微生物發(fā)酵提高玉米豆粕型日糧營養(yǎng)價值的初步研究

1、微生物發(fā)酵提高玉米豆粕型日糧營養(yǎng)價值的初步研究摘要: 對玉米 豆粕型日糧進行混菌固態(tài)發(fā)酵，以去除其中的抗營養(yǎng)因子。研究結果表明，發(fā)酵飼料的抗原蛋白發(fā)生了大幅的降解，發(fā)酵后蛋白質相對分子質量主要集中在 18 kDa 以下，小于5 kDa的小分子肽含量從發(fā)酵前的 1 35%提高到了 3 60%，蛋白質的體外消化率提高了 4 0 個百分點。發(fā)酵飼料的棉子糖家族寡糖被徹底降解，其淀粉含量降低了 3 5 個百分點，直鏈淀粉含量提高了4 13 個百分點，有益的代謝產(chǎn)物乳酸等有機酸的含量達到 2 78% ，pH 下降至 4 43。關鍵詞: 玉米; 豆粕; 微生物; 發(fā)酵Abstract: Corn soyb

2、ean meal diet was fermented by mixed strains via solid state fermentation to removethe anti nutrient factor The results showed that antigen proteins in fermented feed were degraded sharp-ly The relative molecular weight of proteins after fermentation were gathered below 18 kDa，and peptidesbelow 5 kD

3、a were increased from 1 35% to 3 60% ，accordingly the protein digestibility in vitro was in-creased 4 0% Besides，raffinose family oligosaccharides were degraded thoroughly，while the starch con-tent decreased 3 5% ，the amylose increased 4 13% ，organic acids content including lactic acid reached to2 7

4、8% ，and the pH decreased to 4 43Key words: corn; soybean meal; microbe; fermentation目前，國內飼料主要以玉米 豆粕型為主，其中玉米作為主要的能量飼料，常常占到日糧組成的60% 左右，而豆粕是動物日糧中蛋白質的主要來源，提供飼料工業(yè) 75% 的飼用蛋白1。豆粕和玉米中含有的多種抗營養(yǎng)因子制約著玉米 豆粕型日糧的利用率，影響動物的生長性能。玉米 豆粕型日糧中的抗營養(yǎng)因子主要是抗原蛋白和棉子糖家族寡糖等?？乖鞍字饕谴蠖骨虻鞍? 11S) 與 伴大豆球蛋白( 7S) ，能夠引起動物腹瀉、生長受阻等過敏反應2 4。棉

5、子糖家族寡糖主要是棉子糖和水蘇糖等低聚糖，由于動物小腸黏液中缺乏 半乳糖苷酶，這些低聚糖不被消化而直接進入大腸中，被結腸中的微生物發(fā)酵產(chǎn)生甲烷和二氧化碳等氣體，引起動物胃腸脹氣5。目前，通過添加酶制劑可以有效降解此類抗營養(yǎng)因子，2012 年 第 37 卷 第 3 期 中 國 油 脂27但由于酶底物專一性的限制和處理成本偏高，目前在大宗飼料原料的處理上使用缺乏經(jīng)濟性。因此，處理成本相對低廉的微生物發(fā)酵法日益受到人們的青睞和重視。發(fā)酵方法不但可以有效消除各類抗營養(yǎng)因子，而且可以產(chǎn)生多種功能性和營養(yǎng)性的乳酸、小肽等有益代謝物，既提高了飼料的營養(yǎng)價值和利用效率，還可以賦予飼料特殊氣味，提高動物適口性。

6、本研究通過混合固態(tài)發(fā)酵法去除玉米 豆粕型日糧中的抗營養(yǎng)因子，均衡其蛋白結構和氨基酸組成，并改善淀粉結構組成，同時積累有益的代謝產(chǎn)物，提高飼料的營養(yǎng)價值。1 材料與方法1 1 材料玉米粉、豆粕、麩皮購自無錫市三里橋糧油市場; 胃蛋白酶( 110 000) 、胰蛋白酶( 1 250) 、 淀粉酶和馬鈴薯直鏈淀粉購自 Sigma 公司; 蛋白質標準購自 MBI Fermentas 公司; 其他試劑均購自中國醫(yī)藥集團上海試劑公司。預制硅膠層析板購自青島海洋化工有限公司。枯草芽孢桿菌、酵母和乳酸菌均為本實驗室保藏的菌株。1 2 發(fā)酵飼料的制備枯草芽孢桿菌、酵母和乳酸菌分別以 5% 的接種量接種于 100

7、 g 原料( 玉米粉 60 g，豆粕 20 g，麩皮 20 g) 中，料水比為10 8，35發(fā)酵48 h，65烘干，粉碎得到發(fā)酵飼料。1 3 淀粉含量測定1 3 1 總淀粉含量測定粉碎的樣品脫脂、洗去可溶性糖后，在 淀粉酶作用下水解，再用鹽酸水解成單糖，最后按還原糖測定，并折算成淀粉含量6。1 3 2 直鏈淀粉含量測定樣品經(jīng) 1793 改良提取器脫脂，之后分散在氫氧化鈉溶液中，向一定的試樣分散液中加入碘試劑，然后使用分光光度計于 720 nm 處測定顯色復合物的吸光度7。參照馬鈴薯直鏈淀粉標準曲線計算出樣品中直鏈淀粉含量。1 4 低聚糖的測定81 4 1 樣品制備準確稱取粉碎玉米 豆粕型日糧(

8、 60 目)10 000 g，加入 50 00 mL 80% 的乙醇，水浴 70 浸提 1 h 以上，過濾取上清液，用 80% 乙醇洗滌 3 次，合并濾液，用真空旋轉蒸發(fā)儀濃縮至 5 mL 左右，定量轉移到 25 mL 容量瓶中，并以 80% 的乙醇定容。樣品液用低溫高速離心機于 12 000 × g、4離心 1min，4 保藏備用。1 4 2 TLC 檢測采用 TLC 方法直接觀察棉子糖和水蘇糖的降解情況，在預制硅膠層析板上點樣，點樣量為 5 L，點樣后用展開劑( 體積比1101 的正丙醇 乙酸 水) 展層，展開至離前沿 2 cm 處，用 1% 1 萘酚的含 10%正磷酸的 95%

9、乙醇溶液顯色，烘箱 100保溫 10 min。1 5 蛋白含量及氨基酸組成測定粗蛋白含量的測定: 凱氏定氮儀測定; 氨基酸的測定: 氨基酸自動分析儀測定。1 6 抗原蛋白測定分別精確稱取發(fā)酵前和發(fā)酵后的樣品各 1 00g，用 0 03 mol / L Tris HCl 緩沖液( pH 8 0) 10 00mL 浸提 1 h，然后于 3 000 × g、4 離心 10 min，取上清液，再于 10 000 × g、4離心 10 min，4 保藏備用。SDS PAGE 按照參考文獻9進行。1 7 小分子肽含量測定參考大豆肽粉的測定方法測定玉米 豆粕型日糧中肽的含量。酸溶蛋白的含

10、量減去游離氨基酸的含量即為肽的含量10。1 8 蛋白質的體外消化率蛋白質的體外消化率采用胃蛋白酶和胰蛋白酶兩步法測定11。1 9 總酸含量的測定總酸含量按照參考文獻12進行，結果以乳酸含量計。2 結果與討論2 1 蛋白含量及氨基酸組成的變化采用凱氏定氮法測定發(fā)酵前后飼料中的粗蛋白含 量 ，結 果 表 明 粗 蛋 白 含 量 由19 16% 提 高 到20 74% 。利用氨基酸自動分析儀測定發(fā)酵前后飼料中氨基酸組成的變化，結果如表 1 所示。表 1 發(fā)酵前后飼料中氨基酸組成的變化 %組 成 發(fā)酵前 發(fā)酵后 組 成 發(fā)酵前 發(fā)酵后賴氨酸 0 76 0 88 甘氨酸 078 092蛋氨酸 0 21

11、0 29 蘇氨酸 050 057天冬氨酸 1 68 1 90 精氨酸 100 115谷氨酸 3 34 3 76 丙氨酸 092 110絲氨酸 0 84 0 94 酪氨酸 047 050組氨酸 0 43 0 45 半胱氨酸 018 020亮氨酸 2 37 2 75 纈氨酸 085 098脯氨酸 2 42 2 83 苯丙氨酸 087 099異亮氨酸 1 07 1 22 總計 1603 18262 8CHINA OILS AND FATS 2012 Vol. 37 No. 3從表 1 可以看出，發(fā)酵后氨基酸總量從原來的16 03% 提高到 18 26% ，各種氨基酸成分也比發(fā)酵前均有所提高，其中賴氨

12、酸提高了 15 79%，蛋氨酸提高了 38 01%。2 2 抗原蛋白的變化豆粕中的蛋白質主要包括大豆球蛋白( 11S) 和 伴大豆球蛋白( 7S) ，其中 伴大豆球蛋白包括、'和 3 種亞基。這些抗原蛋白及各種抗營養(yǎng)因子影響動物的生長率、營養(yǎng)物質的吸收，影響腸內環(huán)境導致過敏，造成的免疫反應導致氨基酸結構發(fā)生變化，影響蛋白質結構和穩(wěn)定性等13。采用 SDS PAGE 電泳法測定發(fā)酵后抗原蛋白降解情況，結果如圖 1 所示。從圖 1 可以看出，發(fā)酵后大分子蛋白特別是抗原蛋白明顯降解，而小分子蛋白含量增加。在 SDS PAGE 電泳圖的基礎上考察了發(fā)酵前后玉米 豆粕型日糧中相對分子質量在 5

13、kDa 以內的小分子肽含量的變化情況，結果發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后小分子肽含量從1 35% 提高到 3 60% 。小分子肽能完整地通過腸黏膜細胞進入體循環(huán)14，它的吸收具有轉運速度快、耗能低、載體不易飽和等優(yōu)點15，此外小分子肽還具有促進肌紅細胞復原，促進微量元素吸收，能提高動物的生產(chǎn)性能16。2 3 蛋白質體外消化率的變化微生物發(fā)酵后，大分子蛋白質結構的變化以及小分子蛋白質含量的提高都會影響動物的消化率。采用胃蛋白酶 胰蛋白酶兩步法測定發(fā)酵前后飼料蛋白質的體外消化率，結果如圖 2 所示。從圖 2 可以看出，日糧中蛋白質的體外消化率從發(fā)酵前的85 9% 提高到 89 9% 。說明小分子肽和氨基酸含量的提高，

14、以及大分子蛋白質結構的變化都有助于提高蛋白的消化率。2 4 淀粉含量與組成的變化玉米中碳水化合物含量在 70% 以上，因此玉米具有很高的營養(yǎng)價值，是一種重要的能量飼料。但是玉米淀粉中含有非淀粉多糖等抗營養(yǎng)因子，動物食用后需在體內多種淀粉酶作用下水解為可利用的糖類，才能被吸收利用，因此淀粉在動物消化道內可能會因為得不到很好地調控而限制了其營養(yǎng)作用的充分發(fā)揮，甚至會造成動物吸收利用慢、利用率低等問題1。發(fā)酵前后飼料中淀粉和直鏈淀粉的含量如表 2 所示。表 2 發(fā)酵前后淀粉含量的變化 %項 目 發(fā)酵前 發(fā)酵后淀粉含量 57 9 54 4直鏈淀粉含量 8 39 12 52從表2 可以看出，發(fā)酵后淀粉含

15、量降低了35 個百分點，而直鏈淀粉含量提高了 4 13 個百分點。在微生物作用下玉米淀粉部分水解為糖類，并被微生物所利用，產(chǎn)生乳酸等小分子含碳物質，這類物質更容易被動物消化、吸收利用，有助于改善能量飼料的品質，提高飼料適口性，動物采食后可為其持續(xù)供應能量。同時，微生物發(fā)酵過程中產(chǎn)生的異淀粉酶等淀粉水解酶將支鏈淀粉切割成不同的直鏈淀粉片斷，改變了淀粉的分子結構，使直鏈淀粉含量增加，改善了飼料的營養(yǎng)成分，相應提高了飼料的單位能量值。2 5 棉子糖家族寡糖的變化微生物發(fā)酵可以有效地降解引起動物脹氣的棉子糖家族寡糖，發(fā)酵前后棉子糖和水蘇糖的 TLC分析結果如圖 3 所示。從圖 3 可以看出，發(fā)酵后棉子

16、糖和水蘇糖被完全降解。另外，棉子糖和水蘇糖的降解對提高飼料的代謝能和蛋白質消化率都有好處，Irish等17研究發(fā)現(xiàn)，消除棉子糖家族寡糖后，飼料的代謝能可以提高 7% ，氮存留可以提高 4 4% 。2012 年 第 37 卷 第 3 期 中 國 油 脂292 6 總酸含量的變化發(fā)酵飼料中乳酸菌的大量增殖提高了乳酸含量，會對飼料有酸化作用，可降低動物胃腸道 pH，抑制病原菌繁殖，調節(jié)動物腸道微生態(tài)環(huán)境，促進動物健康等18。通過測定發(fā)酵前后飼料的 pH 和總酸含量后發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵飼料的 pH 從原料的 6 24 下降到4 43，乳酸含量達到了 2 78% 。3 結 論采用微生物發(fā)酵玉米 豆粕型日糧不但成

17、本低，對飼料營養(yǎng)成分破壞小，還可以同時去除多種抗營養(yǎng)因子。研究表明，發(fā)酵玉米 豆粕型日糧，淀粉含量降低了 3 5 個百分點，直鏈淀粉含量提高了4 13個百分點。抗原蛋白和棉子糖家族寡糖發(fā)生了大幅的降解，發(fā)酵后蛋白質相對分子質量主要集中在 18 kDa 以下，小于 5 kDa 的小分子肽含量從發(fā)酵前的 1 35%提高到了 3 60%，蛋白質的體外消化率提高了 4 0 個百分點。氨基酸的組成和含量也有一定的變化和提高。有益的代謝產(chǎn)物乳酸的含量達到2 78% ，pH 下降至 4 43，創(chuàng)造的酸性環(huán)境可以有效抑制飼料中病原菌的生長。發(fā)酵后的玉米 豆粕型日糧的營養(yǎng)價值得到明顯改善，其動物飼養(yǎng)方面有待進一

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