主要禽病的實驗室檢測方法及結(jié)果

1、主要禽病的實驗室檢測方法及主要禽病的實驗室檢測方法及結(jié)果分析結(jié)果分析2（一）血清學(xué)檢測方法（一）血清學(xué)檢測方法 1、免疫血清學(xué)技術(shù)、免疫血清學(xué)技術(shù)l抗原與抗體在體內(nèi)（外）均可發(fā)生特異性抗原與抗體在體內(nèi)（外）均可發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，因為抗體主要來自于血清，在結(jié)合反應(yīng)，因為抗體主要來自于血清，在體外進行的抗原抗體反應(yīng)稱為血清學(xué)反應(yīng)體外進行的抗原抗體反應(yīng)稱為血清學(xué)反應(yīng)或免疫血清學(xué)技術(shù)?；蛎庖哐鍖W(xué)技術(shù)。一、常用的實驗室檢測方法一、常用的實驗室檢測方法3l血清學(xué)反應(yīng)的一般特點血清學(xué)反應(yīng)的一般特點高度特異性高度特異性反應(yīng)可逆性反應(yīng)可逆性反應(yīng)二階段性反應(yīng)二階段性影響反應(yīng)的因素影響反應(yīng)的因素4l血清學(xué)反應(yīng)的

2、應(yīng)用血清學(xué)反應(yīng)的應(yīng)用抗原抗體的快速檢測抗原抗體的快速檢測微生物的鑒定與分析微生物的鑒定與分析生物活性物質(zhì)的超微定量生物活性物質(zhì)的超微定量抗原抗體在細胞和亞細胞水平定位抗原抗體在細胞和亞細胞水平定位52、血清學(xué)反應(yīng)類型及常用試驗方法、血清學(xué)反應(yīng)類型及常用試驗方法反應(yīng)類型反應(yīng)類型常用試驗名稱常用試驗名稱凝集試驗?zāi)囼炛苯幽囼炛苯幽囼炂桨迥囼灒ㄆ桨迥囼灒⊿PA）血凝（血凝（HA）和血凝抑制試驗（）和血凝抑制試驗（HI）沉淀試驗沉淀試驗瓊脂免疫擴散試驗（瓊脂免疫擴散試驗（AGP）中和試驗中和試驗病毒中和試驗（病毒中和試驗（VN）標記抗體技術(shù)標記抗體技術(shù) 酶標記技術(shù)酶標記技術(shù)酶聯(lián)免疫吸

3、附試驗（酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）6（1）平板凝集試驗（）平板凝集試驗（SPA）l基本原理：細菌、紅細胞等顆粒狀抗原與基本原理：細菌、紅細胞等顆粒狀抗原與相應(yīng)抗血清在電解質(zhì)存在情況下，產(chǎn)生可相應(yīng)抗血清在電解質(zhì)存在情況下，產(chǎn)生可見的顆粒凝集現(xiàn)象。見的顆粒凝集現(xiàn)象。l主要應(yīng)用：雞白?。ㄖ饕獞?yīng)用：雞白?。⊿P） 支原體（支原體（MG/MS）圖圖1 1 平板凝集試驗檢測結(jié)果平板凝集試驗檢測結(jié)果8（2）血凝（）血凝（HA）和血凝抑制試驗（）和血凝抑制試驗（HI）l基本原理：某些病毒（如基本原理：某些病毒（如NDV）能夠凝集）能夠凝集特定種類動物的紅細胞，此即紅細胞凝集特定種類動物的紅細胞，此即紅細胞

4、凝集現(xiàn)象。這種紅細胞凝集現(xiàn)象可以被特異性現(xiàn)象。這種紅細胞凝集現(xiàn)象可以被特異性抗血清所抑制，即紅細胞凝集抑制試驗?？寡逅种疲醇t細胞凝集抑制試驗。l主要應(yīng)用：新城疫（主要應(yīng)用：新城疫（ND） 禽流感（禽流感（AI） 產(chǎn)蛋下降綜合癥（產(chǎn)蛋下降綜合癥（EDS） 雞傳染性支氣管炎（雞傳染性支氣管炎（IB） 圖圖2 2 血凝抑制試驗檢測結(jié)果血凝抑制試驗檢測結(jié)果G. Cattoli （OIE）10（3）瓊脂免疫擴散試驗（）瓊脂免疫擴散試驗（AGP）l基本原理：可溶性抗原（毒素、病毒、細基本原理：可溶性抗原（毒素、病毒、細菌裂解液）與相應(yīng)抗體結(jié)合菌裂解液）與相應(yīng)抗體結(jié)合, 在電解質(zhì)存在電解質(zhì)存在情況下，

5、產(chǎn)生可見的沉淀物。在情況下，產(chǎn)生可見的沉淀物。l主要應(yīng)用：雞馬立克氏病病毒（主要應(yīng)用：雞馬立克氏病病毒（MDV） 雞痘病毒（雞痘病毒（FPV）圖圖3 3 瓊脂擴散試驗檢測結(jié)果瓊脂擴散試驗檢測結(jié)果1. 1. 抗原；抗原；2. 2. 陽性對照；陽性對照；3-6. 3-6. 待檢血清；待檢血清；7. 7. 陰性對照陰性對照12（4）病毒中和試驗（）病毒中和試驗（VN）l基本原理：抗原與相應(yīng)的抗血清按適當比基本原理：抗原與相應(yīng)的抗血清按適當比例混合作用后，可被中和而失去感染實驗例混合作用后，可被中和而失去感染實驗動物、組織細胞或雞胚的能力。動物、組織細胞或雞胚的能力。l主要應(yīng)用：雞傳染性支氣管炎病毒（

6、主要應(yīng)用：雞傳染性支氣管炎病毒（IBV）的血清分型。的血清分型。圖圖4 4 采用雞胚接種進行采用雞胚接種進行IBVIBV分離分離空白對照空白對照病毒接種病毒接種圖圖5 5 采用中和試驗對疑似采用中和試驗對疑似IBVIBV分離物進行鑒定與分型分離物進行鑒定與分型空白對照空白對照病毒接種病毒接種病毒病毒+抗血清抗血清15（5）酶聯(lián)免疫吸附試驗（）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）l基本原理：抗原抗體反應(yīng)的特異性基本原理：抗原抗體反應(yīng)的特異性 酶促反應(yīng)的高效性酶促反應(yīng)的高效性使抗原（或抗體）結(jié)合到某種固相載體表面并使抗原（或抗體）結(jié)合到某種固相載體表面并保持其免疫活性；保持其免疫活性；使抗原（或抗體）與

7、某種酶連接成酶標物，這使抗原（或抗體）與某種酶連接成酶標物，這種酶標抗原（或抗體）既保留其免疫活性，又種酶標抗原（或抗體）既保留其免疫活性，又保留酶的活性。保留酶的活性。16l主要應(yīng)用：多種禽病檢測主要應(yīng)用：多種禽病檢測l抗體檢測最常用抗體檢測最常用ELISA方法：間接法，是利方法：間接法，是利用酶標記的抗抗體（一般為抗雞用酶標記的抗抗體（一般為抗雞IgG）檢測）檢測已與固相抗原結(jié)合的抗體。已與固相抗原結(jié)合的抗體。圖圖6 6 間接間接ELISAELISA方法測抗體的基本原理示意圖方法測抗體的基本原理示意圖18l考慮血清學(xué)檢測的目的考慮血清學(xué)檢測的目的l血清樣品的采集方法血清樣品的采集方法l采集

8、血清樣品的數(shù)量采集血清樣品的數(shù)量l血清樣品的標記血清樣品的標記l血清樣品的貯藏及運輸血清樣品的貯藏及運輸3、血清學(xué)檢測應(yīng)注意的問題、血清學(xué)檢測應(yīng)注意的問題191、病原分離鑒定、病原分離鑒定 （1）定義：指通過人工培養(yǎng)的方法分離出）定義：指通過人工培養(yǎng)的方法分離出病原體的過程。病原體的過程。 （二）病原學(xué)檢測方法（二）病原學(xué)檢測方法20（2）病原分離主要目的）病原分離主要目的l進行疾病診斷進行疾病診斷l(xiāng)疾病確診的黃金方法疾病確診的黃金方法l病原學(xué)研究的基礎(chǔ)病原學(xué)研究的基礎(chǔ)21（3）病原分離方法）病原分離方法l細菌分離培養(yǎng)：各種培養(yǎng)基細菌分離培養(yǎng)：各種培養(yǎng)基l病毒分離鑒定：雞胚、細胞或?qū)嶒瀯游锝臃N

9、病毒分離鑒定：雞胚、細胞或?qū)嶒瀯游锝臃N22（4）進行病毒分離應(yīng)注意的問題）進行病毒分離應(yīng)注意的問題l樣品采集時間樣品采集時間l采集樣品種類采集樣品種類l樣品貯藏及運輸樣品貯藏及運輸l常見接種途徑常見接種途徑l常用鑒定方法常用鑒定方法232、聚合酶鏈式反應(yīng)（、聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）（1）主要目的：通過對特異性基因片段的檢）主要目的：通過對特異性基因片段的檢測達到檢測病原體的目的。測達到檢測病原體的目的。（2）優(yōu)缺點：方便快捷、存在假陽（陰）性）優(yōu)缺點：方便快捷、存在假陽（陰）性圖圖7 7 常規(guī)常規(guī)RT-PCRRT-PCR檢測結(jié)果（電泳圖）檢測結(jié)果（電泳圖）253、其它病原學(xué)檢測方法、其它病原學(xué)

10、檢測方法（1）血凝（）血凝（HA）和血凝抑制（）和血凝抑制（HI）試驗）試驗（2）瓊脂免疫擴散試驗（）瓊脂免疫擴散試驗（AGP）（3）酶聯(lián)免疫吸附試驗（）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）（4）膠體金試紙條檢測）膠體金試紙條檢測（5）動物實驗檢查）動物實驗檢查261、雛雞母源抗體檢查（、雛雞母源抗體檢查（1-3日齡）日齡） （1）了解原產(chǎn)地的免疫種類）了解原產(chǎn)地的免疫種類l了解原產(chǎn)地易發(fā)病種類及保護性水平了解原產(chǎn)地易發(fā)病種類及保護性水平l確定需根據(jù)當?shù)厍闆r加免的疫苗確定需根據(jù)當?shù)厍闆r加免的疫苗l根據(jù)抗體反應(yīng)追蹤是否有過感染根據(jù)抗體反應(yīng)追蹤是否有過感染二、實驗室監(jiān)測方案的制定二、實驗室監(jiān)測方案的制定

11、27（2）了解母源抗體水平）了解母源抗體水平l根據(jù)母源抗體水平及各種疫病母源抗體半衰根據(jù)母源抗體水平及各種疫病母源抗體半衰期合理確定疫苗首免時間期合理確定疫苗首免時間l了解雛雞免疫保護能力，便于疫病診斷了解雛雞免疫保護能力，便于疫病診斷282、免疫檢查、免疫檢查 （1）免疫前檢查）免疫前檢查l目的是了解免前抗體水平、決定免疫時間和目的是了解免前抗體水平、決定免疫時間和進行免疫效果評價。進行免疫效果評價。 初免前檢查初免前檢查 再免前檢查再免前檢查29（2）免疫后檢查）免疫后檢查l目的是檢查免疫效果，評價免疫成功或失目的是檢查免疫效果，評價免疫成功或失敗，盡快采取相應(yīng)措施確保生產(chǎn)安全。通敗，盡快

12、采取相應(yīng)措施確保生產(chǎn)安全。通常應(yīng)選擇免疫后常應(yīng)選擇免疫后14-21天進行。天進行。30（3）定期檢查）定期檢查l目的是規(guī)律性檢查抗體消長水平以便及時目的是規(guī)律性檢查抗體消長水平以便及時采取補救措施，分析各種免疫之間的相關(guān)采取補救措施，分析各種免疫之間的相關(guān)性，調(diào)整免疫程序。性，調(diào)整免疫程序。31（4）重要節(jié)點檢查）重要節(jié)點檢查l3050d檢查（檢查前幾次免疫效果）檢查（檢查前幾次免疫效果）l開產(chǎn)前檢查（產(chǎn)蛋期及雛雞保護性抗體需求）開產(chǎn)前檢查（產(chǎn)蛋期及雛雞保護性抗體需求）l3640W檢查（確定抗體水平、適時補免）檢查（確定抗體水平、適時補免）323、生產(chǎn)發(fā)生變動時的檢查、生產(chǎn)發(fā)生變動時的檢查 （

13、1）日常規(guī)律性抗體監(jiān)測）日常規(guī)律性抗體監(jiān)測l做為發(fā)病時檢查的參考數(shù)據(jù)做為發(fā)病時檢查的參考數(shù)據(jù)l做為雞群抵抗力的依據(jù)，指示病因分析方向做為雞群抵抗力的依據(jù)，指示病因分析方向l做為流行病學(xué)分析數(shù)據(jù)，利于發(fā)現(xiàn)病原變異做為流行病學(xué)分析數(shù)據(jù)，利于發(fā)現(xiàn)病原變異33（2）雙份血清檢測）雙份血清檢測l鑒于發(fā)病后抗體常有明顯升高，雙份血清抗鑒于發(fā)病后抗體常有明顯升高，雙份血清抗體值對比分析有很好的診斷價值。體值對比分析有很好的診斷價值。34（3）抗原檢測）抗原檢測l某些情況下，抗原檢測可以直接證實感染某些情況下，抗原檢測可以直接證實感染狀況的存在。狀況的存在。35（4）未免疫雞群抗體檢測）未免疫雞群抗體檢測l未

14、免疫雞群某疾病抗體的出現(xiàn)，特別注意雛未免疫雞群某疾病抗體的出現(xiàn)，特別注意雛雞母源抗體消失后抗體的再出現(xiàn)以及隨日齡雞母源抗體消失后抗體的再出現(xiàn)以及隨日齡增加而抗體持續(xù)上升的現(xiàn)象，這對疾病診斷增加而抗體持續(xù)上升的現(xiàn)象，這對疾病診斷十分重要。十分重要。364、重要疫病流行動態(tài)分析、重要疫病流行動態(tài)分析l流行動態(tài)分析對生產(chǎn)企業(yè)來說，開展具有一定流行動態(tài)分析對生產(chǎn)企業(yè)來說，開展具有一定的難度，但對重要疫病，尤其是重點進行免疫的難度，但對重要疫病，尤其是重點進行免疫防控的疫病仍然值得重視，對長期的流行資料防控的疫病仍然值得重視，對長期的流行資料進行分析，會得到極為有益的技術(shù)支持。進行分析，會得到極為有益的

15、技術(shù)支持。37l流行動態(tài)分析需要進行大量工作，除抗體監(jiān)測外，流行動態(tài)分析需要進行大量工作，除抗體監(jiān)測外，必需配合針對性的實驗室研究工作，如病原分離必需配合針對性的實驗室研究工作，如病原分離鑒定、動物實驗和必要的分子生物學(xué)研究。鑒定、動物實驗和必要的分子生物學(xué)研究。381、HI檢測結(jié)果與分析檢測結(jié)果與分析 （1）常見）常見HI檢測結(jié)果檢測結(jié)果1-3d 15-25d25-35d35-50d50d開產(chǎn)前開產(chǎn)前36w左右左右40wH5N125-720-320-423-526-727-925-627-9H9N225-920-323-524-727-829-1226-729-11ND25-920-323-

16、525-827-1029-1227-829-12三、重要疫病的常見檢查結(jié)果與分析三、重要疫病的常見檢查結(jié)果與分析圖圖8 8 種雞開產(chǎn)前種雞開產(chǎn)前NDVNDV抗體檢測情況抗體檢測情況40（2）免疫抗體空檔期）免疫抗體空檔期l15-25d是母源抗體逐漸消失，新的免疫抗體是母源抗體逐漸消失，新的免疫抗體尚未建立的時期尚未建立的時期l野毒侵襲大多發(fā)生于此，一般野毒侵襲大多發(fā)生于此，一般18-25d多發(fā)多發(fā)l空檔期隨免疫（程序和疫苗）成功達到最短空檔期隨免疫（程序和疫苗）成功達到最短圖圖9 NDV9 NDV母源抗體衰減情況母源抗體衰減情況圖圖10 15-3010 15-30日齡雛雞日齡雛雞NDVNDV抗

17、體檢測情況抗體檢測情況43（3）HI檢查的抗體離散度檢查的抗體離散度l在在4lg2內(nèi)是允許范圍內(nèi)是允許范圍l大于大于4lg2的基本原因的基本原因初免時母源抗體水平參差不齊初免時母源抗體水平參差不齊免疫成功率不高免疫成功率不高-漏免太多漏免太多疫苗質(zhì)量不好疫苗質(zhì)量不好l二免后離散度應(yīng)達到要求二免后離散度應(yīng)達到要求44（4）抗體保護臨界值）抗體保護臨界值l通過攻毒試驗加以驗證的結(jié)果通過攻毒試驗加以驗證的結(jié)果AIV要求要求26NDV要求要求28-10l臨界值是針對有效保護對等而言，即疫苗和臨界值是針對有效保護對等而言，即疫苗和流行毒株有良好的相關(guān)性。流行毒株有良好的相關(guān)性。l當流行毒株變異而疫苗株保

18、護性不足時，原當流行毒株變異而疫苗株保護性不足時，原有臨界值在一定程度上失去意義，需要新確有臨界值在一定程度上失去意義，需要新確立或提高臨界值水平。立或提高臨界值水平。45（5）診斷試劑問題）診斷試劑問題l抗原問題：抗原問題：抗原不純（影響抗原不純（影響HA的確定）的確定）抗原制備毒株和流行毒株存在明顯差異抗原制備毒株和流行毒株存在明顯差異l陽性血清問題：陽性血清不純陽性血清問題：陽性血清不純46（6）診斷指標）診斷指標lH5N1雙份血清檢測：應(yīng)用常規(guī)雙份血清檢測：應(yīng)用常規(guī) Re-4、Re-5苗免苗免疫情況下，如果知道發(fā)病前抗體水平，則疫情況下，如果知道發(fā)病前抗體水平，則發(fā)病后發(fā)病后10-14

19、d可檢測出可檢測出Re-4、Re-5抗體滴抗體滴度上升度上升22-3。未免相應(yīng)疫苗的情況下，檢測變異株抗體未免相應(yīng)疫苗的情況下，檢測變異株抗體達到達到26-9有診斷價值。有診斷價值。圖圖11 11 某肉種雞群發(fā)生某肉種雞群發(fā)生H5H5感染前后抗體檢測結(jié)果感染前后抗體檢測結(jié)果（38W38W發(fā)生，發(fā)生，2W2W產(chǎn)蛋率產(chǎn)蛋率75%75%5%5%，死淘，死淘20%20%）圖圖12 12 某肉種雞群某肉種雞群H5H5感染后變異株抗體檢測結(jié)果感染后變異株抗體檢測結(jié)果（換羽（換羽24W24W發(fā)生，降蛋發(fā)生，降蛋10%10%，累計死亡率，累計死亡率5%5%）49lH9N2產(chǎn)蛋雞發(fā)病后產(chǎn)蛋雞發(fā)病后10-14天，

20、天，HI抗體抗體20%以上達到以上達到212以上以上有診斷價值。有診斷價值。雛雞雛雞20-30d HI抗體達到抗體達到26-9有診斷價值。有診斷價值。50lND產(chǎn)蛋雞發(fā)病后產(chǎn)蛋雞發(fā)病后10-14d，HI抗體抗體213有診斷價值。有診斷價值。雛雞雛雞20-35d HI抗體達到抗體達到26-9有診斷價值。有診斷價值。圖圖13 13 某肉種雞群發(fā)生某肉種雞群發(fā)生NDVNDV感染后抗體檢測結(jié)果感染后抗體檢測結(jié)果52lHI診斷應(yīng)注意的問題診斷應(yīng)注意的問題HI診斷應(yīng)結(jié)合臨床表現(xiàn)，當臨床表現(xiàn)無異常而檢測結(jié)診斷應(yīng)結(jié)合臨床表現(xiàn)，當臨床表現(xiàn)無異常而檢測結(jié)果異常時往往是檢測結(jié)果出了錯，應(yīng)提高警惕。果異常時往往是檢測

21、結(jié)果出了錯，應(yīng)提高警惕。532、平板凝集試驗（、平板凝集試驗（SPA）檢測結(jié)果與分析）檢測結(jié)果與分析 （1）可用于）可用于MG、MS、SP檢查檢查 （2）可進行血清平板和全血平板，相對來說血）可進行血清平板和全血平板，相對來說血清平板更準確和易于判斷。清平板更準確和易于判斷。54（3）SPA準確率相對較差，假陽性率高，一般群準確率相對較差，假陽性率高，一般群體檢查超過體檢查超過30%以上陽性才有確實群體感染的診以上陽性才有確實群體感染的診斷意義。斷意義。（4）國內(nèi)產(chǎn)品和國外產(chǎn)品特異性上有一定差距。）國內(nèi)產(chǎn)品和國外產(chǎn)品特異性上有一定差距。553、瓊脂擴散試驗（、瓊脂擴散試驗（AGP）檢測結(jié)果與分

22、析）檢測結(jié)果與分析 （1）可用于）可用于MD、POX和和IC （2）對）對MD可進行抗體、抗原兩種檢測可進行抗體、抗原兩種檢測l50d左右，左右，50%以上抗體陽性預(yù)示疫苗反應(yīng)正常以上抗體陽性預(yù)示疫苗反應(yīng)正常l用羽髓做瓊擴有發(fā)病診斷價值用羽髓做瓊擴有發(fā)病診斷價值56（3）POX常不用檢測，通過觀察接種部位反應(yīng)可常不用檢測，通過觀察接種部位反應(yīng)可了解免疫效果，觀察臨床癥狀進行疫病診斷。了解免疫效果，觀察臨床癥狀進行疫病診斷。（4）IC的瓊擴試劑很少，可從國外進口或選用日的瓊擴試劑很少，可從國外進口或選用日本北里所的間接血凝試劑。本北里所的間接血凝試劑。574、ELISA檢測結(jié)果與分析檢測結(jié)果與分析 （1）目前可應(yīng)用）目前可應(yīng)用ELISA檢測的疾病檢測的疾病lND、AI lMG、MS、SPlIB、IBD、REO、AE、 RE、ILT、CIAlALV-A/B、ALV-J、ALV-Ag58（2）常見）常見ELISA檢測結(jié)果檢測結(jié)果1-3d15-25d25-35d50d開產(chǎn)前開產(chǎn)前產(chǎn)蛋期產(chǎn)蛋期IB2000-80000-10001000-20002000-80002000-150002000-15000IBD2000-80000-15002000-40004