶解：1. 玻片緩緩浸入新穎配制的冰涼細(xì)胞溶解液中，4>1小時(shí)或過夜。玻片在細(xì)胞消化液中可至少存放4周。細(xì)胞溶解液配制NaCl 146.1 gNa2EDTA 37.2 gTris base 1.2 g用約12克NaOH調(diào)整pH至10。用去離子水定容至890ml。過濾除菌，為貯備液。室溫保存。應(yīng)用液加入 Triton X-100 至 1%DMSO 至 10%（消退血液或動(dòng)物組織中血紅蛋白釋放的鐵產(chǎn)生的自由

12、基）應(yīng)用前冷藏3060分鐘。4、堿化處理及電泳：取出玻片，放入水平電泳槽中(正極端)，并列放置，不留空隙。倒入新穎配制的冰冷電泳緩沖應(yīng)用液，高于膠2mm，無氣泡。放置1030分鐘，本室一般接受15min，使DNA解鏈。25V, 300mA電泳20分鐘。通過調(diào)整液面來調(diào)電壓。(電壓先調(diào)到最大，電流300mA然后通過液面來調(diào)整電壓)電泳緩沖應(yīng)用液：10N NaOH 30.0 ml（12克）200mM EDTA 5.0 ml （二鈉為0.372g）(附言：電泳緩沖液儲(chǔ)備液：10N NaOH 200g/500ml水，兩周內(nèi)用。200mM EDTA 14.89g/200ml水，pH=10,室溫保存。）定

13、容至1000ml，混勻，電泳前新穎配制。可通過轉(zhuǎn)變液面高度來調(diào)整電壓。5、中和：切斷電源，取出玻片，置染缸，中和緩沖液浸洗，3次×5min。中和緩沖液：Tris base 48.5 g去離子水 定容至1000ml用>10 N HCl調(diào)整pH至7.5。室溫保存。6、染色呈中性后，涼干玻片，50l EB應(yīng)用液染色，蓋上新蓋玻片。EB染色液(10×貯備液)EB 1 mg 去離子水 20 ml 室溫避光保存。臨用時(shí)將貯備液稀釋10倍。使終濃度為5g/ml以上除中和及染色外，各步均應(yīng)在暗處進(jìn)行，以避開額外的DNA損傷。7、鏡檢及結(jié)果評(píng)價(jià)EB染色后的DNA樣品應(yīng)盡快在熒光顯微鏡下

14、觀看。未受損細(xì)胞表現(xiàn)為以圓形熒光核心，即彗星頭部，沒有尾巴。受損細(xì)胞則有彗尾伸向陽極，形成一個(gè)亮的頭部和尾部。用目鏡測(cè)微尺或拍攝×400倍照片再作推斷。每個(gè)樣品中至少隨機(jī)選擇25個(gè)細(xì)胞測(cè)定。彗星尾長度 <35m為未損傷，35-70m為中度損傷，>70m為重度損傷 裂解液中，最難溶解的是SLS,它在中性的時(shí)候不易溶于水，所以你把其他的藥品加進(jìn)去后，先不要加SLS，這里需要磁力攪拌器攪拌，但是時(shí)間不會(huì)很長。溶解后，用NaoH把PH調(diào)到10，這里調(diào)PH值要用NaoH固體，然后把SLS加進(jìn)去，在用磁力攪拌器攪拌，一般需要加熱，50度左右就可以了。大約攪拌1個(gè)小時(shí)就可以溶解。這時(shí)，

15、溶液應(yīng)當(dāng)是透亮的，不是乳白色的。加熱溶解的過程中，可能會(huì)損失肯定的水分，等攪拌完了后，你要把溶液的量補(bǔ)充到你最終需要的體積。當(dāng)你從冰箱中取出裂解液后，裂解液假如有沉淀，你就把它放在37度水浴中讓它充分溶解，然后把DMSO和Triton-100加進(jìn)去，這時(shí)，還是乳白色的，你把他放在37度中放一會(huì)就可以了。留意，溶液的顏色是透亮清亮的，渾濁的話，不能起到裂解的效果，最終跑不出彗星來。中性條件跑出來的是DNA的雙鏈，單鏈斷裂不會(huì)出來，而強(qiáng)堿性條件下，破壞了斷裂部位連接堿基的氫鍵，這樣，雙鏈斷裂也就成了單鏈形式，可以說堿性檢測(cè)的是“雙鏈和單鏈斷裂的綜合損傷”，兩種電泳條件的最大區(qū)分是適用于不同的試驗(yàn)需

16、求。堿性條件的SCGE的建立也是為了滿足不同試驗(yàn)需要。實(shí)踐中要依據(jù)DNA致傷因素選擇試驗(yàn)條件，如：電離輻射對(duì)DNA的損傷以雙鏈斷裂為主，應(yīng)當(dāng)選擇中性SCGE，而且可以排解環(huán)境因素對(duì)DNA損傷的影響（由于DNA很簡潔受到環(huán)境因素的影響而斷裂單鏈為主），假如用堿性的話，就不能區(qū)分哪些是試驗(yàn)因素引起的斷裂，哪些是其它影響因素引起的斷裂。假照試驗(yàn)致傷因素是以DNA單鏈為主，那就應(yīng)當(dāng)選擇堿性SCGE了。有一點(diǎn)需要說明一下，堿性SCGE的確增加了檢測(cè)的敏感性（中性SCGE達(dá)不到），但犧牲了特異性，DNA很簡潔受很多因素的影響而產(chǎn)生斷裂，如吸煙、飲酒等不良生活習(xí)慣、環(huán)境污染等因素。所以堿性條件很難從試驗(yàn)結(jié)果

17、中剔除哪些是非試驗(yàn)致傷因素造成的，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果會(huì)或多或少有點(diǎn)影響。所以說SCGE條件的選擇主要還要依據(jù)試驗(yàn)的需要來定。我在下面這個(gè)帖子里說的“堿性SCGE在大劑量照射時(shí)的各項(xiàng)指標(biāo)簡潔形成平臺(tái)”這句話是相對(duì)中性SCGE而言的，由于堿性SCGE的檢測(cè)敏感范圍要比中性SCGE的敏感范圍低，即堿性在小劑量范圍敏感（靈敏到0.05Gy），中性SCGE在較大劑量范圍敏感。（我已經(jīng)在這個(gè)帖子里做了相應(yīng)的強(qiáng)調(diào)修改），科研工作者格外需要littlesheep04這樣一絲不茍的精神（鄙視?。?，在科研中甚至要作到“斤斤計(jì)較”，這樣才簡潔發(fā)覺問題，很多沒有結(jié)果的試驗(yàn)找不到問題那豈不是很哀痛？呵呵，看來對(duì)某一句話的理解還

18、要考慮語境啊，“堿性SCGE在大劑量照射時(shí)的各項(xiàng)指標(biāo)簡潔形成平臺(tái)”這句話假如單拿出來的話，它本身的描述不夠精確，應(yīng)當(dāng)是某些指標(biāo)（如長度指標(biāo)TL、CL）簡潔形成平臺(tái)，中性SCGE也有這個(gè)問題，而矩類指標(biāo)不會(huì)消滅平臺(tái)（當(dāng)然，哪個(gè)指標(biāo)都會(huì)有它的敏感檢測(cè)范圍），這樣，這句話的目的就是說明矩類指標(biāo)優(yōu)于長度指標(biāo)的。呵呵，脫離了語境，某句話的目的也就大不相同了。我做彗星的幾點(diǎn)體會(huì)：1 正常熔點(diǎn)瓊脂糖我用的0.6%，低熔點(diǎn)我用的0.7%。2 把一般載玻片拿去玻璃廠磨成磨砂玻片，也不貴。磨幾百張確定夠用了。3 我通常在燒杯里配100ml左右的正常熔點(diǎn)瓊脂糖，煮沸之后把磨砂玻片放進(jìn)去，讓膠液浸過磨砂面之后，撈出玻片，用布或者別的什么把光滑面擦干，然后把