梅毒感染的實驗室檢測流程及策略(上海2015.8.7)

1、浙江大學醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院浙江大學醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院檢驗科檢驗科 陶志陶志華華E-mail: E-mail: 梅毒感染的實驗室檢測梅毒感染的實驗室檢測流程與策略流程與策略n 梅毒流行病學簡介梅毒流行病學簡介n 梅毒實驗室檢測流程梅毒實驗室檢測流程n 羅氏梅毒檢測試劑多中心研究結果羅氏梅毒檢測試劑多中心研究結果n梅毒實驗室檢測策略梅毒實驗室檢測策略主要內容據(jù)最新估計，全球每年有1200萬新發(fā)梅毒感染病例，其中200萬為孕婦WHO. 2011; WHO. 2012; WHO. 2011; WHO. 2012; UNICEF. 2011. UNICEF. 2011. 梅毒感染新發(fā)病例(單位：百萬)全

2、球梅毒流行現(xiàn)狀 梅毒起源于美洲，然后從美洲到西班牙，從歐洲到亞洲印度，15051505年年從印度傳入廣東嶺南（“廣東瘡”），后傳到全國各地。少數(shù)民族地區(qū)居民梅毒感染率 = 10%牧區(qū)人群梅毒感染率 = 48%部分城市地區(qū)人群梅毒感染率 = 5%部分農村地區(qū)人群梅毒感染率 = 2-3%（此幻燈片內容源自中國疾病預防控制中心性病控制中心陳祥生教授）我國梅毒流行現(xiàn)狀 通過三大措施，梅毒在我國實現(xiàn)基本消滅n 健康教育和宣傳運動健康教育和宣傳運動n 免費梅毒篩查（梅毒血清制動試驗、熒光抗免費梅毒篩查（梅毒血清制動試驗、熒光抗體試驗）體試驗）n 治療治療我國梅毒基本消滅我國梅毒基本消滅(1950-1964

3、(1950-1964年年) ) 作為重大防治成就、學術成就，作為重大防治成就、學術成就，贏得國際上的廣泛認可。贏得國際上的廣泛認可。n19781978年獲得全國科學大會獎年獲得全國科學大會獎n發(fā)表論文發(fā)表論文我國對梅毒的控制和我國對梅毒的控制和消滅消滅、梅毒的傳播及在中國梅毒的傳播及在中國的消滅的消滅（此幻燈片內容源自中國疾病預防控制中心性病控制中心陳祥生教授）我國梅毒流行現(xiàn)狀6中國梅毒報告發(fā)病趨勢中國梅毒報告發(fā)病趨勢n梅毒報告病例數(shù)梅毒報告病例數(shù)448 620448 620例，居甲乙類傳染病第例，居甲乙類傳染病第3 3位位n梅毒報病較梅毒報病較20112011年增長年增長4.41%4.41%

4、，隱性梅毒增長的貢獻率，隱性梅毒增長的貢獻率99.6%99.6%（此幻燈片內容源自中國疾病預防控制中心性病控制中心龔向東教授）我國梅毒流行現(xiàn)狀梅毒是一個可以臨床治愈的傳染病病例診斷依據(jù)n病史病史n癥狀癥狀n實驗室檢查實驗室檢查實驗室檢查結果對梅毒診斷及判愈有決定性意義實驗室檢查結果對梅毒診斷及判愈有決定性意義我國梅毒流行現(xiàn)狀我國政府梅毒控制相關政策我國政府梅毒控制相關政策l衛(wèi)生部于2010年6月3日下發(fā)了關于中國預防與控制梅毒規(guī)劃（2010-2020年）l衛(wèi)生部2011年2月12日下發(fā)預防艾滋病、梅毒和乙肝母嬰傳播工作實施方案l國務院2012年1月13日中國預防控制艾滋病五年行動計劃（2101

5、1-2015年）l2013年1月實施性病防治管理辦法梅毒控制主要措施：梅毒控制主要措施：提高梅毒實驗室檢測質量提高梅毒實驗室檢測質量加強梅毒篩查力度加強梅毒篩查力度我國梅毒流行現(xiàn)狀n 梅毒流行病學簡介梅毒流行病學簡介n 梅毒實驗室檢測流程梅毒實驗室檢測流程n 羅氏梅毒檢測試劑多中心研究結果羅氏梅毒檢測試劑多中心研究結果n梅毒實驗室檢測策略梅毒實驗室檢測策略主要內容常用梅毒實驗室檢測方法n 病原學檢測病原學檢測n 血清學檢測血清學檢測病原學檢查病原學檢查原理：原理：一期、二期梅毒時一期、二期梅毒時，取硬下疳、扁平濕疣、，取硬下疳、扁平濕疣、黏膜斑等皮損部位組織液或淋巴結穿刺術得到的組黏膜斑等皮損

6、部位組織液或淋巴結穿刺術得到的組織液，在暗視野顯微鏡下，光線從聚光器的邊緣斜織液，在暗視野顯微鏡下，光線從聚光器的邊緣斜射到涂片上的梅毒螺旋體而發(fā)出亮光，從而可根據(jù)射到涂片上的梅毒螺旋體而發(fā)出亮光，從而可根據(jù)其特殊形態(tài)和運動方式進行檢測。其特殊形態(tài)和運動方式進行檢測。方法：方法： （1 1）暗視顯微鏡檢查）暗視顯微鏡檢查 （2 2）鍍銀染色法）鍍銀染色法 （3 3）核酸檢測（血液標本？）核酸檢測（血液標本？）注：梅毒螺旋體目前體外人工培養(yǎng)還沒有獲得成功，注：梅毒螺旋體目前體外人工培養(yǎng)還沒有獲得成功，僅能通過接種兔睪丸等部位進行有限增殖。僅能通過接種兔睪丸等部位進行有限增殖。 病原學檢查的臨床意

7、義n 螺旋體檢查是診斷早期梅毒螺旋體檢查是診斷早期梅毒的最佳方法，對于患者的早期診的最佳方法，對于患者的早期診斷、及時治療、預后和盡早切斷斷、及時治療、預后和盡早切斷傳染源都有十分重要的意義。傳染源都有十分重要的意義。n 如未見到梅毒螺旋體，并不如未見到梅毒螺旋體，并不能排除患梅毒的可能性。能排除患梅毒的可能性。梅毒血清學檢測方法n非梅毒螺旋體抗原血清學試驗非梅毒螺旋體抗原血清學試驗 （非特異性梅毒抗體非特異性梅毒抗體）n 梅毒螺旋體抗原血清學試驗梅毒螺旋體抗原血清學試驗 （特異性梅毒抗體特異性梅毒抗體）兩類方法。）兩類方法。非梅毒螺旋體抗原血清學檢測方法包括：方法包括： （1 1）快速血漿反

8、應素環(huán)狀卡片試驗）快速血漿反應素環(huán)狀卡片試驗 ( (RPRRPR) ) （2 2）甲苯胺紅不加熱血清試驗（）甲苯胺紅不加熱血清試驗（TRUSTTRUST） （3 3）性病研究實驗室試驗）性病研究實驗室試驗 ( (VDRLVDRL) )等。等。基本成分是基本成分是心磷脂心磷脂 卵磷脂和膽固醇卵磷脂和膽固醇抗原抗體結合形成復合物，凝集成網狀沉淀顆粒被肉眼所見抗原抗體結合形成復合物，凝集成網狀沉淀顆粒被肉眼所見上述方法的敏感性和特異性都基本相似上述方法的敏感性和特異性都基本相似梅毒螺旋體抗原血清學檢測n 抗原為梅毒螺旋體特異蛋白（包括螺旋體重組特抗原為梅毒螺旋體特異蛋白（包括螺旋體重組特異抗原），檢

9、測梅毒患者血中特異性抗梅毒螺旋體異抗原），檢測梅毒患者血中特異性抗梅毒螺旋體抗原的抗體?？乖目贵w。n 感染梅毒螺旋體后，一旦梅毒螺旋體抗體試驗呈感染梅毒螺旋體后，一旦梅毒螺旋體抗體試驗呈陽性，則陽性，則患者終身陽性患者終身陽性。梅毒螺旋體抗原血清學試驗方法n梅毒螺旋體顆粒凝集試驗梅毒螺旋體顆粒凝集試驗 ( (TPPATPPA) )n 梅毒螺旋體血球凝集試驗梅毒螺旋體血球凝集試驗 ( (TPHATPHA) )n 梅毒酶聯(lián)免疫吸附試驗（梅毒酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISAELISA）n 化學發(fā)光免疫分析法化學發(fā)光免疫分析法（CLIACLIA）n 梅毒免疫層析法梅毒免疫層析法- -梅毒快速檢測梅毒快速

10、檢測 ( (RTRT) )n 熒光螺旋體抗體吸收試驗（熒光螺旋體抗體吸收試驗（FTA-ABSFTA-ABS）n 梅毒螺旋體蛋白印跡試驗（梅毒螺旋體蛋白印跡試驗（WBWB）梅毒螺旋體免疫學檢測的發(fā)展歷程1980s2000EIA被FDA批準用于確認試驗和血液篩查英國公共健康實驗室指南：EIA可以作為替代VDRL/RPR+TPHA的選擇之一2001FDA批準EIA用于臨床診斷2008歐盟指南推薦：EIA/CIA/TPPA用于篩查，不再推薦VDRL/RPR2009美國CDC-APHL報告：EIA/CIA用于篩查. .European guideline on

11、 the management of syphilis 2008European guideline on the management of syphilis 2008STD treatment guideline 2006 US CDC STD treatment guideline 2006 US CDC 2014歐洲梅毒管理指南自動化的化學發(fā)光檢測已經用于許多大型的歐洲實驗室，尤其適合對無癥狀的人群和獻血者進行高通量的篩查。該檢測流程更能檢測非常早期的梅毒感染。European guideline on the management European guideline on the

12、management of syphilis 2014of syphilis 2014美國梅毒檢測類型的變化 化學發(fā)光的測試數(shù)量逐年增加為何選擇ECLIA/CLIA? ECLIA/CLIA? n 自動化（高通量）n 低成本（高樣本量的情況下）n 更少的實驗室職業(yè)危害n 沒有假陰性n 結果客觀n 檢測IgMIgM抗體，可用于診斷非常早期的感染VSUS CDC: reverse sequence US CDC: reverse sequence syphilis screeningsyphilis screening檢測原理: 雙抗原夾心法(DAGS) ，檢測時間18 分鐘IgG:IgG:樣本中，

13、抗樣本中，抗- -TpN17TpN17, , 或抗或抗- -TpN15TpN15抗體抗體釕標記的釕標記的TpN17TpN17, , TpN47TpN47抗抗原原9 9 分鐘分鐘測定測定IgM:IgM:樣本中，抗樣本中，抗- -TpN17TpN17, , 或抗或抗- -TpN47TpN47抗體抗體生物素標記的生物素標記的TpN17, TpN17, TpN15TpN15抗原抗原9 9 分鐘分鐘快速高效全自動電化學發(fā)光(ECLIAECLIA)免疫檢測原理n 梅毒流行病學簡介梅毒流行病學簡介n 梅毒實驗室檢測流程梅毒實驗室檢測流程n 羅氏梅毒檢測試劑多中心研究結果羅氏梅毒檢測試劑多中心研究結果n梅毒實

14、驗室檢測策略梅毒實驗室檢測策略主要內容國際多中心研究Clinical and Vaccine Immunology January 2015 Volume 22 Number 1意大利德國（3家中心）土耳其中國（華西醫(yī)院）泰國奧地利全球共8家研究中心（6個國家）國際多中心研究 研究設計 ElecsysElecsysLiaisonLiaison SerodiaSerodiaImmuliteImmuliteArchitectArchitectLiaisonSerodiaImmuliteArchitect敏感性評估特異性評估VitrosEnzygnost樣本信息特異性評估樣本來源干擾樣本8079例3

15、500常規(guī)樣本225HIV91EBV10Lyme病4579獻血員敏感性評估確診樣本干擾樣本928例922陽性228合并HIV6陰性國家/ /中心樣本量ElecsysElecsysLiaisonLiaison SerodiaSerodia ImmuliteImmulite ArchitectArchitectTMTM德國 lab1301100%100%100%德國 lab283100%100%98.8%98.8%意大利218100%100%100%泰國124*100%100%中國202100%總體928928* *100%100%100%100%100%100%99.67%99.67%99.51

16、%99.51%研究結果 敏感性結果* * Elecsys Elecsys 梅毒檢測試劑在所有實驗室中的敏感度結果均達到 100%100%* 2例樣本結果為“不確定”，4例為“無反應性”梅毒分期樣本量確認陽性ElecsysElecsysI期梅毒101101100%II期梅毒124124100%隱性梅毒470470100%未知分期229227*100%總體924#922*100%研究結果 梅毒分期樣本的敏感性結果* * Elecsys Elecsys 梅毒檢測試劑在能100%100%檢測出不同分期梅毒樣本# 排除4例疑似操作錯誤的樣本最終計算結果時排除2例確證試驗結果為未確定的樣本* 排除2例確證

17、試驗結果為未確定的樣本樣本Lot P1Lot P1Lot P2Lot P2Lot P3Lot P3常規(guī)樣本99.80 %99.90 %100.00 %獻血員樣本99.93 %99.82 %99.82 %總體特異性99.88 %99.85 %99.89 %研究結果 總體特異性結果（3批次試劑）* Elecsys Elecsys 梅毒檢測試劑的總體特異性大于 99.85%99.85% 研究結果特異性結果-獻血員樣本* * Elecsys Elecsys 梅毒檢測試劑在獻血員樣本中的總體特異性達到 99.93%99.93% 研究結果特異性結果-常規(guī)樣本* * Elecsys Elecsys 梅毒檢測

18、試劑在常規(guī)樣本中的總體特異性達到 99.80%99.80% 研究結果干擾樣本結果* * Elecsys Elecsys 梅毒檢測試劑在可能的干擾樣本中的敏感性和特異性均更高EBV (+) / Syphilis (-)EBV (+) / Syphilis (-)特異性HIV HIV (+)(+) / Syphilis (-) / Syphilis (-)EBV-Lyme (+) / Syphilis (-)EBV-Lyme (+) / Syphilis (-)n=225, 100%n=81, 100%n=20, 100%100.090.080.0敏感性HIV HIV (+)(+) / Syphi

19、lis ( / Syphilis (+ +) )n=228（%）（%）中國多中心研究廣西海南黑龍江濟南杭州安徽武漢湖南山西內蒙古西安甘肅青海成都貴州西藏烏魯木齊北京* *2 2南京上海長春昆明南寧廣州* *2 2福州* *2 2牽頭單位：四川大學華西醫(yī)院王蘭蘭主任/陶傳敏教授研究中心：15家 研究中心醫(yī)院名稱主要研究者負責人四川大學華西醫(yī)院王蘭蘭陶傳敏昆明市第三人民醫(yī)院李曉非呂松琴第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院郝曉柯皇海首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院婁金麗陳俊梅北京大學第三醫(yī)院張捷崔麗艷/梁永明吉林大學第一醫(yī)院續(xù)薇高丹丹山東省立醫(yī)院張炳昌鄒建文第二軍醫(yī)大學長海醫(yī)院鄧安梅陳園園浙江大學醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院陶志

20、華張松照江蘇省人民醫(yī)院潘世揚徐華國南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院裘宇容袁帥廣東省中醫(yī)院黃憲章黃嫵姣福建省立醫(yī)院伍嚴安沈菁廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院朱波黃文成福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院歐啟水陳靜 研究設計參比方法1： Architect參比方法2： ELISA（2種品牌）參比方法3： 國產化學發(fā)光法-CLIA常規(guī)隨機樣本預留確診樣本“臨界”樣本* *干擾樣本不一致結果RIBARIBA（免疫印跡）* * 臨界樣本（檢測結果出現(xiàn)不一致結果可能性較大的區(qū)間）： Architect Architect：0.9 COI 50.9 COI 5 ELISA ELISA：0.75 COI 30.75 COI 3 國產化學發(fā)光

21、法：0.9 COI 50.9 COI 5 樣本信息組別隨機樣本確診樣本臨界樣本干擾樣本總數(shù)ArchitectArchitect6004359762106649ELISA-1ELISA-14820391754115697ELISA-2ELISA-22943253152373448CLIACLIA36551160623833總數(shù)17422174221119111916616692092019627196274種比對方法，4組樣本* * 所有比對組共收集樣本近2 2萬例 研究結果Elecsys梅毒檢測結果的陽性結果分布* * 在所有常規(guī)隨機樣本中的陽性率為4.974.97% %，剔除傳染病院數(shù)據(jù)后的

22、陽性率為2.582.58% %Cut off 1.0例數(shù)檢測結果區(qū)間 研究結果Elecsys與不同比對方法間的一致性* * Elecsys Elecsys 與所有比對方法在常規(guī)隨機樣本中的一致性達到 99.48%99.48%ElecsysElecsys陽性樣本陰性樣本總體ArchitectArchitect83.09%99.68%99.30%ELISA-1ELISA-196.12%99.83%99.30%ELISA-2ELISA-297.85%99.66%99.49%CLIACLIA95.15%99.85%99.56%總數(shù)99.4899.48Elecsys 比對試劑隨機樣本結果隨機樣本的敏感性

23、和特異性結果* Elecsys Elecsys 在所有比對組隨機樣本中的假陽性和假陰性結果均最少0202040011153946490246810121416ElecsysArchitectElecsysELISA-1ElecsysELISA-2ElecsysCLIA例數(shù)vsvsvsvs假陰性 假陽性假陰性 假陽性假陰性 假陽性假陰性 假陽性 研究結果隨機樣本的敏感性和特異性結果* * Elecsys Elecsys 在所有比對組隨機樣本中的敏感性均達到 100%100%，特異性也更優(yōu)異 Elecsys vs. ArchitectElecsys vs. ArchitectElecsysElec

24、sys vs. vs. ELISA-1ELISA-1Elecsys vs. ELISA-2Elecsys vs. ELISA-2ElecsysElecsys vs. vs. CLIACLIA敏感性10098.2610099.1110099.77100100特異性99.8199.7499.9399.8099.8598.5699.8899.74NPVNPV10099.9710099.9610099.85100100PPVPPV91.2788.2898.6896.1298.5897.8598.1896.00 研究結果預留確診樣本的敏感性* * Elecsys Elecsys 及所有比對試劑均能 10

25、0%100%檢測出不同分期的確診梅毒樣本 Elecsys vs. ArchitectElecsys vs. ArchitectElecsys vs. ELISA-1Elecsys vs. ELISA-1Elecsys vs. ELISA-2Elecsys vs. ELISA-2Elecsys vs.Elecsys vs. CLIA CLIA梅毒分期樣本數(shù)ElecsysElecsysArchitecArchitect t樣本數(shù)ElecsysElecsysELISA-1ELISA-1樣本數(shù)ElecsysElecsysELISA-2ELISA-2樣本數(shù)ElecsysElecsysCLIACLIA 一

26、期梅毒20100 %100 %100 %100 %4444100 %100 %100 %100 %2 2100 %100 %100 %100 %無分期信息 二期梅毒55100 %100 %100 %100 %7474100 %100 %100 %100 %2424100 %100 %100 %100 % 三期梅毒6100 %100 %100 %100 %2424100 %100 %100 %100 %6 6100 %100 %100 %100 % 隱性梅毒96100 %100 %100 %100 %149149100 %100 %100 %100 %5656100 %100 %100 %100

27、 %未分期182*100 %100 %100 %100 %100100100 %100 %100 %100 %165165100 %100 %100 %100 %116116100 %100 %100 %100 % 總數(shù)359359* *100 %100 %100 %100 %390390* *100 %100 %100 %100 %251251* *100 %100 %100 %100 %114114* *100 %100 %100 %100 % * 共6例樣本檢測結果不一致，RIBA結果為陰性或不確定，計統(tǒng)計時予以剔除。 研究結果預留干擾樣本干擾樣本類型： HBV HBV，HCVHCV，H

28、IVHIV，EBVEBV，自身免疫病，淋巴瘤，多發(fā)性骨髓瘤，其他腫瘤，妊娠 Elecsys vs. ArchitectElecsys vs. Architect 僅在多發(fā)性骨髓瘤樣本中發(fā)現(xiàn)： Elecsys: 1FP Architect: 1FPElecsys vs. ELISA-1Elecsys vs. ELISA-1 僅在HIV和腫瘤樣本中發(fā)現(xiàn)： Elecsy: 3FP ELISA: 1FPElecsys vs. ELISA-2Elecsys vs. ELISA-2 僅在HBV和HIV樣本中發(fā)現(xiàn)： ELISA: 1FP/1FN各組共收集920920例干擾樣本，僅出現(xiàn)8 8例假陽或假陰結果，

29、基本無干擾 * * FN: false negative FP: false positiveFN: false negative FP: false positive 研究結果預留“臨界”樣本* * Elecsys Elecsys 在所有比對組”臨界”樣本中的假陽性和假陰性結果更少 Elecsys vs. ArchitectElecsys vs. ArchitectElecsys vs. ELISA-1Elecsys vs. ELISA-1Elecsys vs. ELISA-2Elecsys vs. ELISA-2結果區(qū)間樣本數(shù)ElecsysElecsysArchitectArchitect

30、樣本數(shù)ElecsysElecsysELISA-1ELISA-1樣本數(shù)ElecsysElecsysELISA-2ELISA-2 1.0=1.0 =1.0 706 FP6 FP28 FP28 FP44441010 FP FP19 FP19 FP9 92 FP2 FP3 FP3 FP 總數(shù)72726 FP6 FP28 FP28 FP717115 FP15 FP19FP/2FN19FP/2FN15153 FP3 FP3 FP3 FP * FN: false negative FP: false positive* * 臨界樣本（檢測結果出現(xiàn)不一致結果可能性較大的區(qū)間）： Architect Archi

31、tect：0.9 COI 50.9 COI 5 ELISA ELISA：0.75 COI 30.75 COI 3 國產化學發(fā)光法：0.9 COI 50.9 COI 5具有最佳的靈敏度與特異性靈敏度為100% （MCE結果）特異性為99.88（MCE結果）有效檢出不同分期的梅毒感染即用型試劑即用型試劑18 分鐘出檢測結果分鐘出檢測結果僅需僅需10 ml 樣本量樣本量高精密度室間、儀器間、批內、批間精密度高無灰區(qū)準確區(qū)分樣本，無需重測安全安全高效高效可靠可靠Elecsys Syphilis免疫檢測降低確診試驗需求優(yōu)化工作流程較高的血清轉換特異性降低傳播風險提高檢測速度提高效率，節(jié)省成本n 梅毒流行

32、病學簡介梅毒流行病學簡介n 梅毒實驗室檢測流程梅毒實驗室檢測流程n 羅氏梅毒檢測試劑多中心研究結果羅氏梅毒檢測試劑多中心研究結果n梅毒實驗室檢測策略梅毒實驗室檢測策略主要內容梅毒實驗室檢測策略初篩試驗：初篩試驗：EIA/TPPA(TPHA)EIA/TPPA(TPHA)46CLIACLIA+ +/EIA/EIA+ +/TPPA(TPHA)/TPPA(TPHA)- - 或或CLIACLIA+ +/ /EIAEIA+ +/TPPA(TPHA)/TPPA(TPHA)- -CLIACLIA+ +/EIA/EIA+ +/TPPA(TPHA)/TPPA(TPHA)+ +RPR TiterRPR Titer確

33、認試驗：確認試驗：IgG immunoblotIgG immunoblotanti-treponemal anti-treponemal IgM testIgM test梅毒排除梅毒排除RPR Titer 1:32RPR Titer 1:32RPR Titer 1:32梅毒活動期梅毒活動期不能排除梅毒活動期不能排除梅毒活動期+ + +- - -European guideline on the management European guideline on the management of syphilis 2014of syphilis 2014梅毒實驗室檢測策略n方法選擇依據(jù)方法選擇依據(jù)n敏感性、特異性（試劑評估）敏感性、特異性（試劑評估）n操作流程（可及性）操作流程（可及性）n試劑的價格、結果時間（可接收性）試劑的價格、結果時間（可接收性）47初篩初篩目的和方法選擇目的和方法選擇規(guī)范化梅毒實驗室檢測要求n 根據(jù)目的選擇檢測方法及檢測策略。根據(jù)目的選擇檢測方法及檢測策略。n 可采用任何一類梅毒血清學檢測方法作可采用任何一類梅毒血清學檢測方法作為篩查試驗為篩查試驗。非梅毒螺旋體抗原