腫瘤動(dòng)物模型

1、 腫瘤動(dòng)物模型腫瘤動(dòng)物模型耿飛耿飛鄭雅元鄭雅元 2015342056導(dǎo)師導(dǎo)師 孔維孔維 2015.11.30腫瘤動(dòng)物模型一.自發(fā)性腫瘤動(dòng)物模型二.誘發(fā)性腫瘤動(dòng)物模型三.移植性腫瘤動(dòng)物模型及其研究方法四.人體腫瘤異種移植性腫瘤模型一、自發(fā)性腫瘤動(dòng)物模型一、自發(fā)性腫瘤動(dòng)物模型定義：定義：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物不經(jīng)人為實(shí)驗(yàn)處理而自然發(fā)生的腫瘤自然發(fā)生的腫瘤，成為自發(fā)性腫瘤實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇：高發(fā)病率的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一般選用小鼠（小鼠（mouse）常用腫瘤模型小鼠腫瘤自然發(fā)生率常用腫瘤模型小鼠腫瘤自然發(fā)生率自發(fā)性自發(fā)性腫瘤動(dòng)物腫瘤動(dòng)物模型的優(yōu)點(diǎn)模型的優(yōu)點(diǎn)1. 自然發(fā)生，腫瘤發(fā)生學(xué)與細(xì)胞學(xué)特點(diǎn)與人類腫瘤相似。2.

2、便于慢性治療及綜合治療。3. 發(fā)生條件自然，可通過細(xì)致觀察研究發(fā)現(xiàn)新的環(huán)境致癌因素及其他致癌因素；可以著重觀察遺傳因素在腫瘤發(fā)生中的作用。自發(fā)性自發(fā)性腫瘤動(dòng)物腫瘤動(dòng)物模型的缺點(diǎn)模型的缺點(diǎn)1. 腫瘤發(fā)生情況參差不齊。2. 難以短時(shí)間內(nèi)獲得大量腫瘤材料，耗時(shí)長，耗資大。3. 發(fā)生腫瘤的動(dòng)物腫瘤生長速度差異大，難以評(píng)價(jià)。二、誘發(fā)性腫瘤動(dòng)物模型二、誘發(fā)性腫瘤動(dòng)物模型定義：定義：使用致癌因素(Carcinogens)在實(shí)驗(yàn)條件下誘發(fā)動(dòng)物發(fā)生腫瘤的動(dòng)物模型。原理：原理：利用外源性致癌因素引起細(xì)胞遺傳特性異常而呈現(xiàn)出異常生長和高增殖活性，形成腫瘤。n用于誘發(fā)實(shí)驗(yàn)性腫瘤的動(dòng)物種類很多，以嚙齒動(dòng)物的使用最多、應(yīng)

3、用最廣，包括各種大鼠、小鼠、豚鼠等誘發(fā)誘發(fā)性腫瘤模型動(dòng)物選擇性腫瘤模型動(dòng)物選擇物理方法：物理方法：放射性物質(zhì)致瘤，用放射線照射或局部注射放射性同位素。化學(xué)方法：化學(xué)方法：使用化學(xué)致癌物，如苯并芘（benzpy rene）、甲基膽蒽（MC）、聯(lián)苯胺（benzidine ）、亞硝胺類（nitrosamine ）、黃曲霉素類（aflatoxin）等。生物方法：生物方法：n用能誘發(fā)動(dòng)物腫瘤的病毒致癌，如：小鼠白血病病毒，SV40病毒。n用轉(zhuǎn)基因的方法誘發(fā)動(dòng)物產(chǎn)生腫瘤，可根據(jù)啟動(dòng)子類型的不同選擇不同的發(fā)瘤器官，如用乳球蛋白啟動(dòng)子的SV40T抗原的轉(zhuǎn)基因小鼠，可誘發(fā)乳腺癌或胰腺癌。MMTV-Wnt-1轉(zhuǎn)基

4、因小鼠高發(fā)乳腺癌。誘發(fā)性腫瘤動(dòng)物模型建立方法誘發(fā)性腫瘤動(dòng)物模型建立方法 原位誘發(fā)原位誘發(fā) 致癌物直接與動(dòng)物靶組織或靶器官接觸而誘發(fā)該組織或器官發(fā)生腫瘤。 異位誘發(fā)異位誘發(fā) 將與致癌物接觸后的動(dòng)物組織或器官埋置于該動(dòng)物或另一正常動(dòng)物皮下而 產(chǎn)生的該組織或器官的腫瘤。誘發(fā)性腫瘤動(dòng)物模型建立方法誘發(fā)性腫瘤動(dòng)物模型建立方法致癌物致癌物致癌物致癌物n1.涂抹法（皮膚癌）n2.經(jīng)口給藥法（消化道或消化腺)n3.注射法n4.氣管灌注法（肺癌）n5.穿線法n6.埋藏法誘發(fā)性腫瘤模型誘發(fā)性腫瘤模型致癌物給予途徑致癌物給予途徑 1.肺癌（Carcinoma of the lung) 簡述 ：在實(shí)驗(yàn)功物身上誘發(fā)肺癌

5、，要比誘發(fā)其他腫瘤困難得多，誘癌率低，呼吸道給藥的方法常常誘發(fā)多種肺外腫瘤而不是肺腫瘤。 方法 ： 二乙基硝胺(DEN)誘發(fā)小鼠肺癌：小鼠每周皮下注射1DEN水溶液1次，每次劑量為56mgkg； 烏拉坦誘發(fā)肺腺癌：小鼠(A系，1-1.5月齡)每次每只腹腔注入馬拉坦生理鹽水液0.1-0.3ml，間隔3-5日再注，共注2-3個(gè)月每只小鼠用量約為100mg誘發(fā)性腫瘤模型誘發(fā)性腫瘤模型舉例舉例 特點(diǎn) ： DEN總量達(dá)868mg，觀察時(shí)間為100天，發(fā)癌率可達(dá)40 ，DEN總量達(dá)1176mg，觀察時(shí)間為半年時(shí)，發(fā)癌率可達(dá)94 ，其中支氣管鱗狀細(xì)胞癌占41。 烏拉坦注后3個(gè)月肺腺癌發(fā)生率為100，且多數(shù)為

6、多發(fā)性，誘發(fā)肺腫瘤的部位和組織分型與人類肺腫瘤相近似。 2.食管癌（Carcinoma of esophagus) 簡述 ：亞硝胺在體內(nèi)經(jīng)過代謝，產(chǎn)生重碳烷，使核酸或其他分子發(fā)生烷化而致癌不對(duì)稱亞硝胺口服或胃腸外給藥，均能誘發(fā)大鼠食管癌。 方法 ： 甲基芐基亞硝胺(MBNA)誘發(fā)食管癌：將1MBNA溶液加在少量的粉末狀飼料中，攪拌均勻，出1月齡以上Wistar大鼠自由攝食結(jié)藥量每天0.751.5mg/kg 二烴黃樟素誘發(fā)大鼠食管癌模型：在大鼠飼料中加入微量（1/25001/10000）黃樟素喂養(yǎng)大鼠誘發(fā)率達(dá)20一70 特點(diǎn)及應(yīng)用 ：MBNA誘發(fā)的食管癌可見食管鱗狀細(xì)胞癌的組織，但很少發(fā)生轉(zhuǎn)移；

7、亞硝胺致癌性較強(qiáng)，大劑量1次給藥，即可致癌。 3.肝癌（Carcinoma of the liver) 簡述 ：常用口服致肝癌的物質(zhì)有乙基亞硝胺(DEN)，4-2甲基氨基偶氮苯(DBA)、2-乙酰氨基酸(2AAF)亞胺基偶氮甲苯OAAT和黃曲霉素。 方法 ： DEN誘發(fā)大鼠肝癌：取體重250g左右的封閉群大鼠給與025DEN水溶液025-1mL灌胃或稀釋10倍放在飲水瓶中自由飲水，劑量為每天2-10ml/kg，喂養(yǎng)半年左右 黃曲霉素誘發(fā)大鼠肝癌：每月飼料中含00010.015mg/kg混入飼料中喂6個(gè)月左右。 特點(diǎn)及應(yīng)用 ： DEN誘發(fā)大鼠致癌率為70DBA誘癌率為60，黃曲霉素誘發(fā)大鼠肝癌發(fā)

8、生率為80，此種方法從病因?qū)W角度分析，與人體腫瘤較為近似，故此類模型常用于腫瘤特點(diǎn)的深入研究。 4.宮頸癌（Carvical carcinoma) 用穿線法將附有0.1mg二甲基膽蒽（DMC）的棉沙線結(jié)穿入雌性小白鼠的宮頸部，并固定縫線。觀察半年左右處死動(dòng)物，取宮頸組織。三.移植性腫瘤動(dòng)物模型及其研究方法定義：定義：模型是指將動(dòng)物或人體腫瘤移植到同種或異種動(dòng)物體內(nèi)連續(xù)傳代而形成移植性腫瘤動(dòng)物的腫瘤實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇：移植性腫瘤常用動(dòng)物為小鼠、大鼠和地鼠腫瘤細(xì)胞的選擇：腫瘤細(xì)胞的選擇：篩選抗癌藥物時(shí)，最好選用3類瘤株，及肉瘤、腹水型腫瘤和白血病株。在眾多移植性腫瘤中，小鼠Lewis肺癌、

9、小鼠黑色素瘤B16及小鼠白血病P388是目前最受重視和應(yīng)用最廣的。接種方法（無菌操作）接種方法（無菌操作）1.實(shí)體瘤 制備瘤塊凍存的瘤株凍存的瘤株 瘤源動(dòng)物瘤源動(dòng)物 710d 增殖增殖獲得瘤塊移入宿主體內(nèi)移入宿主體內(nèi)給動(dòng)物接種給動(dòng)物接種受體動(dòng)物受體動(dòng)物實(shí)體瘤接種法實(shí)體瘤接種法：瘤塊接種法、瘤細(xì)胞懸液接種法、培養(yǎng)細(xì)胞接種法、活細(xì)胞接 種方法等瘤塊接種法選取接種后710d生長狀態(tài)良好的瘤源動(dòng)物，頸椎脫臼處死，消毒操作部位皮膚。切開皮膚，剝離出接種用的瘤塊，剔除非腫瘤組織和壞死組織，選取生長良好而無變性壞死、淡紅色（黑色素瘤則呈黑色或黑紫色）、魚肉裝的瘤組織，在無菌平皿內(nèi)剪成2mm3小塊。平皿放置在

10、冰塊上，平皿內(nèi)放置少許滅菌的PBS或其它營養(yǎng)液。用無菌套管針抽吸瘤塊，接種于同種受體動(dòng)物腋窩皮下（接種部位皮膚應(yīng)先消毒）。也可取出腫瘤后切成小塊，在受體動(dòng)物的腋下剪開一個(gè)小口，用無齒眼科鑷夾取瘤塊，送入切口內(nèi)。腋窩部皮膚松弛，能允許腫瘤生長的較大，宿主動(dòng)物的壽命也可延長。接種操作的時(shí)間盡可能縮短，從瘤塊取材到接種結(jié)束一般應(yīng)在30min內(nèi)完成。瘤細(xì)胞懸液接種法每次接種的動(dòng)物數(shù)量較多時(shí)可采用此法。具體方法是：無菌操作取出瘤塊，將數(shù)個(gè)瘤塊混合后剪成小塊，放入玻璃勻漿器中，加無菌生理鹽水向一個(gè)方向轉(zhuǎn)動(dòng)研磨后，經(jīng)濾網(wǎng)過濾，加生理鹽水稀釋成1:31:4（腫瘤g：生理鹽水ml）的瘤細(xì)胞懸液，用臺(tái)盼蘭染色法計(jì)

11、數(shù)活細(xì)胞數(shù)，用1ml注射器注射到接種部位，每個(gè)接種點(diǎn)接種0.2ml(一般含11061107個(gè)細(xì)胞數(shù)）。通常接種到腋窩皮下，每只動(dòng)物可選用多個(gè)接種點(diǎn)。瘤細(xì)胞懸液接種法將對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化脫壁后，用PBS或者生理鹽水以1000r/min離心10min，洗滌2次，洗掉細(xì)胞中胰蛋白酶和培養(yǎng)液中血清等成分，用臺(tái)盼藍(lán)拒染法計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)，用生理鹽水將腫瘤稀釋成一定濃度的細(xì)胞懸液，細(xì)胞懸液置于冰上，使用1ml注射器在每個(gè)接種點(diǎn)接種0.2ml(含11061107個(gè)細(xì)胞),應(yīng)盡快注射到接種部位。2.腹水瘤腫瘤細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇腫瘤細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇對(duì)腫瘤細(xì)胞或瘤株進(jìn)行冷凍保存可以使其得以長期使用，

12、防止退化或變異，保存不同代細(xì)胞的特征。一般在液氮中保存12年，細(xì)胞存活率可達(dá)80%90%。1.凍存方法：凍存方法：取對(duì)數(shù)生長期增殖旺盛的細(xì)胞，胰蛋白酶消化、離心、洗滌， 用含7份培養(yǎng)液、2份小牛血清、1份DMSO配成（15）*106個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)入細(xì)胞凍存管。將凍存管于4放置30min,-20放置4h，-70過夜，然后放入液氮中。2.復(fù)蘇方法：復(fù)蘇方法：取出凍存管，迅速放入3840水浴中，并不停搖動(dòng)使其在一分內(nèi)全部融化，500800r/min離心5min,棄上清，加入培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。次日更換培養(yǎng)液，以后按常規(guī)培養(yǎng)。四.人體腫瘤異種移植性腫瘤模型這種模型使用人的腫瘤細(xì)胞，在病理

13、組織形態(tài)和遺傳特征等方面均與人類腫瘤相同，用這種模型可以比較直接的研究人類腫瘤的生物學(xué)特性及抗腫瘤藥物。常用的宿主動(dòng)物：常用的宿主動(dòng)物：裸小鼠和C57BL/6小鼠裸小鼠作為移植宿主裸小鼠作為移植宿主實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：在SPF屏障系統(tǒng)內(nèi)繁殖生長的BALB/c裸小鼠，68周齡，體重2122g。瘤源：瘤源：來源大致分兩類，一類是人的腫瘤細(xì)胞株，另一類是源于人體腫瘤組織快的癌細(xì)胞。常用的人癌裸鼠細(xì)胞株、接種方法和最佳生長期為:結(jié)腸癌HCT-8（勻漿，3周）、胃癌MGC-803(組織塊，45周）、肝癌BEL-7402(組織塊，4周）、小細(xì)胞肺癌LTEP-SM1(組織塊，45周）、乳腺癌MCF-7(組織

14、塊，45周）等操作方法（例：人胃腺癌操作方法（例：人胃腺癌SGC-7901)：1.超凈臺(tái)內(nèi)將移植瘤剪成23mm3大小的瘤塊，用套管針接種在BALB/c裸小鼠右側(cè)腋窩皮下2.接種24h后隨機(jī)分組，開始給予受試藥進(jìn)行實(shí)驗(yàn)治療，試驗(yàn)周期6周左右3.停藥次日，稱體重，剝?nèi)∧[瘤并稱重，計(jì)算瘤重抑制率。觀察指標(biāo)與療效評(píng)價(jià)：觀察指標(biāo)與療效評(píng)價(jià)：1.動(dòng)物在接種腫瘤后6周左右形成1g以上的瘤塊（平均瘤重），則表明移植腫瘤成功2.如出現(xiàn)20%小鼠的瘤重小于400mg，則表示腫瘤生長不良3.在藥物治療期間，如給藥組小鼠死亡率超過20%或剝?nèi)∧[瘤后平均體重下降超過15%（自身對(duì)照），表示藥物存在毒性，應(yīng)當(dāng)減量重新實(shí)驗(yàn)4.藥效可根據(jù)給藥后瘤重抑制率來評(píng)價(jià)，瘤重抑制率大于30%，并經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，表示該受試藥有苗頭。重復(fù)3次，如療效穩(wěn)定，評(píng)定該藥有一定療效注：注：腫瘤模型形成時(shí)間較長，需3040d甚至更長。 在異種移植瘤實(shí)驗(yàn)中，還有一種正位移植，即將人癌組織或細(xì)胞按其在人體內(nèi)的原發(fā)部位，接種于相應(yīng)的器官，有別于通常的皮下接種（異位接種）免疫功能抑制的大鼠作為移植宿主免疫功能抑制的大鼠作為移植宿主實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：體重120160g的Wistar大鼠操作方法（操作方法（例：人胃癌細(xì)胞株）例：人胃癌細(xì)胞株）：1.大鼠分籠飼養(yǎng)，皮下注射具有免疫抑制作用的阿糖胞苷200m