實驗4 醋酸纖維薄膜法分離血清蛋白質

1、實驗實驗4 4 醋酸纖維薄膜法分離血清蛋白質醋酸纖維薄膜法分離血清蛋白質一 、實驗目的n掌握醋酸纖維薄膜電泳法分離蛋白質的原理和方掌握醋酸纖維薄膜電泳法分離蛋白質的原理和方法。法。二、實驗原理二、實驗原理 利用帶電粒子在電場中移動速度不同而分離的技術稱為利用帶電粒子在電場中移動速度不同而分離的技術稱為電泳技術電泳技術。 醋酸纖維薄膜電泳醋酸纖維薄膜電泳(CAME)是以醋酸纖維薄膜是以醋酸纖維薄膜(CAM)作支作支持物的一種區(qū)帶電泳技術，持物的一種區(qū)帶電泳技術，醋酸纖維（即二乙酸纖維素）醋酸纖維（即二乙酸纖維素）薄膜具有均一的泡沫狀結構（厚約薄膜具有均一的泡沫狀結構（厚約120m120m），滲透

2、性強，），滲透性強，對分子移動無阻力，故可用它作區(qū)帶電泳的支持物，具對分子移動無阻力，故可用它作區(qū)帶電泳的支持物，具有用樣量少，分離清晰，無吸附作用等優(yōu)點。目前可用有用樣量少，分離清晰，無吸附作用等優(yōu)點。目前可用于血清蛋白、脂蛋白、糖蛋白、酶的分離和免疫電泳等于血清蛋白、脂蛋白、糖蛋白、酶的分離和免疫電泳等方面。方面。 將血清樣品點樣于醋酸纖維膜上，在將血清樣品點樣于醋酸纖維膜上，在pH 8.6的緩沖液中的緩沖液中電泳，血清蛋白質均帶負電荷移向正極。由于電泳，血清蛋白質均帶負電荷移向正極。由于血清中各血清中各蛋白組分等電點不同而致表面凈電荷量不等，分子大小蛋白組分等電點不同而致表面凈電荷量不等

3、，分子大小和形狀各異和形狀各異，氨基酸組分、立體構象和相對分子量不同，氨基酸組分、立體構象和相對分子量不同，因而因而電泳遷移率不同電泳遷移率不同，彼此得以分離。電泳后，彼此得以分離。電泳后，CAM經染色和漂洗，可清晰呈現(xiàn)清蛋白、經染色和漂洗，可清晰呈現(xiàn)清蛋白、1、2、球球蛋白蛋白5條區(qū)帶。條區(qū)帶。 在一定的范圍內，蛋白質的含量與結合的染料量呈正比，在一定的范圍內，蛋白質的含量與結合的染料量呈正比，故可將各蛋白質區(qū)帶剪下，分別用故可將各蛋白質區(qū)帶剪下，分別用0.4 mol/LNaOHmol/LNaOH溶液浸溶液浸洗下來，進行比色，測定其相對含量。洗下來，進行比色，測定其相對含量。表表 血清中各蛋

4、白組分的等電點和相對分子量血清中各蛋白組分的等電點和相對分子量清清三、實驗試劑和材料三、實驗試劑和材料血清：抗血清：抗A A血清（醫(yī)用）血清（醫(yī)用）巴比妥巴比妥- -巴比妥鈉緩沖溶液（巴比妥鈉緩沖溶液（pH8.6pH8.6）染色液：染色液：1 1氨基黑氨基黑10B10B染料染料漂洗液漂洗液浸出液浸出液透明液透明液醋酸纖維薄膜：醋酸纖維薄膜：2 28 cm8 cm，厚度，厚度120m120m用普通的薄載玻片自制點樣器用普通的薄載玻片自制點樣器直流穩(wěn)壓電泳儀，水平電泳槽直流穩(wěn)壓電泳儀，水平電泳槽 薄膜的準備薄膜的準備 電泳槽的準備電泳槽的準備 點樣點樣 電泳電泳 染色與漂洗脫色染色與漂洗脫色 四、

5、實驗操作流程四、實驗操作流程.準備和點樣準備和點樣：在浸泡薄膜前應辯清薄膜的在浸泡薄膜前應辯清薄膜的正反面正反面，因為浸泡打濕后不易辯別正，因為浸泡打濕后不易辯別正反面。反面。在距膜一端在距膜一端1.5cm1.5cm用用鉛筆作好標記，將薄膜漂在緩沖液液面上，迅鉛筆作好標記，將薄膜漂在緩沖液液面上，迅速濕潤，整條薄膜一致而無白點。然后用竹鑷子將薄膜輕輕完全速濕潤，整條薄膜一致而無白點。然后用竹鑷子將薄膜輕輕完全浸入緩沖液中，待膜浸入緩沖液中，待膜完全浸透完全浸透后使用后使用( (約約0.5h0.5h) )。然后將然后將薄膜制作電橋薄膜制作電橋：將電泳緩沖液倒入電泳槽兩邊，平衡兩邊：將電泳緩沖液倒

6、入電泳槽兩邊，平衡兩邊液面。根據電泳槽的縱向尺寸，剪裁尺寸合適的液面。根據電泳槽的縱向尺寸，剪裁尺寸合適的濾紙條濾紙條, ,附著在電附著在電泳槽的支架上，使它的一端與支架的前沿對齊，而另一端浸入電泳槽的支架上，使它的一端與支架的前沿對齊，而另一端浸入電泳槽的緩沖液內。然后，用緩沖液將濾紙全部潤濕并驅除氣泡，泳槽的緩沖液內。然后，用緩沖液將濾紙全部潤濕并驅除氣泡，使濾紙緊貼在支架上，即為使濾紙緊貼在支架上，即為“濾紙橋濾紙橋”。按照同樣的方法，在另。按照同樣的方法，在另一個電極槽的支架上制作相同的一個電極槽的支架上制作相同的“濾紙橋濾紙橋”。它們的作用是。它們的作用是聯(lián)系聯(lián)系醋酸纖維薄膜和兩極緩

7、沖液之間的中間醋酸纖維薄膜和兩極緩沖液之間的中間“橋梁橋梁”。 用竹鑷子取出充分浸透用竹鑷子取出充分浸透(膜上沒有白色斑痕膜上沒有白色斑痕)的薄膜，夾在兩層粗濾紙的薄膜，夾在兩層粗濾紙內，吸去多余的緩沖液，然后平鋪內，吸去多余的緩沖液，然后平鋪 (無光澤面朝上無光澤面朝上). 用注射器吸取少量血清滴在一干凈玻片上，用自制的點樣器的截面用注射器吸取少量血清滴在一干凈玻片上，用自制的點樣器的截面蘸一下血清液滴，再將樣品蘸一下血清液滴，再將樣品“印印”在薄膜無光澤面的點樣區(qū)在薄膜無光澤面的點樣區(qū)(距薄膜距薄膜一端一端1.5cm處處)。使血清均勻分布在點樣區(qū)，完全滲透于膜內。使血清均勻分布在點樣區(qū)，完

8、全滲透于膜內,形成具形成具有一定寬度、粗細勻稱的直線。有一定寬度、粗細勻稱的直線。 事先可在濾紙上練習點樣，掌握點樣技術，這是獲得具有清晰區(qū)帶事先可在濾紙上練習點樣，掌握點樣技術，這是獲得具有清晰區(qū)帶的電泳圖譜的重要環(huán)節(jié)之一。的電泳圖譜的重要環(huán)節(jié)之一。 將點好樣的薄膜將點好樣的薄膜 (無光澤面朝下無光澤面朝下)兩端緊貼在支架的濾紙橋上兩端緊貼在支架的濾紙橋上(加血清加血清端靠負極端靠負極)，中部懸空平直。加上槽蓋，中部懸空平直。加上槽蓋平衡平衡10min，仔細檢查電泳裝，仔細檢查電泳裝置的線路是否正確，然后通電。置的線路是否正確，然后通電。.電泳條件電泳條件電壓電壓90-110V90-110V

9、，電流，電流0.4-0.6mA/cm0.4-0.6mA/cm2 2，通電時間，通電時間45-60min45-60min。泳動距離。泳動距離約達約達3.5-4.0cm3.5-4.0cm時即可斷電。時即可斷電。 .染色染色 電泳完畢，將醋酸纖維薄膜浸于電泳完畢，將醋酸纖維薄膜浸于1 1氨基黑氨基黑10B10B染料中染料中染色染色5-10min5-10min，然后取出，投入漂洗皿中用然后取出，投入漂洗皿中用漂洗液漂洗液反復漂洗至背景無色（約反復漂洗至背景無色（約4-54-5次）次） 。.處理及保存處理及保存染色，洗脫后，浸于蒸餾水中約染色，洗脫后，浸于蒸餾水中約5-10min5-10min，用濾紙吸干，然