熒光原位雜交FISH實(shí)驗(yàn)步驟與方法(精選文檔)

1、熒光原位雜交FISH實(shí)驗(yàn)步驟與方法（精選文檔）（文檔可以直接使用，也可根據(jù)實(shí)際需要修改使用 ，可編輯 歡迎下載）FISH 實(shí)驗(yàn)步驟一、實(shí)驗(yàn)儀器 ：熒光顯微鏡 :高速離心機(jī)：可達(dá) 12000r/min高壓滅菌鍋：160C以上殺菌恒溫箱：為雜交提供恒定溫度恒溫水浴鍋照相機(jī)(與熒光顯微鏡配套)：熒光捕捉圖片二、試劑的配制：1 、0.2mol/ L (pH7.4 磷酸緩沖溶液 (PB試劑為 NaH2P04 2H20 和 Na2HP04 12H2O。-0. 2M 的 NaH2P04溶液：31.2g NaH2P042H20,加蒸餾水 1000mL溶解-0. 2M 的 Na2HP04溶液:71.632g N

2、a2HP0412H2O 加蒸餾水至 1000ml 溶解-0. 2M (pH7.4 磷酸緩沖溶液(PB : 19ml 的 NaH2P04溶液和 81ml 的 Na2HP04溶液充分混合高壓滅菌，常溫保存。2、0.03 mol/ L 磷酸鹽緩沖溶液( (PBS)試劑為 NaCl 和磷酸緩沖溶液 PB0.03MPBS溶液：22.8gNaCI , 150ml磷酸緩沖溶液(PB，加蒸餾水至1000ml，混勻0.02 MPBS溶液：取100ml 0.03MPBS溶液至150ml容量瓶中，加蒸餾水稀釋至 150ml0.01 MPBS溶液：取50ml 0.03MPBS溶液至150ml容量瓶中，加蒸餾水稀釋至

3、150ml高壓滅菌，常溫保存3、4%多聚甲醛溶液（1000ml）（在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行操作）-將略小于2/3體積的水（660ml）加熱到50C,-40g多聚甲醛PFA，邊攪拌邊加入到水中，繼續(xù)保持 60C1滴2mol/LNaOH溶液，立即澄清，但仍有小顆粒。1/3體積的PBS溶液，用Hcl將pH調(diào)至7.2，定容，用孔徑為0.22卩謚勺濾膜過(guò)濾，4 C保存最多保存兩天，或者取少量保存在-20 C o（加熱時(shí)溫度不宜過(guò)高，為60C -65C，否則PFA容易降解，配置好后應(yīng)盡快使 用，否則固定效果較差）。4、1mol/L（pH8.0Tris-HCI 緩沖液的配置-121.1g Tris（三羥基氨基甲烷,加

4、800mL蒸餾水溶解，加入大約42mL的濃HCI-用1M的HCI或IM的NaOH將pH調(diào)至8.0,最后加蒸餾水至1000MI高壓滅菌，4 C冰箱保存。5、10%SDS-10g SDS （十二烷基硫酸鈉）于 50ml滅菌水中，加水至100ml，分裝后室溫保 存。滅菌，或用濾膜過(guò)濾稱取SDS時(shí)需戴口罩！& 0.5M EDTA （pH8.0）溶液的配置- 186.1g乙二胺四乙酸二鈉 加800mL蒸餾水溶解，劇烈攪拌（最好使用磁力攪拌 機(jī)-用NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH至8.0,然后定容至1000mL。7、雜交緩沖液配置2ml雜交緩沖液于2ml離心管中，各試劑的加入順序:360 卩 L 5M Na

5、Cl 40 卩 L IMTris Clx卩L 10%甲酰胺（見(jiàn)下表）y卩L無(wú)菌水（見(jiàn)下表）2 卩 L10% SDS0.22 yn孔徑的濾膜過(guò)濾，4C保存。表 1 配置不同甲酰胺雜交液中甲酰胺和無(wú)菌水的體積甲酰胺濃度（ %）甲酰胺體積 x（yL）無(wú)菌水體積 y（ y0015985100149810200139815300129820400119825500109830600998357008984080079845900698501000598551100498甲酰胺有劇毒，操作時(shí)需戴手套，在通風(fēng)處內(nèi)進(jìn)行，廢液需要回收）不同甲酰胺 雜交液的配 制甲酰胺濃度（%）5M NaCI 溶液(mL)1M

6、Tris-HCI(mL10% SDS(mL甲酰胺體積x（mL）無(wú)菌水體積 y（mL）207280.480239.6357280.4140179.6407280.4160159.6557280.422099.68、雜交后洗滌液的配置配制 50mL 雜交洗滌液于 50mL 離心管中，各試劑加入的順序如下：Zu L M NaCI1mL 1MTris-HCl（pH7.6無(wú)菌水加至 50mL50 卩 L 1% SDS500 卩 L EDTA表 2 根據(jù)雜交緩沖液中甲酰胺濃度而定的探針清洗液液中 NaCl 體積數(shù)甲酰胺濃度 %NaCI 體積 z (DNaCI 最終濃度( mM)09000900564006

7、4010460046015328032820225022525159015930112011235800804056056454004050280285520020不同甲酰胺 對(duì)應(yīng)的洗滌 液的配制甲酰胺濃度（%）1M Tris-HCl10% SDS0.5M EDTA5M NaCl 溶液無(wú)菌水體積(mL(mL（mL）（mL）（mL）2080.4418369.63580.446.4381.24080.444.48383.125580.441.63869、4',6-diamidino-2-phenylindoldihydrochlorid (DAPI常備：1 mg（1-1需要稀釋為：1 1

8、11滅菌儲(chǔ)存在-20 C （用鋁箔覆蓋管子DAPI 可誘變致癌，所以在使用時(shí)要戴手套并且收集廢液，包括早使用移液管時(shí)。 為了避免使用時(shí)對(duì)溶液造成污染，所有的溶液應(yīng)取出置于 50ml 管中，夠每天使用 的量。三、實(shí)驗(yàn)步驟：1、玻片的預(yù)處理：（1）玻片預(yù)處理1）玻片清洗：載玻片與蓋玻片用熱肥皂水刷洗干凈，在實(shí)驗(yàn)室可用超聲清洗代替刷洗（45次每次10 min），然后用清水浸泡過(guò)夜；2）硅化處理：第二天換用1%的鹽酸浸泡24小時(shí)，然后用蒸餾水清洗干凈后放入高壓滅菌鍋滅 菌，60°C烘干。蓋玻片用錫紙包好4°C保存?zhèn)溆?。（蓋玻片干凈即可，不用處 理）（2黏附劑涂片制備載玻片放入APE

9、S與丙酮的1:50溶液（現(xiàn)配現(xiàn)用）中約1min，取出用高壓滅菌處 理過(guò)的蒸餾水清洗后于室溫下干燥（也可放入烘箱里25°C烘干），然后置4C保 存?zhèn)溆?、熒光探針的選擇和標(biāo)記（見(jiàn)fish探針的選擇表）3、樣品的制備與固定（1） 用已滅菌的聚乙烯取樣管取反應(yīng)器內(nèi)泥水混合液1mL，加適量滅菌蒸餾水振蕩混勻，并用超聲波處理使細(xì)菌分散。取處理后的懸濁液約0.5ml進(jìn)行后續(xù)處理。（2） 將懸濁液混合均勻后，按 1:1加入4%多聚甲醛，于4C固定24小時(shí)，（3） 然后置于12000r/min離心5min去除固定劑，將固定樣本加入1ml 0.0lmol/L PBS以 10000r/min的速度離心漂

10、洗兩次，棄去上清液。（4） 采用PBS與乙醇的1:1溶液稀釋定容至1ml于-20C保存?zhèn)溆?、樣品的預(yù)處理1）用微型振蕩器將樣品混合均勻，取 10卩樣品在載玻片上涂抹20mM 20mm大 小（不要太大），37C的烘箱熱固定2h，最高溫度不超過(guò)60C（2）風(fēng)干后于50%、80%、95%的乙醇中各脫水3min，自然風(fēng)干。（脫水：準(zhǔn)備三個(gè)瓷盤(pán)，然后將載玻片取出依次放入瓷盤(pán)中，用 50%乙醇淹沒(méi)載 玻片，脫水3min,取出放入第二、三個(gè)瓷盤(pán)，然后用 80%乙醇脫水，96%乙醇脫 水。脫水后的80%、96%乙醇回收。）脫水后的玻片可以在室溫下保存幾個(gè)月，可在 -20°C的條件下保存幾個(gè)月5、原

11、位雜交探針濃度為50ng/卩L 在密閉的雜交盒內(nèi)鋪滿吸水紙（經(jīng)高壓滅菌烘干），用雜交液濕潤(rùn)，使雜交環(huán)境保 持一定的濕度。用移液槍分別取 24 yL的雜交液和1 L探針滴入帶有樣品的載玻片 上（均勻覆蓋涂片面積），（加蓋硅化蓋玻片，不用）放入雜交盒內(nèi)進(jìn)行雜交反 應(yīng)。雜交溫度與雜交時(shí)間如下。所有有關(guān)探針的操作在處理時(shí)都應(yīng)避光處理！探針?lè)N類溫度（C）時(shí)間（h）甲酰胺濃度%備注EUB MIX 46520同步染色法AOB MIX46355重復(fù)染色法NOB MIX46540重復(fù)染色法GAOMIX462.530同步染色法HGC69a462.530同步染色法PAO651462.530同步染色法6雜交后洗滌從恒

12、溫箱中取出玻片之前將盛有清洗液的容器放入到48C的水浴中預(yù)熱20分鐘雜交完成后取出玻片，立即放入到預(yù)熱好的容器中。注意不能讓玻片干燥，不然將 很難洗去非特異性結(jié)合的信號(hào)，增加背景染色。清洗液的量應(yīng)當(dāng)淹沒(méi)玻片，清洗 1520分鐘后取出，用清水洗去剩余的清洗液，然后室溫下晾干。7、DAPI染色每個(gè)玻片用10卩LDAPI （用甲醇稀釋至1舊/此）滴加到載玻片樣品上，在冰上染 色10mi n，用水沖洗多次，室溫下自然晾干，鏡檢前加蓋蓋玻片。8、熒光顯微鏡觀察經(jīng)過(guò)以上處理的樣品，用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。探針目標(biāo)菌群探針序列甲酰胺濃度修飾EUB338Domain BacteriaGCTGCCTCCCGTAG

13、GAGT20%HEXNSO190Ammonia-oxidizing bacteriaCGATCCCCTGCTTTTCTCC55%HEXNIT3Nitrite-oxidizing bacteriaCCTGTGCTCCATGCTCCG40%FITCcNIT3bCCTGTGCTCCAGGCTCCGGAOQ989CompetibacterTTCCCCGGATGTCAAGGC35%Cy5TMHGC69aActinobacteriaTATAGTTACCACCGCCGT25%FITCPAO651AccumulibacterCCCTCTGCCAAACTCCAG35%Cy3TMDenitrifierCGGGAG

14、GCAGCAGT35%FAM注：a探針濃度均為50ng/ gL bcNIT3為硝酸菌探針 NIT3的競(jìng)爭(zhēng)探針。Abbreviati onmaximum absorpti on Maximum emissi onFilter setFITC （綠色）492nm528nm10(ZeissDAPI （藍(lán)色）365 nm418 nm02(ZeissCY3 （橙色/紅色） 554 nm570 nm15(ZeissCY5 （紅外線檢650 nm667 nm26（Zeiss測(cè)）HEX探針的選用選用EUB MIX（EUB338、EUB338U、EUB338川來(lái)檢測(cè)活性污泥中的全部的細(xì)菌。選用PAOMIX來(lái)檢測(cè)活性污泥中的聚磷菌，選用AOB MIX NOBMIX 來(lái)檢測(cè)活性污泥中的硝化菌。選用GAOMIX探針來(lái)檢測(cè)活性污泥中的聚糖菌，選用HGC69a探針來(lái)檢測(cè)反硝化聚磷菌的優(yōu)勢(shì)菌種 Actinobacteria,用 PAO651 來(lái)檢測(cè)優(yōu)勢(shì)菌種 Rhod