第14章核酸的物化性質(zhì)

1、第第1414章章 核酸的物理化學性質(zhì)核酸的物理化學性質(zhì)一、核酸的水解一、核酸的水解二、核酸的酸堿性質(zhì)二、核酸的酸堿性質(zhì)三、核酸的紫外吸收三、核酸的紫外吸收四、核酸的變性、復性及雜交四、核酸的變性、復性及雜交一、核酸的水解一、核酸的水解（一）酸水解（一）酸水解對酸的敏感性：糖苷鍵磷酸酯鍵對酸的敏感性：糖苷鍵磷酸酯鍵 嘌呤嘌呤糖苷鍵嘧啶糖苷鍵糖苷鍵嘧啶糖苷鍵脫嘌呤：脫嘌呤： pH1.6，37，對水透析，對水透析 pH2.8，100，1h脫脫嘧啶：嘧啶： 98-100%甲酸，甲酸，175，2h 三氟乙酸，三氟乙酸，155，60min（DNA）或）或 80min（RNA）利用酸水解可以研究核酸的堿基組

2、成利用酸水解可以研究核酸的堿基組成2（二）堿水解（二）堿水解RNA的磷酸酯鍵對堿敏感的磷酸酯鍵對堿敏感室溫，室溫，0.31mol/L KOH，18-24h，可將，可將RNA完全水解，完全水解，得到得到2-或或3-核苷酸的混合物。核苷酸的混合物。DNA抗堿水解抗堿水解生理意義：生理意義：DNA更穩(wěn)定更穩(wěn)定 ，遺傳信息。，遺傳信息。RNA是是DNA的信使，完成任務后迅速降解。的信使，完成任務后迅速降解。3（三）酶水解（三）酶水解非特異的磷酸二酯酶：非特異的磷酸二酯酶：蛇毒磷酸二酯酶水解蛇毒磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得）得5-核苷酸核苷酸牛脾磷酸二酯酶水解牛脾磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得）得

3、3-核苷酸核苷酸特異的磷酸二酯酶特異的磷酸二酯酶：核酸酶：核酸酶N-糖苷酶糖苷酶4核酸酶核酸酶的分類的分類底物底物專一性：專一性：核糖核酸酶核糖核酸酶 RNase脫氧核糖核酸酶脫氧核糖核酸酶 DNase作用方式作用方式：核酸外切酶（核酸外切酶（exonuclease)、核酸內(nèi)切酶、核酸內(nèi)切酶 (endonuclease)單鏈核酸酶、雙鏈核酸酶、雜鏈核酸酶單鏈核酸酶、雙鏈核酸酶、雜鏈核酸酶磷酸磷酸二酯鍵的斷裂方式：二酯鍵的斷裂方式：5-（寡）核苷酸（寡）核苷酸3-（寡）核苷酸（寡）核苷酸 5 核酸酶（核酸酶（nuclease）ATCGTC CCGG TAGA化學本質(zhì)是蛋白質(zhì)化學本質(zhì)是蛋白質(zhì)53外

4、切酶外切酶內(nèi)切酶內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶具有序列特異性的核酸酶具有序列特異性的核酸酶稱為稱為限制性限制性核酸內(nèi)切酶核酸內(nèi)切酶6二二、核酸、核酸的酸堿性質(zhì)的酸堿性質(zhì)磷酸和堿基均能發(fā)生兩性解離。磷酸和堿基均能發(fā)生兩性解離。DNA等電點等電點 44.5RNA等電點等電點 22.5兩性電解質(zhì)：兩性電解質(zhì)：酸性的磷酸基和堿性的堿基酸性的磷酸基和堿性的堿基 電泳電泳和離子交換分離純化核酸和離子交換分離純化核酸7三、核酸的紫外吸收三、核酸的紫外吸收堿基、核苷、核苷酸和核酸在堿基、核苷、核苷酸和核酸在240290nm的紫外波的紫外波段有強烈的段有強烈的光吸收。光吸收。 max=260nm8鑒定鑒

5、定純度純度純純DNA的的A260/A280應為應為1.8（1.65-1.85）純純RNA的的A260/A280應為應為2.0。若溶液中含有雜蛋白或苯酚，則若溶液中含有雜蛋白或苯酚，則A260/A280比值明顯降低。比值明顯降低。含量含量計算計算1ABS值相當于：值相當于：50ug/mL雙螺旋雙螺旋DNA 或或：40ug/mL單鏈單鏈DNA（或（或RNA） 或或：20ug/mL寡核苷酸寡核苷酸判斷判斷DNA是否變性是否變性在在DNA的變性過程中，摩爾吸光系數(shù)增大（的變性過程中，摩爾吸光系數(shù)增大（增色效應增色效應）在在DNA的復性過程中，摩爾吸光系數(shù)減?。ǖ膹托赃^程中，摩爾吸光系數(shù)減?。p色效應減

6、色效應）9四、核酸的變性、復性及雜交四、核酸的變性、復性及雜交(一一)變性變性 (denaturation)核酸變性核酸變性指核酸雙螺旋區(qū)的氫鍵斷裂，變成單鏈，指核酸雙螺旋區(qū)的氫鍵斷裂，變成單鏈，不涉及共價鍵斷裂。不涉及共價鍵斷裂。102202402602800.10.20.30.4波長（波長（nmnm）光光吸吸收收123天然天然DNA變性變性DNA核苷酸總吸收值核苷酸總吸收值123變性變性因素：因素：熱變性熱變性 酸堿變性（酸堿變性（pH小于小于4或大于或大于11）變性劑（尿素、鹽酸胍、甲醛）變性劑（尿素、鹽酸胍、甲醛） 變性變性后的理化性質(zhì)：后的理化性質(zhì)：260nm吸收值升高。吸收值升高。

7、粘度降低，浮力密度升高。粘度降低，浮力密度升高。二級結構改變，部分失活。二級結構改變，部分失活。11DNA的變性是爆發(fā)式的，變性作用發(fā)生在一個很窄的溫度的變性是爆發(fā)式的，變性作用發(fā)生在一個很窄的溫度范圍內(nèi)。范圍內(nèi)。DNA的雙螺旋結構失去一半時對應的溫度稱為的雙螺旋結構失去一半時對應的溫度稱為解鏈溫度解鏈溫度（melting temperature, Tm）。）。12影響影響DNA的的Tm值的因素值的因素DNA均一均一性性均一性高，變性的溫度范圍越窄，據(jù)此可分析均一性高，變性的溫度范圍越窄，據(jù)此可分析DNA的均一性的均一性 。G-C含量含量與與Tm值值成正比成正比測定測定Tm，可推知，可推知G-

8、C含量含量。G-C%=（Tm-69.3）2.4413介質(zhì)中離子強度介質(zhì)中離子強度 離子強度離子強度高，高，Tm高。高。14（二）復性（二）復性 (renaturation) 變性變性的的DNA在適當?shù)臈l件下，兩條彼此分開的在適當?shù)臈l件下，兩條彼此分開的DNA單單鏈重新締合成為雙螺旋結構的過程。鏈重新締合成為雙螺旋結構的過程。15（三）核酸（三）核酸分子雜交分子雜交 (Hybridization)16不同來源的不同來源的DNA單鏈間或單鏈單鏈間或單鏈DNA與與RNA之間之間只要有堿基配對的區(qū)域，在復性時可形成局部雙只要有堿基配對的區(qū)域，在復性時可形成局部雙螺旋區(qū)，稱螺旋區(qū)，稱核酸分子雜交核酸分子

9、雜交（hybridization）。）。制備特定的制備特定的探針探針（probe）通過雜交技術可進行）通過雜交技術可進行基因的檢測和定位研究基因的檢測和定位研究。1753535353提取提取DNA限制性內(nèi)切酶消化限制性內(nèi)切酶消化瓊脂糖凝膠電泳、堿變性瓊脂糖凝膠電泳、堿變性轉移到轉移到NC膜，高溫烘烤膜，高溫烘烤與與DNA雜交雜交放射自顯影放射自顯影Southern blotting可用于可用于DNA之間之間同源性分析，確同源性分析，確定特異性定特異性DNA序序列的大小和定位。列的大小和定位。Southern印跡法印跡法 19Northern Blotting研究對象是研究對象是mRNA，探針一般是，探針一般是DNA?？偪俁NA或或mRNA需在變性條件下電泳（乙二醛、甲醛需在變性條件下電泳（乙二醛、甲醛）。）。Western Blotting抗原抗原與抗體的雜交與抗體的雜交研究對象是蛋白質(zhì)，研究對象是蛋白質(zhì)，“探針探針”是抗體。是抗體。2021小結小結 核酸的分子組成以及核苷酸之間的連接方式。核酸的分子組成以及核苷酸