第八章培養(yǎng)基滅菌及發(fā)酵設(shè)備

1、 第八章第八章 培養(yǎng)基滅菌及培養(yǎng)基滅菌及發(fā)酵設(shè)備發(fā)酵設(shè)備一一 培養(yǎng)基滅菌及滅菌設(shè)備培養(yǎng)基滅菌及滅菌設(shè)備培養(yǎng)基滅菌的目的：保證所選用的培養(yǎng)基沒有受到其培養(yǎng)基滅菌的目的：保證所選用的培養(yǎng)基沒有受到其它雜菌的污染它雜菌的污染染菌產(chǎn)生的不良后果？染菌產(chǎn)生的不良后果？滅菌的方法有：化學(xué)藥劑滅菌、射線滅菌、干熱滅滅菌的方法有：化學(xué)藥劑滅菌、射線滅菌、干熱滅菌、濕熱滅菌、過濾除菌菌、濕熱滅菌、過濾除菌培養(yǎng)基的滅菌方式：培養(yǎng)基的滅菌方式：1.濕熱滅菌：濕熱滅菌：2.過濾除菌過濾除菌3.微波滅菌微波滅菌1.濕熱滅菌法濕熱滅菌法是利用是利用水蒸氣的熱量水蒸氣的熱量將物品滅菌。將物品滅菌。水蒸氣具有穿透能力強(qiáng)，易于

2、傳導(dǎo)熱量的優(yōu)點(diǎn)。水蒸氣具有穿透能力強(qiáng)，易于傳導(dǎo)熱量的優(yōu)點(diǎn)。濕熱濕熱更容易將微生物細(xì)胞中蛋白質(zhì)的更容易將微生物細(xì)胞中蛋白質(zhì)的氫鍵氫鍵打斷，使其發(fā)生變性打斷，使其發(fā)生變性凝固。凝固。優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：經(jīng)濟(jì)、快速經(jīng)濟(jì)、快速不同微生物菌株，所需濕熱滅菌的溫度和時(shí)間不一樣。不同微生物菌株，所需濕熱滅菌的溫度和時(shí)間不一樣。多數(shù)細(xì)菌和真菌營(yíng)養(yǎng)體在多數(shù)細(xì)菌和真菌營(yíng)養(yǎng)體在60左右，左右，5-10min死亡；死亡；真菌和酵母菌的孢子，真菌和酵母菌的孢子，80 以上才會(huì)死亡；以上才會(huì)死亡；嗜熱脂肪芽孢桿菌的芽孢在嗜熱脂肪芽孢桿菌的芽孢在121 ,12min才能死亡才能死亡常見的濕熱滅菌有以下幾種：常見的濕熱滅菌有以下幾種

3、：1）常規(guī)加壓滅菌法）常規(guī)加壓滅菌法因無(wú)法了解待滅菌培養(yǎng)基中微生物的熱致死特性，因無(wú)法了解待滅菌培養(yǎng)基中微生物的熱致死特性，常假常假設(shè)雜菌是嗜熱脂肪芽孢桿菌的芽孢設(shè)雜菌是嗜熱脂肪芽孢桿菌的芽孢；滅菌工藝是滅菌工藝是0.1MPa，維持，維持15-30min(滅菌是靠溫度）滅菌是靠溫度）2）連續(xù)滅菌法）連續(xù)滅菌法3）巴斯德消毒法）巴斯德消毒法一般一般60-80 ,15s-30min;現(xiàn)在超高溫巴斯德滅菌法，現(xiàn)在超高溫巴斯德滅菌法，140 ,3-4s，急劇冷卻至，急劇冷卻至75 4）間歇滅菌法：）間歇滅菌法：80-100 ,15-60min,室溫過夜，重復(fù)三室溫過夜，重復(fù)三次次2.過濾除菌法過濾除菌

4、法含有酶、血清、維生素、氨基酸等容易熱失活的培養(yǎng)基，含有酶、血清、維生素、氨基酸等容易熱失活的培養(yǎng)基，可以采用此法。可以采用此法。過濾介質(zhì)過濾介質(zhì)有膜材料：醋酸纖維素、硝酸纖維素、聚醚砜、有膜材料：醋酸纖維素、硝酸纖維素、聚醚砜、尼龍、聚丙烯腈等尼龍、聚丙烯腈等深層過濾材料：石棉板、燒結(jié)陶瓷、燒結(jié)金屬等深層過濾材料：石棉板、燒結(jié)陶瓷、燒結(jié)金屬等過濾器過濾器主要有兩類：主要有兩類：絕對(duì)過濾器絕對(duì)過濾器：過濾介質(zhì)呈膜狀，：過濾介質(zhì)呈膜狀，濾孔濾孔比要除去的顆粒直徑比要除去的顆粒直徑小，理論上可以完全除去微生物。去除機(jī)制為小，理論上可以完全除去微生物。去除機(jī)制為攔截?cái)r截作用。作用。另一類是另一類是深

5、層過濾器深層過濾器：空隙的直徑比要除去顆粒的直徑大，：空隙的直徑比要除去顆粒的直徑大，由氈毛、棉花、石棉和玻璃纖維組成。由氈毛、棉花、石棉和玻璃纖維組成。工作機(jī)制是通過工作機(jī)制是通過慣性碰撞、擴(kuò)散和吸附作用慣性碰撞、擴(kuò)散和吸附作用除菌。除菌。過濾介質(zhì)有兩類：一類是棉花纖維、玻璃纖維、合成纖維和過濾介質(zhì)有兩類：一類是棉花纖維、玻璃纖維、合成纖維和顆粒狀活性炭等，要填充在一定的容器中定形；顆粒狀活性炭等，要填充在一定的容器中定形；一類是已制成板狀或管狀，如石棉板和燒結(jié)材料等。一類是已制成板狀或管狀，如石棉板和燒結(jié)材料等。實(shí)驗(yàn)室常用的濾器實(shí)驗(yàn)室常用的濾器孔徑孔徑是是0.45微米和微米和0.22微米。

6、微米。3.微波滅菌法微波滅菌法主要是利用微波（主要是利用微波（300MHz3000GHz的的電磁波電磁波，是無(wú)，是無(wú)線電波中一個(gè)有限線電波中一個(gè)有限頻帶頻帶的簡(jiǎn)稱，即的簡(jiǎn)稱，即波長(zhǎng)波長(zhǎng)在在0.1毫米毫米1米米之間的電磁波）的熱效應(yīng)之間的電磁波）的熱效應(yīng)微生物在微波電磁場(chǎng)的作用下，吸收微波的能量，產(chǎn)生微生物在微波電磁場(chǎng)的作用下，吸收微波的能量，產(chǎn)生熱效應(yīng)，同時(shí)微波造成熱效應(yīng)，同時(shí)微波造成分子的加速運(yùn)動(dòng)分子的加速運(yùn)動(dòng)使細(xì)胞內(nèi)部受到使細(xì)胞內(nèi)部受到損害，從而導(dǎo)致微生物死亡。損害，從而導(dǎo)致微生物死亡。特點(diǎn)：加熱均勻、熱能利用率高，穿透能力強(qiáng)，加熱時(shí)特點(diǎn)：加熱均勻、熱能利用率高，穿透能力強(qiáng)，加熱時(shí)間短。間

7、短。主要內(nèi)容主要內(nèi)容一、空罐滅菌一、空罐滅菌二、滅菌有關(guān)理論二、滅菌有關(guān)理論三、分批滅菌三、分批滅菌四、連續(xù)滅菌四、連續(xù)滅菌一、空罐滅菌一、空罐滅菌1 1、目的：、目的： 1 1）消除罐內(nèi)死角，確保下一批發(fā)酵的成功）消除罐內(nèi)死角，確保下一批發(fā)酵的成功 2 2）殺滅與罐直接相通的各管路、閥門的微生物）殺滅與罐直接相通的各管路、閥門的微生物 3 3）殺滅上批發(fā)酵的活的微生物，減輕環(huán)境污染）殺滅上批發(fā)酵的活的微生物，減輕環(huán)境污染 2、步驟： （熱蒸汽法）（熱蒸汽法）1）先徹底清洗作用：a a）有利于消除死角）有利于消除死角 b b）免于料受熱（尤其是干熱的部位）干）免于料受熱（尤其是干熱的部位）干

8、焦于罐體、管或閥門焦于罐體、管或閥門2）從底部通入蒸汽3）排冷氣4）升壓 打開各個(gè)需滅菌的管路、放氣閥等（如打開各個(gè)需滅菌的管路、放氣閥等（如 接接 種管、取樣管、空氣進(jìn)管、流量計(jì)等）種管、取樣管、空氣進(jìn)管、流量計(jì)等）5）保壓 通常通常1kg/cm1kg/cm2 2, 30, 3060min60min6) 降溫 關(guān)閉各放氣閥，切斷汽源，慢慢放氣；關(guān)閉各放氣閥，切斷汽源，慢慢放氣； 或自然冷卻，或泵循環(huán)水加速冷卻或自然冷卻，或泵循環(huán)水加速冷卻Notes: a a）確保無(wú)死角產(chǎn)生）確保無(wú)死角產(chǎn)生 b b）也可采用甲醛蒸煮或熏蒸的方法）也可采用甲醛蒸煮或熏蒸的方法 c c）勿激碎視鏡）勿激碎視鏡二、

9、培養(yǎng)基滅菌的有關(guān)理論二、培養(yǎng)基滅菌的有關(guān)理論一）加熱滅菌原理一）加熱滅菌原理1 1、微生物的熱阻、微生物的熱阻 每一種微生物都有一定的生長(zhǎng)溫度范圍；每一種微生物都有一定的生長(zhǎng)溫度范圍； 當(dāng)微生物處在最低生長(zhǎng)溫度以下，代謝作用幾乎停止，而當(dāng)微生物處在最低生長(zhǎng)溫度以下，代謝作用幾乎停止，而處于休眠狀態(tài)；當(dāng)溫度超過最高限度時(shí)，細(xì)胞中原生質(zhì)體和處于休眠狀態(tài)；當(dāng)溫度超過最高限度時(shí)，細(xì)胞中原生質(zhì)體和酶的基本成分就發(fā)生不可逆的變性，使微生物死亡。酶的基本成分就發(fā)生不可逆的變性，使微生物死亡。 微生物 相對(duì)熱阻細(xì)菌和酵母的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞 1細(xì)菌芽孢 3106 霉菌孢子 2-10病毒及噬菌體 1-5某些微生物對(duì)濕熱的

10、相對(duì)熱阻（與大腸桿菌比較）不同種類微生物對(duì)熱的抵抗力不同。不同種類微生物對(duì)熱的抵抗力不同。微生物對(duì)熱的抵抗力稱為微生物對(duì)熱的抵抗力稱為熱阻（heat resistance）。下面介紹與熱阻相關(guān)的幾個(gè)概念1）致死溫度（Death temperature）殺死微生物的極限溫度稱為致死溫度。殺死微生物的極限溫度稱為致死溫度。2）熱力致死時(shí)間 (Thermal Death Time; TDT) 在特定條件、特定溫度下，殺死某種微生物在特定條件、特定溫度下，殺死某種微生物所需的最短時(shí)間。所需的最短時(shí)間。e.g 傷寒桿菌傷寒桿菌58 30min 變形桿菌變形桿菌55 60min3）D值 -利用一定溫度進(jìn)行

11、加熱利用一定溫度進(jìn)行加熱, 90%, 90%的活菌被殺死時(shí)所的活菌被殺死時(shí)所需的時(shí)間需的時(shí)間(min)(min)即為即為D D值。又稱值。又稱1/101/10衰減時(shí)間。衰減時(shí)間。 DD = 10 min0 10 20 30 40 50 60加熱時(shí)間加熱時(shí)間 (min)10510410310210106殘殘 存存 活活 細(xì)細(xì) 胞胞 數(shù)數(shù)殘存活細(xì)胞曲線例： 含有某種細(xì)菌的懸液，含菌數(shù)為含有某種細(xì)菌的懸液，含菌數(shù)為10105 5/ml,/ml,在在100100（212212F F）的）的水浴溫度中，活菌數(shù)降低到水浴溫度中，活菌數(shù)降低到10104 4/ml/ml時(shí)所需的時(shí)間為時(shí)所需的時(shí)間為10min,

12、10min,則該則該菌的菌的D D值即為值即為10min10min。 D D100100 = 10min = 10min 如果加熱的溫度為如果加熱的溫度為121121，則常寫成，則常寫成DrDr4）Z 值 在加熱致死時(shí)間曲線中，加熱時(shí)間縮短在加熱致死時(shí)間曲線中，加熱時(shí)間縮短90%90%所需所需升高的溫度，即為升高的溫度，即為Z Z值。值。100 11510010加加 熱時(shí)熱時(shí) 間間 （min)加熱溫度加熱溫度 （）加熱致死時(shí)間曲線 ZZ = 152 2、微生物的熱死規(guī)律、微生物的熱死規(guī)律對(duì)數(shù)殘留定律對(duì)數(shù)殘留定律 微生物的熱死是指微生物的受熱失活，但物理性質(zhì)不變。微生物的熱死是指微生物的受熱失活

13、，但物理性質(zhì)不變。 微生物雖然是一復(fù)雜的高分子體系，但受熱死亡是由于微生物雖然是一復(fù)雜的高分子體系，但受熱死亡是由于蛋白質(zhì)變性所致。蛋白質(zhì)變性所致。 在一定溫度下，微生物熱死遵循分子反應(yīng)速度理論。在一定溫度下，微生物熱死遵循分子反應(yīng)速度理論。對(duì)數(shù)殘留定律的概念： 數(shù)學(xué)表達(dá)式：數(shù)學(xué)表達(dá)式：- dN/d = NN 培養(yǎng)基中活的微生物個(gè)數(shù)；培養(yǎng)基中活的微生物個(gè)數(shù)； 時(shí)間（時(shí)間（s）; 比死亡速率比死亡速率（s-1） (死亡速率常數(shù)死亡速率常數(shù))dN/d 微生物的瞬間變化率，即死亡速率微生物的瞬間變化率，即死亡速率 對(duì)微生物進(jìn)行濕熱滅菌時(shí)，培養(yǎng)基中的微生物受熱死對(duì)微生物進(jìn)行濕熱滅菌時(shí)，培養(yǎng)基中的微生物

14、受熱死亡的速率與殘存的微生物數(shù)量成正比，這就是對(duì)數(shù)殘留定亡的速率與殘存的微生物數(shù)量成正比，這就是對(duì)數(shù)殘留定律。律。 若開始滅菌（ = 0）時(shí)，培養(yǎng)基中活的微生物數(shù)為N0 = 2.303 logN0/N /- dN/d = NlnN/N0 = - 積分積分2.303logN0/N = or = 2.303 lgN0/N /可見滅菌時(shí)間取決于污染程度可見滅菌時(shí)間取決于污染程度(N(N0 0) )、滅菌程度、滅菌程度（殘留菌數(shù)（殘留菌數(shù)N N）和）和 值值 在培養(yǎng)基中有各種各樣的微生物，不可能逐一加以考慮。在培養(yǎng)基中有各種各樣的微生物，不可能逐一加以考慮。一般只考慮芽孢細(xì)菌和細(xì)菌的芽孢數(shù)之和作為計(jì)算

15、依據(jù)一般只考慮芽孢細(xì)菌和細(xì)菌的芽孢數(shù)之和作為計(jì)算依據(jù)。 滅菌程度，即殘留菌數(shù)，如果要求完全徹底滅菌，即滅菌程度，即殘留菌數(shù)，如果要求完全徹底滅菌，即N = N = 0 0，則，則 為為，上式無(wú)意義，事實(shí)上也不可能。，上式無(wú)意義，事實(shí)上也不可能。 一般取一般取N = 0.001N = 0.001，即，即10001000次滅菌中有次滅菌中有1 1 次失敗。次失敗。例： 有一發(fā)酵罐內(nèi)裝有一發(fā)酵罐內(nèi)裝40m40m3 3培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基，在121121溫度下進(jìn)行實(shí)罐滅溫度下進(jìn)行實(shí)罐滅菌。原污染程度為每菌。原污染程度為每mlml有有2 210105 5個(gè)耐熱細(xì)菌芽孢，個(gè)耐熱細(xì)菌芽孢， 121121時(shí)滅時(shí)滅

16、菌速度常數(shù)為菌速度常數(shù)為1.8min1.8min1 1。求滅菌失敗幾率為。求滅菌失敗幾率為0.0010.001時(shí)所需的滅時(shí)所需的滅菌時(shí)間。菌時(shí)間。解：解： N0 = 40106 2105 = 8 1012 (個(gè)個(gè)) N = 0.001; = 1.8 (min1) =2.303 lgN0N=2.3031.8lg(81015)= 20.34 (min)3 3、死亡速率常數(shù)、死亡速率常數(shù) （比死亡速率）（比死亡速率） 死亡速率死亡速率 常數(shù)常數(shù) 是微生物耐熱性的一種特征，它隨是微生物耐熱性的一種特征，它隨微生物種類和滅菌溫度而異。微生物種類和滅菌溫度而異。 相同溫度下，相同溫度下， 值越小，則此微生

17、物越耐熱。值越小，則此微生物越耐熱。 在在121121，細(xì)菌芽孢的，細(xì)菌芽孢的 值約為值約為1 1minmin-1 -1, ,而營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的而營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的 值值為為10-1010-101010minmin-1 -1。細(xì)菌芽孢名稱值 min-1枯草芽孢桿菌枯草芽孢桿菌FS5230FS5230硬脂嗜熱芽孢桿菌硬脂嗜熱芽孢桿菌FS1518FS1518硬脂嗜熱芽孢桿菌硬脂嗜熱芽孢桿菌FS617FS617產(chǎn)氣梭狀芽孢桿菌產(chǎn)氣梭狀芽孢桿菌PA3679PA36793.8-2.63.8-2.60.770.772.92.91.81.8121某些細(xì)菌芽孢的值4、培養(yǎng)基滅菌溫度的選擇 培養(yǎng)基滅菌過程中，除微生物被殺死外

18、，還伴隨著培養(yǎng)基培養(yǎng)基滅菌過程中，除微生物被殺死外，還伴隨著培養(yǎng)基成分被破壞，在加熱下氨基酸、維生素等受破壞。成分被破壞，在加熱下氨基酸、維生素等受破壞。 培養(yǎng)基滅菌時(shí)，必須選擇既能達(dá)到滅菌目的，又能使培養(yǎng)培養(yǎng)基滅菌時(shí)，必須選擇既能達(dá)到滅菌目的，又能使培養(yǎng)基成分破壞減至最少的條件?；煞制茐臏p至最少的條件。 滅菌過程微生物死亡屬于一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)類型（從對(duì)數(shù)殘滅菌過程微生物死亡屬于一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)類型（從對(duì)數(shù)殘留定律表達(dá)式可知）。留定律表達(dá)式可知）。 在其它條件不變時(shí)，比死亡速率在其它條件不變時(shí)，比死亡速率 與溫度的關(guān)系可用阿侖尼與溫度的關(guān)系可用阿侖尼烏斯方程式表示。烏斯方程式表示。Svante

19、August Arrhenius was a Swedish physical chemist best known was a Swedish physical chemist best known for his theory that electrolytes, certain for his theory that electrolytes, certain substances that dissolve in water to yield a substances that dissolve in water to yield a solution that conducts el

20、ectricity, are solution that conducts electricity, are separated, or dissociated, into electrically separated, or dissociated, into electrically charged particles, or ions, even when there is charged particles, or ions, even when there is no current flowing through the solution. In no current flowin

21、g through the solution. In 1903 he was awarded the Nobel Prize for 1903 he was awarded the Nobel Prize for Chemistry.Chemistry. = A eR TEArrhenius equationA A 比例常數(shù)；比例常數(shù)；E E 殺死細(xì)菌所需的活化能，殺死細(xì)菌所需的活化能，( ( E)E) （4.18 J/mol4.18 J/mol）; ;T T 絕對(duì)溫度，絕對(duì)溫度，(K)(K)R R 氣體常數(shù)，氣體常數(shù)，1.9781.9784.18 J/(molK)4.18 J/(molK)e

22、 2.71 (exp)e 2.71 (exp) = A eR TElg = + lgAE2.303RT以以lg lg 對(duì)對(duì)1/T1/T作圖，得一直線，其斜率為作圖，得一直線，其斜率為-E/2.303R-E/2.303R，截距為，截距為lgAlgA，從斜率和截距科求得從斜率和截距科求得A A和和E E值。值。1/Tlg 截距 = lgA斜率 = E/2.303R培養(yǎng)基成分受熱破壞是化學(xué)分解反應(yīng)，為一級(jí)動(dòng)力學(xué)反應(yīng)：培養(yǎng)基成分受熱破壞是化學(xué)分解反應(yīng)，為一級(jí)動(dòng)力學(xué)反應(yīng)：- dC / d = CC 對(duì)熱不穩(wěn)定物質(zhì)的濃度, (mol/L); 分解速率常數(shù) （s1）； 分解反應(yīng)時(shí)間 （s） 隨反應(yīng)物質(zhì)種類和

23、溫度不同隨反應(yīng)物質(zhì)種類和溫度不同在化學(xué)反應(yīng)中，其他條件不變，在化學(xué)反應(yīng)中，其他條件不變， 和溫度的關(guān)系也可用和溫度的關(guān)系也可用阿阿侖尼烏斯方程表示：侖尼烏斯方程表示： = A eR TEA A 比例常數(shù)；比例常數(shù)；E E 分解活化能，分解活化能，( ( E) E) （4.18 J/mol4.18 J/mol）; ;T T 絕對(duì)溫度，絕對(duì)溫度，(K)(K)R R 氣體常數(shù)，氣體常數(shù)，1.9781.9784.18 J/(molK)4.18 J/(molK)e 2.71 (exp)e 2.71 (exp) 1= A eR T1E 2= A eER T2相除取對(duì)數(shù)相除取對(duì)數(shù)ln 2 1= E 1 1R

24、 T1 T2 在滅菌時(shí)，當(dāng)溫度變化，菌死亡速率常數(shù)在滅菌時(shí)，當(dāng)溫度變化，菌死亡速率常數(shù) 和培養(yǎng)基成分破壞速率常數(shù)和培養(yǎng)基成分破壞速率常數(shù) 都變化。都變化。溫度由溫度由T T1 1升高到升高到T T2 2， 值分別為：值分別為：同樣，滅菌時(shí)培養(yǎng)基成分的破壞也可得類似關(guān)系：同樣，滅菌時(shí)培養(yǎng)基成分的破壞也可得類似關(guān)系：ln 2 1 = R T1 T2E 1 1ln( 2 / 1)ln( 2 / 1)EE上面兩式相除，得上面兩式相除，得由于滅菌的E大于培養(yǎng)基成分分解的E名稱E (J/mol)葉酸葉酸泛酸泛酸維生素維生素B12B12維生素維生素B1B1嗜熱脂肪芽孢桿菌嗜熱脂肪芽孢桿菌枯草桿菌枯草桿菌肉毒

25、梭菌肉毒梭菌70.370.387.987.996.796.792.192.1283283318318343343因此ln 2/ 1ln 2/ 1 即隨著溫度的上升，滅菌的速度常數(shù)的增加倍數(shù)大于培養(yǎng)即隨著溫度的上升，滅菌的速度常數(shù)的增加倍數(shù)大于培養(yǎng)基成分破壞的增加倍數(shù)?；蛘哒f，當(dāng)滅菌溫度上升時(shí)，微生基成分破壞的增加倍數(shù)?；蛘哒f，當(dāng)滅菌溫度上升時(shí)，微生物殺滅速度的上升超過培養(yǎng)基成分破壞的速度。物殺滅速度的上升超過培養(yǎng)基成分破壞的速度。 根據(jù)這一理論，培養(yǎng)基滅菌采用高溫短時(shí)間的方法，有利于減少營(yíng)養(yǎng)成分的破壞。 滅菌溫度/ 滅菌時(shí)間/min 維生素B1破壞量/%100 400 99.3110 36 6

26、7115 15 50120 4 27130 0.5 8145 0.08 2150 0.01 1二）影響培養(yǎng)基滅菌的主要因素二）影響培養(yǎng)基滅菌的主要因素1、微生物熱阻 （前述）2、pH 微生物在微生物在pH6.0pH6.08.08.0范圍內(nèi)耐熱性最大范圍內(nèi)耐熱性最大 pHpH低于低于6.06.0時(shí)，氫離子極易滲入微生物細(xì)胞，從而改時(shí)，氫離子極易滲入微生物細(xì)胞，從而改變細(xì)胞的生理反應(yīng)而促進(jìn)其死亡，故培養(yǎng)基酸度愈高，變細(xì)胞的生理反應(yīng)而促進(jìn)其死亡，故培養(yǎng)基酸度愈高，則所需的殺菌時(shí)間愈短。則所需的殺菌時(shí)間愈短。影響培養(yǎng)基滅菌的主要因素（影響培養(yǎng)基滅菌的主要因素（continued） 溫度 孢子數(shù) 滅菌時(shí)

27、間 (min) () (個(gè)/ml) pH=6.1 5.3 5.0 4.7 4.5120 10000 8 7 5 3 3 115 10000 25 25 16 13 13110 10000 70 65 35 30 24100 10000 740 720 180 150 150 pH對(duì)滅菌時(shí)間的影響影響培養(yǎng)基滅菌的主要因素（影響培養(yǎng)基滅菌的主要因素（continued）3、菌的濃度濃度越高，所需滅菌時(shí)間越長(zhǎng)濃度越高，所需滅菌時(shí)間越長(zhǎng)例如： 如肉毒梭狀芽孢桿菌，在105濕熱滅菌時(shí)間 芽孢桿菌數(shù)芽孢桿菌數(shù)/ml /ml 時(shí)間時(shí)間 (min)(min) 9 910108 8 48 9 910106 6

28、36 9 910104 4 20 9 910102 2 14 9 9 2影響培養(yǎng)基滅菌的主要因素（影響培養(yǎng)基滅菌的主要因素（continued）4、 培養(yǎng)基成分 油脂、糖類及一定濃度的蛋白質(zhì)會(huì)增加微生物的耐熱性 因高濃度有機(jī)物會(huì)環(huán)繞細(xì)菌的四周形成一層薄膜，影響熱的因高濃度有機(jī)物會(huì)環(huán)繞細(xì)菌的四周形成一層薄膜，影響熱的傳入。傳入。 而高濃度的鹽類、色素等則削弱其抗性影響培養(yǎng)基滅菌的主要因素（影響培養(yǎng)基滅菌的主要因素（continued）5、泡沫 泡沫中的空氣形成隔熱層，使熱量難以滲透進(jìn)去殺死其泡沫中的空氣形成隔熱層，使熱量難以滲透進(jìn)去殺死其中潛伏的微生物；中潛伏的微生物； 易產(chǎn)生泡沫的培養(yǎng)基在滅菌

29、時(shí)，可加入少量消泡劑。易產(chǎn)生泡沫的培養(yǎng)基在滅菌時(shí)，可加入少量消泡劑。6、顆粒 顆粒小，滅菌容易，顆粒大，滅菌難。顆粒小，滅菌容易，顆粒大，滅菌難。影響培養(yǎng)基滅菌的主要因素（影響培養(yǎng)基滅菌的主要因素（continued）三、分批滅菌三、分批滅菌（實(shí)罐滅菌）一）操作1、在進(jìn)行培養(yǎng)基滅菌之前，通常應(yīng)先把發(fā)酵罐的 分空氣過濾器滅菌并用無(wú)菌空氣吹干。 若已先行空罐滅菌，此步可不進(jìn)行若已先行空罐滅菌，此步可不進(jìn)行2、 預(yù)熱向夾套或蛇管中通入蒸汽，間接將培養(yǎng)基加熱至向夾套或蛇管中通入蒸汽，間接將培養(yǎng)基加熱至7070左右。左右。作用： 利于糊化；減少冷凝水的生成；減輕噪音利于糊化；減少冷凝水的生成；減輕噪音有

30、的工廠省卻此步；需通過試驗(yàn)掌握冷凝水的生成量，確保培養(yǎng)基的濃度。3、開啟蒸汽管，向培養(yǎng)基中通入蒸汽，升溫。4、罐壓達(dá)1kg/cm2 ( 0.1 MPa)時(shí)，安裝在發(fā)酵罐封 頭的接種管、補(bǔ)料管、消泡劑管等應(yīng)排汽。升升 溫溫 階階 段段5、保溫 調(diào)節(jié)好各進(jìn)汽和排汽閥門，使罐壓和溫度 保持在一穩(wěn)定水平，維持一定時(shí)間。在保溫階段，凡進(jìn)口在培養(yǎng)基液面下的各管道都在保溫階段，凡進(jìn)口在培養(yǎng)基液面下的各管道都應(yīng)通入蒸汽；在液面上的其余管道則應(yīng)排放蒸汽，應(yīng)通入蒸汽；在液面上的其余管道則應(yīng)排放蒸汽，這樣才能保證滅菌徹底，不留死角。這樣才能保證滅菌徹底，不留死角。保保 溫溫 階階 段段6、保溫結(jié)束后，依次關(guān)閉各排汽

31、、進(jìn)汽閥；待罐內(nèi)壓力降至0.5kg/cm2左右時(shí)，向罐內(nèi)通入無(wú)菌空氣，向夾套或蛇管中通入冷水，使培養(yǎng)基降至所需溫度。通入無(wú)菌空氣的作用：加速降溫；保持罐內(nèi)正壓通入無(wú)菌空氣的作用：加速降溫；保持罐內(nèi)正壓降降 溫溫 階階 段段ABCD升溫 保溫 降溫小型罐升降溫小型罐升降溫快，可忽略；快，可忽略；但大型罐不可但大型罐不可忽視忽視min二）二） 滅菌時(shí)間的計(jì)算滅菌時(shí)間的計(jì)算V = V加熱 + V維持 + V冷卻 RT2 (E 2RT)V 加熱加熱 = t 加熱加熱 (T-T0)E2 RT2 (E 2RT)V 冷卻冷卻 = t 冷卻冷卻 (T-T0)E2R R ：氣體常數(shù)；：氣體常數(shù)；= 1. 986

32、 = 1. 986 卡卡/ /克分子克分子KKE E ：耐熱孢子致死的活化能；：耐熱孢子致死的活化能；= 65000 = 65000 卡卡/ /克分子克分子 T T：滅菌維持溫度；：滅菌維持溫度； 121 121 （393 K393 K）T T0 0：開始計(jì)算滅菌效果的溫度；：開始計(jì)算滅菌效果的溫度；100 100 （373 K373 K）例：1 1）小型發(fā)酵罐在）小型發(fā)酵罐在120120滅菌維持滅菌維持1515分鐘，由分鐘，由100 100 （100100以以下滅菌效果不計(jì)）加熱至下滅菌效果不計(jì)）加熱至120120的時(shí)間為的時(shí)間為5 5分鐘，由分鐘，由120120冷卻冷卻到到100100的時(shí)

33、間為的時(shí)間為3 3分鐘，計(jì)算總的滅菌時(shí)間。分鐘，計(jì)算總的滅菌時(shí)間。 1.9863932(65000 21.986 393)V加熱加熱 = 5 = 1.15 (393-373) 650002 1.9863932(65000 21.986 393)V冷卻冷卻 = 5 = 0. 69 (393-373) 650002V = V加熱 + V維持 + V冷卻 = 1.15 + 15 + 0.69 = 16.6 (min) 例 ）如果滅菌條件不變，大罐由如果滅菌條件不變，大罐由加熱到加熱到需分鐘；冷卻至需分鐘；冷卻至的時(shí)間為的時(shí)間為.6分鐘；求大分鐘；求大罐的維持時(shí)間罐的維持時(shí)間。 1.9863932(6

34、5000 1.986 393)V加熱加熱 V冷卻冷卻 = （ ） (393-373) 650002.min則大罐維持時(shí)間V維持 = V（V加熱V冷卻）16.6 9.2 = 7.4 min在不同規(guī)模的發(fā)酵罐中達(dá)到同樣滅菌效果所需時(shí)間發(fā)酵罐規(guī)模（升） 維持時(shí)間（分） 200 17. 5 500 12. 6 5000 11. 3 50000 8. 8三）分批滅菌的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：不需專門的滅菌設(shè)備，投資少、設(shè)備簡(jiǎn)單、滅菌效果可靠。不需專門的滅菌設(shè)備，投資少、設(shè)備簡(jiǎn)單、滅菌效果可靠。對(duì)蒸汽的要求較低，一般對(duì)蒸汽的要求較低，一般3-4kg/cm3-4kg/cm2 2即可滿足。即可滿足。缺點(diǎn)：在滅菌過程中蒸汽

35、用量變化大，造成鍋爐負(fù)荷波動(dòng)大在滅菌過程中蒸汽用量變化大，造成鍋爐負(fù)荷波動(dòng)大中小型罐經(jīng)常采用四、培養(yǎng)基的連續(xù)滅菌四、培養(yǎng)基的連續(xù)滅菌 （連消） 將配制好的培養(yǎng)基在向發(fā)酵罐輸送的同時(shí)加熱、保溫和冷卻，進(jìn)行滅菌。 溫度 （） 時(shí)間 （min) 121 24.8 130 4.1 138 0.72 146 0.14 154 0.029 163 0.0061滅菌時(shí)間與溫度的關(guān)系（以殺死細(xì)菌芽孢為準(zhǔn)）一）連續(xù)滅菌流程1 配料罐 3 連消裝置 4 維持罐 6 冷卻裝置 配料罐（兼作預(yù)熱） 輸料泵 連消塔（器）維持罐（管） 冷卻器 發(fā)酵罐連續(xù)滅菌流程1 1、預(yù)熱、預(yù)熱可在專門的預(yù)熱罐，也可用配料罐兼作溫度：一

36、般預(yù)熱至一般預(yù)熱至7070左右左右預(yù)熱的物料用泵泵入連消裝置預(yù)熱的物料用泵泵入連消裝置輸料泵： 常用常用 旋渦泵、往復(fù)泵、螺桿泵旋渦泵、往復(fù)泵、螺桿泵旋渦泵往復(fù)泵螺桿泵2 2、加熱、加熱常用連消裝置有三類： 套管式連消器套管式連消器 汽液混合式連消器汽液混合式連消器 噴射式加熱器噴射式加熱器物料泵入加熱器，培養(yǎng)基與蒸汽混合，溫度迅速上升至130140套管式連消塔上疏下密，上疏下密，4545小孔，孔小孔，孔徑徑6 6毫米左右毫米左右培養(yǎng)液流動(dòng)線速度小于培養(yǎng)液流動(dòng)線速度小于0.1m/s ; 0.1m/s ; 在管內(nèi)逗留時(shí)間在管內(nèi)逗留時(shí)間為為15152020秒秒 汽液混合式連消器1 1 噴嘴噴嘴 2

37、 2 吸入口吸入口 3 3 吸入室吸入室 4 4混合噴嘴混合噴嘴 5 5 混合段混合段 6 6擴(kuò)大管擴(kuò)大管噴射加熱器3 3、保溫、保溫保溫設(shè)備保溫設(shè)備 （維持設(shè)備）（維持設(shè)備） 保溫材料包裹保溫材料包裹 兩種形式： 罐式；管式罐式；管式 1、維持罐連續(xù)滅菌時(shí)，關(guān)連續(xù)滅菌時(shí)，關(guān)2 2開開1 1；預(yù)熱罐中的物料輸送完后，預(yù)熱罐中的物料輸送完后，關(guān)關(guān)1 1開開2 2。培養(yǎng)基的平均停留時(shí)間 = V / FM-平均停留時(shí)間平均停留時(shí)間 （s s）V- V- 維持罐的體積維持罐的體積 （ m m3 3）FM - FM - 培養(yǎng)基的流量培養(yǎng)基的流量 （m m3 3/s/s）Note: 培養(yǎng)基在維持罐的流動(dòng)不

38、可能非常均勻，可能產(chǎn)生溝流，培養(yǎng)基在維持罐的流動(dòng)不可能非常均勻，可能產(chǎn)生溝流，造成一部分培養(yǎng)基在罐內(nèi)的停留時(shí)間少于平均值。為保證造成一部分培養(yǎng)基在罐內(nèi)的停留時(shí)間少于平均值。為保證滅菌徹底，在設(shè)計(jì)罐式維持器時(shí)，通常取平均停留時(shí)間的滅菌徹底，在設(shè)計(jì)罐式維持器時(shí)，通常取平均停留時(shí)間的3 35 5倍。倍。經(jīng)驗(yàn)： 在滅菌溫度為在滅菌溫度為130130時(shí)，實(shí)際平均時(shí)間可取時(shí)，實(shí)際平均時(shí)間可取1010分鐘；在分鐘；在140140時(shí)則可取時(shí)則可取3 34 4分鐘。分鐘。2、管式維持器在設(shè)計(jì)管式維持設(shè)備時(shí)，須采用在設(shè)計(jì)管式維持設(shè)備時(shí)，須采用停留時(shí)間分布的概念，的概念，而不能采用單純的停留時(shí)間。而不能采用單純的停

39、留時(shí)間。圓管內(nèi)不同流動(dòng)形式流體的速度分布情況 湍流 Vaverage = 0.82 Vmax 活塞流 V Vaverageaverage = V = Vmaxmax 粘滯流 Vaverage = 0.5 Vmax 在管式維持器中，若培養(yǎng)基流動(dòng)為活塞流，可根據(jù)維持管在管式維持器中，若培養(yǎng)基流動(dòng)為活塞流，可根據(jù)維持管的內(nèi)徑、培養(yǎng)基的流量求出管長(zhǎng)。的內(nèi)徑、培養(yǎng)基的流量求出管長(zhǎng)。 但實(shí)際上培養(yǎng)基不可能呈活塞流，當(dāng)培養(yǎng)基處于粘滯留狀但實(shí)際上培養(yǎng)基不可能呈活塞流，當(dāng)培養(yǎng)基處于粘滯留狀態(tài)時(shí)，管內(nèi)速度呈拋物線，管中心部位的最大流速為平均流速態(tài)時(shí)，管內(nèi)速度呈拋物線，管中心部位的最大流速為平均流速的的2 2倍；若

40、以平均流速確定管長(zhǎng)，則會(huì)造成邊緣部分的培養(yǎng)基倍；若以平均流速確定管長(zhǎng)，則會(huì)造成邊緣部分的培養(yǎng)基過熱（加熱過長(zhǎng)）。過熱（加熱過長(zhǎng)）。 確定維持管的長(zhǎng)度，應(yīng)采用確定維持管的長(zhǎng)度，應(yīng)采用擴(kuò)散模型 ( Dispersion model) . . （復(fù)雜，略）（復(fù)雜，略）4、冷卻噴淋冷卻器噴淋冷卻器板式冷卻器板式冷卻器真空冷卻器真空冷卻器噴淋冷卻器結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單；廣泛使用結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單；廣泛使用板式換熱器體積小，換熱效率高；但流動(dòng)阻力較大體積小，換熱效率高；但流動(dòng)阻力較大板式換熱器板式換熱器板式換熱器原理圖噴射加熱-真空冷卻連續(xù)滅菌系統(tǒng)二）二） 連續(xù)滅菌的優(yōu)缺點(diǎn)及注意事項(xiàng)連續(xù)滅菌的優(yōu)缺點(diǎn)及注意事項(xiàng)1 1）可采用高溫

41、短時(shí)滅菌，培養(yǎng)基受熱時(shí)間短，營(yíng)養(yǎng)）可采用高溫短時(shí)滅菌，培養(yǎng)基受熱時(shí)間短，營(yíng)養(yǎng)成分破壞少，有利于提高發(fā)酵產(chǎn)率；成分破壞少，有利于提高發(fā)酵產(chǎn)率；2 2）蒸汽負(fù)荷均衡，鍋爐利用率高，操作方便。）蒸汽負(fù)荷均衡，鍋爐利用率高，操作方便。3 3）適于自動(dòng)控制，降低勞動(dòng)強(qiáng)度。）適于自動(dòng)控制，降低勞動(dòng)強(qiáng)度。缺點(diǎn)： 設(shè)備復(fù)雜，投資大設(shè)備復(fù)雜，投資大優(yōu)點(diǎn)：連消注意事項(xiàng)：1 1）連消前，應(yīng)先進(jìn)行空罐、維持罐（管）、冷卻系統(tǒng)的滅菌；）連消前，應(yīng)先進(jìn)行空罐、維持罐（管）、冷卻系統(tǒng)的滅菌；2 2）確保管路無(wú)滲漏；）確保管路無(wú)滲漏；3 3）當(dāng)培養(yǎng)基含有較大固體顆粒或有較多泡沫時(shí)，采用連消容易）當(dāng)培養(yǎng)基含有較大固體顆?；蛴休^

42、多泡沫時(shí)，采用連消容易發(fā)生滅菌不徹底。發(fā)生滅菌不徹底。思考題：思考題：1.為什么培養(yǎng)基滅菌（濕熱滅菌）一般采用為什么培養(yǎng)基滅菌（濕熱滅菌）一般采用高溫短時(shí)滅菌？高溫短時(shí)滅菌？2.培養(yǎng)基連續(xù)滅菌的設(shè)備有哪些？（按安裝培養(yǎng)基連續(xù)滅菌的設(shè)備有哪些？（按安裝順序）順序）二二 發(fā)酵設(shè)備發(fā)酵設(shè)備發(fā)酵設(shè)備是微生物工程中最重要的設(shè)備之一，一個(gè)優(yōu)良發(fā)酵設(shè)備是微生物工程中最重要的設(shè)備之一，一個(gè)優(yōu)良的培養(yǎng)設(shè)備應(yīng)該具備的條件：的培養(yǎng)設(shè)備應(yīng)該具備的條件：1.嚴(yán)密的結(jié)構(gòu)嚴(yán)密的結(jié)構(gòu)2.良好的液體混合性能良好的液體混合性能3.高的傳質(zhì)和傳熱速率高的傳質(zhì)和傳熱速率4.可靠的檢測(cè)及控制儀表可靠的檢測(cè)及控制儀表發(fā)酵罐的分類：厭氧發(fā)

43、酵罐和好氧發(fā)發(fā)酵罐的分類：厭氧發(fā)酵罐和好氧發(fā)酵罐酵罐好氧發(fā)酵罐分為通風(fēng)和攪拌式好氧發(fā)酵罐分為通風(fēng)和攪拌式按能量輸入方式可分為三類：按能量輸入方式可分為三類：1.內(nèi)部機(jī)械攪拌型發(fā)酵罐內(nèi)部機(jī)械攪拌型發(fā)酵罐2.外部液體攪拌型發(fā)酵罐外部液體攪拌型發(fā)酵罐3.空氣噴射提升式發(fā)酵罐空氣噴射提升式發(fā)酵罐1.機(jī)械攪拌發(fā)酵罐機(jī)械攪拌發(fā)酵罐利用機(jī)械攪拌器的作用，使空氣和發(fā)酵液充分混合。利用機(jī)械攪拌器的作用，使空氣和發(fā)酵液充分混合。滿足的要求：滿足的要求：1.適宜的高徑比適宜的高徑比2.能承受一定壓力能承受一定壓力3.通風(fēng)裝置能使氣液充分混合通風(fēng)裝置能使氣液充分混合4.足夠的冷卻面積足夠的冷卻面積5.少死角少死角6.軸封嚴(yán)密軸封嚴(yán)密發(fā)酵罐的結(jié)構(gòu)：發(fā)酵罐的結(jié)構(gòu)：1.罐身：受壓容