巴山重樓正丁醇部分化學(xué)成分研究開題報告

1、天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院本科畢業(yè)論文課題開 題 報 告 書課 題 名 稱： 巴山重樓正丁醇提取部分的化學(xué)成分研究 實 習 單 位： 天津中醫(yī)藥大學(xué) 實 習 生 ： 馬麗娜 指 導(dǎo) 教 師： 王穎 職稱 實驗師 課題起止時間： 2011.12.282012.5.07 申請開題時間： 2012.12.28 一、 目的意義與國內(nèi)外進展情況： 中藥重樓(RHIAOMA PARIDIS)，基源為百合科（Liliaceae）重樓屬(Paris)植物的根莖。其別名有草河車、華重樓（通稱）、七葉蓮、鐵燈臺、獨腳蓮、九道箍、九龍盤、金線重樓等。主要分布于江蘇、安徽、浙江、江西、福建臺灣、湖北、湖南、廣東、廣西、陜

2、西、四川、貴州、云南等省或自治區(qū)1。重樓具有清熱解毒、消腫止痛、涼肝定驚之功效，用于臃腫、咽喉腫痛、毒蛇咬傷、跌打傷痛、涼風抽搐等癥。近年來，國內(nèi)外學(xué)者很重視對重樓的研究，現(xiàn)已從該屬植物中分離鑒定了50余種化合物,主要有C27甾體皂苷、C21孕甾烷苷、脂肪酸酯、甾醇及其苷、黃酮苷、-蛻皮激素及多糖。其中甾體皂苷44種，占總化合物的80%以上，甾體皂苷元為螺甾烷醇類、異螺甾烷醇類、味甾烷醇類以及變形螺甾類，均有很強的生理和藥理活性2-10。近年來對重樓的藥理研究發(fā)現(xiàn)其具有以下藥理作用：一、抗腫瘤作用重樓皂苷是重樓抗腫瘤的主要活性成分。體外實驗中，重樓皂苷對EAC、宮頸癌U14、RS615、小鼠肉

3、瘤S180、肝癌腹水型Hep、小鼠肝癌H22等細胞株有明顯抑制作用。其中主要以對DNA合成的抑制作用最明顯。此外從對皂苷單體p1和p2的研究認為，其具有較強細胞毒性，對白血病P388、L1210和鼻咽鱗癌KB細胞的ED50分別為0.94、0.14、0.16和0.22、0.43、0.029?g/ml10。二、免疫調(diào)節(jié)作用重樓皂苷p1p3在小鼠成纖維細胞L929培養(yǎng)基中可引起ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細胞增殖效應(yīng)，并能促進小鼠粒/巨噬細胞克隆形成細胞（GM-CFC）增殖。重樓皂苷p2對PHA誘導(dǎo)的人外周全血細胞，有促有絲分裂作用，體內(nèi)試驗?zāi)茉鰪奀3H/HeN小鼠的自然殺傷細胞活性，誘導(dǎo)干擾素產(chǎn)生，并可

4、抑制S-抗原誘導(dǎo)的豚鼠自身免疫性眼色素層炎（EAU）的發(fā)生發(fā)展。重樓皂苷p2是一種作用較強的免疫調(diào)節(jié)劑，而其代謝產(chǎn)物則活性較弱1。三、對呼吸系統(tǒng)的作用重樓煎劑15g/kg灌胃，對二氧化硫引咳的小鼠有止咳作用。薯蕷皂苷有止咳祛痰作用；煎劑或乙醇提取物均按15g/kg灌胃，對組織膠噴霧所致氣管痙攣的豚鼠有保護作用，乙醇提取物作用最強。其提取物在低于1/2-1/5半數(shù)致死量時，即有明顯平喘作用，效果與1/2半數(shù)致死量的氨茶堿相似11。四、心血管作用實驗證明，七葉一枝花水提物可部分拮抗內(nèi)皮素（ET）引起的小鼠卒死作用，并對ET引起的離體大鼠主動脈環(huán)收縮內(nèi)皮依賴的舒張作用，值得從其成分中進一步篩選ET拮

5、抗劑，為心血管疾病的防治開辟新途徑12。五、抗菌、消炎作用實驗證明，用雞胚接種法的重樓水及醇提取物對甲型和亞洲甲型流感病毒有較強的抑制作用；重樓煎劑對金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌、腦膜炎雙球菌、痢疾桿菌、傷寒桿菌、副傷寒桿菌、大腸桿菌和綠膿桿菌有不同程度的抑制作用。其乙醇提取物7.8mg/ml有殺滅鉤端螺旋體作用，而同濃度的水煎劑沒有此作用。重樓煎劑對于右旋糖酐所致的“無菌性炎癥”具有對抗作用。此外，歐陽錄明等采用菌基混和加藥汁雙倍稀釋法體外測定8種中草藥抗白色念珠菌作用的效果，第一章重樓屬植物研究進展結(jié)果表明七葉一枝花有較強的抗白色念珠菌作用，其MIC為1.5 mg/ml，抗菌效價為6.25

6、 mg/ml,是研制開發(fā)抗深部真菌新藥的一個思路13。六、其他作用薯蕷皂苷元有雌激素樣作用，實驗表明大鼠連續(xù)13天灌服重樓總皂苷0.5-1g/kg，能顯著增加大鼠的子宮重量，從而表現(xiàn)出雌激素樣活性4。七葉一枝花制劑給大白鼠灌胃，可明顯減低大鼠腎上腺內(nèi)維生素C的含量，促進腎上腺機能，但對幼鼠影響不大；所含皂苷對離體兔耳平滑肌血管有直接收縮作用。重樓煎劑及皂苷對豚鼠離體回腸均有興奮作用。在我國，重樓是著名的中成藥云南白藥、季德勝蛇藥片、宮血寧膠囊等的主要組成藥物。近年來，隨著研究的深入，重樓的藥用價值越來越受到重視，為了更好的開發(fā)和利用重樓屬植物資源，深入研究該中藥，本課題擬通過提取、分離、鑒定重

7、樓的化學(xué)成分，為重樓藥效的進一步研究和綜合利用提供新的科學(xué)依據(jù)。二、 主要研究內(nèi)容：對巴山重樓進行化學(xué)成分研究，以比較重樓和巴山重樓的活性物質(zhì)基礎(chǔ)，為擴大中藥重樓的資源、合理開發(fā)重樓屬植物提供科學(xué)依據(jù)。三、實驗設(shè)計： 通過溶劑提取法回流提取得到巴山重樓浸膏，依次經(jīng)石油醚，乙酸乙酯及水飽和正丁醇萃取，得到各個極性部位。再通過大孔吸附樹脂柱層析、硅膠柱層析、ODS、TLC、等色譜學(xué)方法從中藥巴山重樓正丁醇部分提取物中分離出單體化合物，并根據(jù)理化性質(zhì)及波譜數(shù)據(jù)鑒定其結(jié)構(gòu)。 儀器設(shè)備及試劑：旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）KQ-500E型醫(yī)用超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）SHZ-95B型循環(huán)水

8、式多用真空泵（河南鞏義市英峪予華）電熱恒溫水浴鍋（北京長風儀器儀表公司）JA1003N電子天平（上海精科公司）電熱鼓風干燥器（天津市華北實驗儀器有限公司）石油醚、乙酸乙酯、乙醇、甲醇、正丁醇均為分析純，購自天津市江天化工試劑有限公司顯色劑：硫酸乙醇溶液：40ml硫酸，加入到460ml乙醇中，即得。分離用柱層析填料硅膠：100-200目（青島海洋化工制造有限公司）200-300目（青島海洋化工制造有限公司）大孔吸附樹脂D-101（非極性）凈晶型（天津市海光化工有限公司）ODS(40-63um)：北京綠百草科技發(fā)展有限公司）薄層析用硅膠(青島海洋化工制造有限公司)四、 主要技術(shù)路線：1. 巴山重樓

9、的提?。喊蜕街貥堑母o（7kg）粉碎，分別用95%和60%的乙醇分別加熱回流提取4次，每次3h，合并濾液，減壓回收乙醇得浸膏，加入適量水混懸后，分別用石油醚、乙酸乙酯和水飽和正丁醇進行萃取。巴山重樓的提取過程見下圖： 巴山重樓 95%和60%乙醇分別加熱提取4次 1次/3h 藥渣 乙醇浸膏 水/石油醚萃取 石油醚層萃取物 水層 乙酸乙酯萃取 乙酸乙酯萃取物 水層 水飽和正丁醇萃取 正丁醇萃取物 水層圖1-1 滇重樓根莖的提取分離過程2.巴山重樓正丁醇部分化學(xué)成分的分離： 巴山重樓正丁醇層萃取物蒸餾水溶解（蒸餾水量為萃取物的20倍量），使用大孔吸附樹脂1250g（D-101型）柱層析進行初分離，

10、含水乙醇梯度（10、30、50、70、95）洗脫，每個梯度洗約6個柱體積。50乙醇洗脫所得樣品使用硅膠柱層析（硅膠，1000g，100-200目），乙酸乙酯：無水乙醇（15：1、10：1、5：1、3：1，1：1）洗脫，將溶劑回收，TLC檢測，合并相同成分，得到5個組分。其中組分5以RP-18 柱層析（ODS，40-63um，100g）分離，用含水甲醇梯度（55、60、65、70、80、90%、100%）梯度洗脫，將溶劑回收，TLC檢測，合并相同成分，得到6個組分。所得組份用甲醇重結(jié)晶，得到化合物.分離過程見下圖： 正丁醇萃取物 大孔吸附樹脂柱層析 50%乙醇洗脫組分 硅膠柱層析 所得組分 RP

11、-18 所得組分 重結(jié)晶 化合物 圖1-2 正丁醇層萃取物分離純化過程五、 預(yù)期結(jié)果：通過實習鞏固大學(xué)階段學(xué)到的知識，增強實驗技能，并且在科研設(shè)計、思路和創(chuàng)新意識等方面得到一定的提升。得到24 個單體化合物，為進一步的研究奠定基礎(chǔ)。六、 研究進度及具體安排：2012.012012.01 查閱相關(guān)文獻。2012.012012.03 對巴山重樓正丁醇部分提取物進行柱層析分離（大孔吸附樹脂柱、硅膠柱等）。2012.032012.05 通過各種色譜手段分離得到單體化合物，并通過物理和化學(xué)方法鑒定其結(jié)構(gòu)。2012.05 對論文修改和補充，進一步完善論文參考文獻：1 湯海峰,趙越平.重樓屬植物的研究概況，

12、中草藥，1998，29（12）:839-842.2 王強，俞祥生，19種資源植物中-蛻皮激素的含量測定，中國藥科大學(xué)學(xué)報，1990，21(3)：229-231.3 邵利平，重樓療肺系疾病，四川中醫(yī)，2000，18(7)：15.4 王浴生，中藥藥理與臨床(第2版)，北京：人民衛(wèi)生出版社,1998.5 黃文通，黃珊，談佩萍，李廣平，重樓皂苷殺滅血吸蟲尾蚴及防護效果的研究，使用預(yù)防醫(yī)學(xué)，1999,6（2）：90-91.6 王強，徐國鈞，中藥七葉一枝花對L929細胞的細胞毒活性研究，中草藥1987，18(11)：526.7 王強，許國鈞，七葉一枝花類對逆轉(zhuǎn)錄酶的抑制作用，中國藥科大學(xué)學(xué)報，1987，18(3)：195-198.8 葉燕萍，易金莉，蚤休粉治療女性生殖道衣原體感染的初步研究：10附80例分析，實用中西醫(yī)結(jié)合雜志，1996，9(4)：226.9 張寅恭，盧鳳英，七葉一枝花的殺精子作用，中草藥，1981，12(2)：40.10 石小楓，杜德極，重樓的藥理研究及應(yīng)用概況，中醫(yī)藥信息，1991，