第3章細(xì)胞生物學(xué)研究方法-2016

1、1細(xì)胞生物學(xué)研究方法細(xì)胞生物學(xué)研究方法2 光學(xué)顯微鏡：以可見光（或紫外線）為光源。光學(xué)顯微鏡：以可見光（或紫外線）為光源。 電子顯微鏡：以電子束為光源。電子顯微鏡：以電子束為光源。肉眼：肉眼：0.2 mm; 光鏡：光鏡：0.2 m m; 電鏡：電鏡：0.2 nm31. 4（The Light Microscope）1) 1) 結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)光學(xué)顯微鏡光學(xué)放光學(xué)放大系統(tǒng)大系統(tǒng)目鏡目鏡物鏡物鏡照明照明系統(tǒng)系統(tǒng)聚光鏡聚光鏡光源光源機械支持系統(tǒng)機械支持系統(tǒng)顯微鏡的分辨力由哪部分決定？顯微鏡的分辨力由哪部分決定？5分辨率分辨率 =0.61X0.5/1.4=0 63）總放大率：總放大率：74)4) 目鏡的目鏡的

2、 作用：作用： 與顯微鏡的分辨率無關(guān)，它只是把物象第與顯微鏡的分辨率無關(guān)，它只是把物象第二次放大，使眼睛便于觀察。二次放大，使眼睛便于觀察。 目鏡只能將物鏡已經(jīng)分辨的影像進(jìn)行放大，目鏡只能將物鏡已經(jīng)分辨的影像進(jìn)行放大，無法觀察到未被物鏡分辨的細(xì)節(jié)。無法觀察到未被物鏡分辨的細(xì)節(jié)。問題：使用問題：使用40/0.6540/0.65物鏡時，應(yīng)選配適宜目鏡物鏡時，應(yīng)選配適宜目鏡5 5）應(yīng)用：經(jīng)過固定染色后，切片標(biāo)本的觀察。）應(yīng)用：經(jīng)過固定染色后，切片標(biāo)本的觀察。8移動臂移動臂蠟或樹脂包埋的樣品蠟或樹脂包埋的樣品切片用鋼刀切片用鋼刀樣品切片蠟帶樣品切片蠟帶伸展在蓋玻片和伸展在蓋玻片和載玻片之間的切片載玻片

3、之間的切片切片機切片機石蠟切片石蠟切片固定劑（甲固定劑（甲醛）醛）乙醇脫水乙醇脫水-二甲苯二甲苯-石蠟包埋石蠟包埋9VWAp27 TUNEL 10染色細(xì)胞染色細(xì)胞未染色細(xì)胞未染色細(xì)胞光線通過染色的細(xì)胞，光線通過染色的細(xì)胞，振幅變低。光線通過振幅變低。光線通過未染色的細(xì)胞，振幅未染色的細(xì)胞，振幅不變，但相位發(fā)生改不變，但相位發(fā)生改變。變。利用光利用光衍射和干涉衍射和干涉特特性，通過添加物鏡后性，通過添加物鏡后焦面上焦面上相板相板和聚光鏡和聚光鏡上的上的環(huán)狀光柵環(huán)狀光柵，使相，使相位差變?yōu)檎穹睿嵛徊钭優(yōu)檎穹?，提高高明暗對比。明暗對比?1在構(gòu)造上，相差顯微鏡在構(gòu)造上，相差顯微鏡有不同于普通光

4、學(xué)顯微有不同于普通光學(xué)顯微鏡兩個特殊之處。鏡兩個特殊之處。環(huán)形光闌環(huán)形光闌（annular diaphragm）：位于光）：位于光源與聚光器之間。源與聚光器之間。相位板相位板（annular phaseplate）：物鏡中）：物鏡中加了涂有氟化鎂的相位加了涂有氟化鎂的相位板，可將直射光或衍射板，可將直射光或衍射光的相位推遲光的相位推遲1/4。12Figure 3-2. Interference between light waves. When two light waves combine in phase, the amplitude of the resultant wave is la

5、rger and the brightness is increased. Two light waves that are out of phase partially cancel each other and produce a wave whose amplitude, and therefore brightness, is decreased. 13 衍射光的相位比直射光推遲衍射光的相位比直射光推遲1/4波長波長 明反差（負(fù)反差）明反差（負(fù)反差）：將：將直射光推遲直射光推遲1/4入入，使，使直射光和衍射光，維持同一相位，由于干涉現(xiàn)直射光和衍射光，維持同一相位，由于干涉現(xiàn)象，合成光的

6、振幅是二者象，合成光的振幅是二者振幅之和振幅之和，而背景只，而背景只有直射光，所以被檢物體比背景亮。有直射光，所以被檢物體比背景亮。 暗反差（正反差）暗反差（正反差）：將：將衍射光推遲衍射光推遲1/4入入，由，由于直射光和衍射光的干涉作用，合成光的振幅于直射光和衍射光的干涉作用，合成光的振幅是直射光與衍射光是直射光與衍射光的差的差，而背景只有直射光，而背景只有直射光，所以背檢物體比背景暗。所以背檢物體比背景暗。優(yōu)點：可對未經(jīng)染色的標(biāo)本和活細(xì)胞進(jìn)行顯微內(nèi)優(yōu)點：可對未經(jīng)染色的標(biāo)本和活細(xì)胞進(jìn)行顯微內(nèi)部結(jié)構(gòu)的觀察，提高分辨率部結(jié)構(gòu)的觀察，提高分辨率143. 3. 微分干涉差顯微鏡微分干涉差顯微鏡 （d

7、ifferential-interference microscopy）利用的是利用的是偏振光偏振光，這些光經(jīng)棱鏡折射后分成，這些光經(jīng)棱鏡折射后分成兩束，在不同時間經(jīng)過樣品的相鄰部位，然兩束，在不同時間經(jīng)過樣品的相鄰部位，然后在經(jīng)過另一棱鏡將這兩束光匯合，從樣品后在經(jīng)過另一棱鏡將這兩束光匯合，從樣品中厚度上的微小區(qū)別就會轉(zhuǎn)化成明暗區(qū)別，中厚度上的微小區(qū)別就會轉(zhuǎn)化成明暗區(qū)別，增加了增加了樣品反差樣品反差并且具有并且具有很強的立體感很強的立體感。一些較大的細(xì)胞器，如核、線粒體等，立體一些較大的細(xì)胞器，如核、線粒體等，立體感特別強，適合于顯微操作，影像具有感特別強，適合于顯微操作，影像具有浮雕浮雕感

8、。感。15丁達(dá)爾效應(yīng)原理丁達(dá)爾效應(yīng)原理分辨力：分辨力：0.004um利用特殊聚光器，使利用特殊聚光器，使照明光線照明光線不不能進(jìn)入能進(jìn)入物鏡物鏡，經(jīng)過標(biāo)本的，經(jīng)過標(biāo)本的散射光散射光進(jìn)入物鏡放大。進(jìn)入物鏡放大。觀察樣品結(jié)構(gòu)的觀察樣品結(jié)構(gòu)的明亮輪廓明亮輪廓，如，如活活細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞核、線粒體等，但內(nèi)的細(xì)胞核、線粒體等，但分辨不清內(nèi)部分辨不清內(nèi)部結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)。16 (A) 普通光學(xué)顯微鏡普通光學(xué)顯微鏡 (B) 相差顯微鏡相差顯微鏡 (C) 微分干涉差顯微鏡微分干涉差顯微鏡 (D)暗視野顯微技術(shù)暗視野顯微技術(shù). 1718倒置：物鏡在載物臺之下，照明系統(tǒng)倒置：物鏡在載物臺之下，照明系統(tǒng)在在載物臺載物臺之上

9、，用于觀察培養(yǎng)的之上，用于觀察培養(yǎng)的活細(xì)胞活細(xì)胞，通常具有，通常具有相差相差物鏡。物鏡。19原理：原理：熒光物質(zhì)熒光物質(zhì)經(jīng)經(jīng)波長較短波長較短的光線照射后分子被的光線照射后分子被激活激活，吸收能量吸收能量后處于后處于激發(fā)態(tài)激發(fā)態(tài)釋放能量，其能量一部釋放能量，其能量一部分轉(zhuǎn)化為熱能，大部分能量則以波長較長的光分轉(zhuǎn)化為熱能，大部分能量則以波長較長的光能能熒光熒光形式輻射出來。形式輻射出來。應(yīng)用：檢測細(xì)胞上的特異熒光染料。應(yīng)用：檢測細(xì)胞上的特異熒光染料。20第一濾第一濾光片光片第二濾第二濾光片光片平面反射鏡平面反射鏡物鏡物鏡儀器：光源，儀器：光源，濾色裝置濾色裝置高高壓壓汞汞燈燈2122熒光標(biāo)記物：熒

10、光標(biāo)記物：異硫氰酸熒光素異硫氰酸熒光素(FITC), rhodamine.23多種熒光探針多種熒光探針著絲點著絲點:紅色紅色DNA：藍(lán)色：藍(lán)色紡錘體微管：綠色紡錘體微管：綠色DAPI即4,6-二脒基-2-苯基吲哚(4,6-diamidino-2-phenylindole) 24257. 激光掃描共聚焦顯微鏡激光掃描共聚焦顯微鏡(laser scanning confocal microscope )26原理原理原理原理 激光光源通過一個微小激光光源通過一個微小縫隙，打到一個縫隙，打到一個二向色二向色鏡鏡。由鏡子反射的光線。由鏡子反射的光線通過通過物鏡物鏡、聚焦在樣品、聚焦在樣品的的一個層面上一

11、個層面上。樣品被。樣品被激發(fā)后發(fā)出較長波長的激發(fā)后發(fā)出較長波長的光，通過物鏡成像、聚光，通過物鏡成像、聚焦在顯微鏡中的一個焦在顯微鏡中的一個針針孔縫隙孔縫隙中，而來自中，而來自其它其它層面的光線被擋板擋住層面的光線被擋板擋住。圖像通過信號放大傳輸圖像通過信號放大傳輸?shù)接嬎銠C中。到計算機中。 27特點：單色激光形成的點光源特點：單色激光形成的點光源光點掃描光點掃描二維圖像二維圖像改變焦平面改變焦平面三維重建處理三維重建處理優(yōu)點：優(yōu)點：使圖像異常清晰，提高靈使圖像異常清晰，提高靈敏度和分辨率敏度和分辨率28腸胚期果蠅胚胎細(xì)胞微絲的常規(guī)和腸胚期果蠅胚胎細(xì)胞微絲的常規(guī)和confocal熒光顯微鏡的圖像

12、比較熒光顯微鏡的圖像比較29 透射電鏡（透射電鏡（transmission electron microscope，TEM） 掃描電鏡（掃描電鏡（scanning electron microscope， SEM）30 原理：原理：電磁透鏡電磁透鏡: 分辨率：分辨率：0.2nm，生物樣品：生物樣品：1nm31 原理：原理：電磁透鏡電磁透鏡: 分辨率：分辨率：0.2nm，生物樣品：生物樣品：1nm32 原理：原理：電磁透鏡電磁透鏡: 分辨率：分辨率：0.2nm，生物樣品：生物樣品：1nm33各種光及電子束的波長各種光及電子束的波長341）結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)35投影鏡投影鏡直接觀察物像直接觀察物像聚光鏡聚光

13、鏡物鏡物鏡目鏡目鏡363）樣品制備：）樣品制備：固定固定：戊二醛和四氧化鋨戊二醛和四氧化鋨乙醇、丙酮系列乙醇、丙酮系列脫水脫水環(huán)氧樹脂環(huán)氧樹脂包埋包埋超薄超薄切片切片：4050nm電子電子染色染色：醋酸鈾、檸檬醋鉛醋酸鈾、檸檬醋鉛增加反差增加反差37銅網(wǎng)銅網(wǎng)3839 電鏡觀察的樣品不能太厚，當(dāng)樣品太厚時電子不電鏡觀察的樣品不能太厚，當(dāng)樣品太厚時電子不能穿透，就需要把樣品本身去掉，此技術(shù)是便于能穿透，就需要把樣品本身去掉，此技術(shù)是便于透射電子顯微鏡透射電子顯微鏡觀察的一種技術(shù)。觀察的一種技術(shù)。亦稱冰凍斷裂亦稱冰凍斷裂(freeze-fracture)，是研究，是研究生物生物膜內(nèi)部結(jié)構(gòu)膜內(nèi)部結(jié)構(gòu)的

14、一種有用的技術(shù)，關(guān)于膜結(jié)構(gòu)的許的一種有用的技術(shù)，關(guān)于膜結(jié)構(gòu)的許多資料即是利用這種方法取得的。多資料即是利用這種方法取得的。40冷凍冷凍-斷裂斷裂-蝕刻蝕刻-復(fù)型復(fù)型-融化組織融化組織將標(biāo)本于將標(biāo)本于-100干冰中或干冰中或-196液氮中，超低溫液氮中，超低溫冰凍。冰凍。然后用冷刀驟然將標(biāo)本沖斷開，升溫后冰在然后用冷刀驟然將標(biāo)本沖斷開，升溫后冰在真空真空條條件下迅即件下迅即升華升華，暴露出了斷裂面結(jié)構(gòu)，暴露出了斷裂面結(jié)構(gòu)蝕刻蝕刻(etching)。技術(shù)過程技術(shù)過程蝕刻蝕刻斷裂斷裂41剩剩復(fù)型膜復(fù)型膜觀察觀察垂直噴垂直噴碳碳加固加固融組織融組織立體感強，分辨立體感強，分辨率高，主要用于率高，主要用

15、于生物膜結(jié)構(gòu)的研生物膜結(jié)構(gòu)的研究。究。復(fù)型膜：樣品用重金屬復(fù)型膜：樣品用重金屬傾斜傾斜投影后再用投影后再用碳垂直碳垂直噴鍍噴鍍一次，以形成一層一次，以形成一層連續(xù)的碳膜連續(xù)的碳膜，然后以，然后以強力的消化強力的消化劑劑將生物樣品腐蝕掉。這樣就只剩下一層可在透射將生物樣品腐蝕掉。這樣就只剩下一層可在透射電鏡下觀察的帶有電鏡下觀察的帶有重金屬造成的影像的碳膜重金屬造成的影像的碳膜，稱為，稱為復(fù)型膜。復(fù)型膜。42P: protoplasmic faceE: exoplasmic face原生質(zhì)面原生質(zhì)面外質(zhì)面外質(zhì)面43冷凍蝕刻復(fù)型技術(shù)冷凍蝕刻復(fù)型技術(shù)制備的細(xì)胞斷面制備的細(xì)胞斷面4445透鏡：匯聚透鏡

16、：匯聚電子束電子束偏轉(zhuǎn)器掃描偏轉(zhuǎn)器掃描發(fā)生器發(fā)生器透鏡透鏡在觀察在觀察屏成像屏成像檢測器檢測器： 1 1） 原理原理： 電子探針受掃描發(fā)生器電子探針受掃描發(fā)生器控制，在控制，在樣品表面樣品表面逐點逐線逐點逐線地地掃描掃描，樣品被，樣品被電子轟擊電子轟擊所所產(chǎn)生的產(chǎn)生的二次電子信號二次電子信號被收集、被收集、轉(zhuǎn)換、放大，在轉(zhuǎn)換、放大，在熒光屏熒光屏上上同同步掃描步掃描成像。樣品發(fā)射成像。樣品發(fā)射電子電子多多的地方，在熒光屏上相應(yīng)的地方，在熒光屏上相應(yīng)的點就的點就亮亮，反之則暗。，反之則暗。加熱的燈加熱的燈絲絲(電子電子發(fā)射源發(fā)射源)462）樣品制備樣品制備： 固定：戊二醛和四氧化鋨固定：戊二醛和

17、四氧化鋨乙醇、丙酮系列脫水乙醇、丙酮系列脫水CO2臨界點干燥法：臨界點干燥法： 防止樣品脫水干燥中表面張力造成的變形防止樣品脫水干燥中表面張力造成的變形噴鍍：為了改善二次電子發(fā)放的性質(zhì)及防止電荷噴鍍：為了改善二次電子發(fā)放的性質(zhì)及防止電荷積累（金或鉑）積累（金或鉑）47蛙內(nèi)耳毛細(xì)胞掃描電鏡投影圖蛙內(nèi)耳毛細(xì)胞掃描電鏡投影圖成像具強烈的成像具強烈的立立體感體感，適于觀察精適于觀察精細(xì)的立體表面結(jié)構(gòu)。細(xì)的立體表面結(jié)構(gòu)。分辨率較低分辨率較低（3nm），不能），不能 觀察內(nèi)部結(jié)構(gòu)。觀察內(nèi)部結(jié)構(gòu)。48 掃描探針（金屬針尖）掃描探針（金屬針尖）對對樣品表面樣品表面進(jìn)行掃描。進(jìn)行掃描。 針尖和樣品之間會產(chǎn)針尖和

18、樣品之間會產(chǎn)生生隧道電流隧道電流。 針尖和樣品針尖和樣品間間距離距離的的微小變化轉(zhuǎn)換為微小變化轉(zhuǎn)換為隧道隧道電流電流的變化。的變化。49將探針接近被測樣品，并在其間加將探針接近被測樣品，并在其間加2-10伏的小電壓，伏的小電壓，當(dāng)兩者距離十分小時當(dāng)兩者距離十分小時（約（約1納米），納米），電子就可因量子隧電子就可因量子隧道效應(yīng)在沒有接觸的道效應(yīng)在沒有接觸的針尖和樣品間針尖和樣品間流動，即產(chǎn)生了流動，即產(chǎn)生了隧穿電隧穿電流流。保持兩者的保持兩者的距離不變距離不變，隧穿電流也，隧穿電流也保持不變保持不變。隧穿電流對針尖和樣品間距離的隧穿電流對針尖和樣品間距離的微小變化異常敏感微小變化異常敏感如針尖

19、在樣品表面掃描時改變?nèi)玑樇庠跇悠繁砻鎾呙钑r改變1個原子大小的間距個原子大小的間距，隧隧穿電流穿電流即可變化即可變化1000倍倍5051 優(yōu)點：優(yōu)點： 高分辨率高分辨率。具有原子級的空間分辨率。橫向空間。具有原子級的空間分辨率。橫向空間分辨率為分辨率為0.1nm，縱向為，縱向為0.001nm。 不需任何透鏡，體積小。不需任何透鏡，體積小。 缺點：缺點：是其檢查的對象必須是是其檢查的對象必須是導(dǎo)電體導(dǎo)電體，而生物樣品的導(dǎo)，而生物樣品的導(dǎo)電性很差，這是限制其在生命科學(xué)研究中應(yīng)用的電性很差，這是限制其在生命科學(xué)研究中應(yīng)用的主要因素。主要因素。52 不再要求樣品是導(dǎo)電不再要求樣品是導(dǎo)電體體 用于檢查用于

20、檢查不導(dǎo)電不導(dǎo)電的樣的樣品的品的形貌形貌并能得到清并能得到清楚的圖像。楚的圖像。 但分辨率比掃描隧道但分辨率比掃描隧道顯微鏡顯微鏡要低，比掃描要低，比掃描電鏡高。電鏡高。53當(dāng)探針尖當(dāng)探針尖端端與樣與樣品品表面接表面接觸觸時時，依其，依其作用力作用力作作用用( (吸力或斥力吸力或斥力) )，使得，使得懸懸臂臂彎彎曲曲，依依據(jù)據(jù)角度的角度的變變化，造成化，造成二二極體極體電電流改流改變變。由由測測量量電電流的流的變變化可得知化可得知懸懸臂臂彎彎曲程度，曲程度，輸輸入入電腦產(chǎn)電腦產(chǎn)生生樣樣品表面三品表面三維維影像影像。不不論絕緣體論絕緣體、半、半導(dǎo)體導(dǎo)體、導(dǎo)體導(dǎo)體都一都一樣樣可以可以獲得獲得三三維

21、維空空間間影像。影像。 54原子力顯微鏡原子力顯微鏡肺癌肺癌A549細(xì)胞細(xì)胞55原理：原理：利用細(xì)胞內(nèi)各種成分的利用細(xì)胞內(nèi)各種成分的大小、形大小、形狀和密度狀和密度不同，采用不同的離心不同，采用不同的離心力將之分離。力將之分離。分類：差速離心分類：差速離心密度梯度離心密度梯度離心2.2 2.2 細(xì)胞組分的分析方法細(xì)胞組分的分析方法56原理：主要根據(jù)被分離物原理：主要根據(jù)被分離物質(zhì)的質(zhì)的大小差異大小差異。體積大。體積大的沉降得快，反之沉降的沉降得快，反之沉降得慢。得慢。用途：用途：分離分離體積相差懸殊體積相差懸殊的細(xì)胞和細(xì)胞器。的細(xì)胞和細(xì)胞器。57-介質(zhì)介質(zhì)密度均一密度均一，遞增速度逐級離心，遞

22、增速度逐級離心58組織勻漿組織勻漿低速離心低速離心1,000g 10分分沉淀含：沉淀含：細(xì)胞核細(xì)胞核59沉淀含：沉淀含：線粒體、溶線粒體、溶酶體、過氧化物酶體酶體、過氧化物酶體將上清中速離心將上清中速離心20,000g 10分分60將上清高速離心將上清高速離心80,000g 1小時小時沉淀含：沉淀含：微粒體小泡微粒體小泡61 微粒體是指在細(xì)胞勻漿和差速離心過程中獲得的微粒體是指在細(xì)胞勻漿和差速離心過程中獲得的由由破碎的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自我融合破碎的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自我融合形成的近似球形的形成的近似球形的膜囊膜囊泡狀泡狀結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu) 包含內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和核糖體兩種基本成分。包含內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和核糖體兩種基本成分。62將上清超速離心

23、將上清超速離心150,000g 3小時小時沉淀含：沉淀含：核糖體核糖體,病毒大分子病毒大分子63 用介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一用介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度度，將細(xì)胞混懸液或勻漿置于，將細(xì)胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部介質(zhì)的頂部，通過，通過離心力場的作用使細(xì)胞和細(xì)胞成分分層、分離。離心力場的作用使細(xì)胞和細(xì)胞成分分層、分離。 類型：速度沉降、等密度沉降。類型：速度沉降、等密度沉降。 常用介質(zhì)：氯化銫、蔗糖、多聚蔗糖。常用介質(zhì)：氯化銫、蔗糖、多聚蔗糖。 分離活細(xì)胞的介質(zhì)要求：分離活細(xì)胞的介質(zhì)要求： 能產(chǎn)生密度梯度，且密度高時，粘度不高；能產(chǎn)生密度梯度，且密度高時，粘度不高

24、； PH中性或易調(diào)為中性；中性或易調(diào)為中性； 濃度大時滲透壓不大；濃度大時滲透壓不大； 對細(xì)胞無毒對細(xì)胞無毒。特點：特點：常用常用蔗糖或甘油蔗糖或甘油制備輕微的制備輕微的連續(xù)密度的介質(zhì)連續(xù)密度的介質(zhì)，將待分離的樣品加在離心管的最上層。在離心將待分離的樣品加在離心管的最上層。在離心過程中，過程中，體積、密度不同體積、密度不同的顆粒就會以不同的的顆粒就會以不同的沉降帶分開，最后收集各區(qū)帶。沉降帶分開，最后收集各區(qū)帶。用途：分離用途：分離體積體積大小大小稍微不同稍微不同、密度相近的顆粒。、密度相近的顆粒。65特點特點 在密度連續(xù)梯度的介質(zhì)中，將細(xì)胞勻漿置于介質(zhì)的頂在密度連續(xù)梯度的介質(zhì)中，將細(xì)胞勻漿置

25、于介質(zhì)的頂部，離心使勻漿中的不同組分沉降到與部，離心使勻漿中的不同組分沉降到與自身密度相等自身密度相等的介質(zhì)的介質(zhì)處，并停留在那里達(dá)到平衡。各沉降帶可分別處，并停留在那里達(dá)到平衡。各沉降帶可分別收集。收集。用途：用途：分離密度不同分離密度不同的顆粒的顆粒常用介質(zhì)：蔗糖常用介質(zhì)：蔗糖(5%20%) 、CsCI66速度速度沉降沉降離心離心等密等密度離度離心心樣品蔗糖的穩(wěn)定梯度慢速沉降成分快速沉降成分樣品蔗糖的不連續(xù)梯度低浮力密度成分高浮力密度成分68 優(yōu)點：可以對細(xì)胞內(nèi)的各種細(xì)胞器的化學(xué)組成進(jìn)優(yōu)點：可以對細(xì)胞內(nèi)的各種細(xì)胞器的化學(xué)組成進(jìn)行直接的定量分析。行直接的定量分析。 缺點：缺點：1.分離細(xì)胞器

26、時難免混入少量其他的細(xì)胞器。分離細(xì)胞器時難免混入少量其他的細(xì)胞器。2.某種細(xì)胞器的表面可能吸附了其他細(xì)胞器中某某種細(xì)胞器的表面可能吸附了其他細(xì)胞器中某種化學(xué)物質(zhì)種化學(xué)物質(zhì)。 69通過一些通過一些顯色劑顯色劑與某些特殊基團與某些特殊基團特異性結(jié)合的性質(zhì)，利用特異性結(jié)合的性質(zhì)，利用細(xì)胞化細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)學(xué)反應(yīng)來顯示細(xì)胞內(nèi)某組分的分來顯示細(xì)胞內(nèi)某組分的分布及強弱的技術(shù)。布及強弱的技術(shù)。核酸、糖類、脂類、蛋白質(zhì)核酸、糖類、脂類、蛋白質(zhì)70Feulgen染色的洋蔥根尖細(xì)胞染色的洋蔥根尖細(xì)胞Feulgen染色染色:鑒定鑒定DNA紫紅色紫紅色 71甲基綠甲基綠-派洛寧染色蛙紅血細(xì)胞派洛寧染色蛙紅血細(xì)胞甲基綠甲基

27、綠-派洛寧染色：派洛寧染色：DNA顯示顯示綠色綠色與與RNA顯示顯示紅色紅色。72PAS染色染色（過碘酸雪夫染色）細(xì)胞含糖原區(qū)呈紫紅色細(xì)胞含糖原區(qū)呈紫紅色 PAS染色法染色法（Periodic Acid-Schiff stain） ：過碘酸雪夫染色過碘酸雪夫染色-鑒定多糖呈現(xiàn)鑒定多糖呈現(xiàn)紫紅色紫紅色 73細(xì)胞內(nèi)脂類顯示細(xì)胞內(nèi)脂類顯示橘黃色橘黃色 蘇丹蘇丹III（三號蘇丹紅）（三號蘇丹紅） ：脂類顯示：脂類顯示橘黃色橘黃色74 考馬斯亮藍(lán)染色顯示細(xì)胞骨架考馬斯亮藍(lán)染色顯示細(xì)胞骨架75 是利用抗體同特定抗原專一結(jié)合的原理，對抗原是利用抗體同特定抗原專一結(jié)合的原理，對抗原進(jìn)行定位定性測定的技術(shù)進(jìn)行定

28、位定性測定的技術(shù)。a. a. 免疫熒光技術(shù)：免疫熒光技術(shù)： b. b. 免疫電鏡技術(shù)：免疫電鏡技術(shù)： （immunoelectron microscopyimmunoelectron microscopy，IEMIEM）膠體金技術(shù)膠體金技術(shù)c. c. 蛋白電泳蛋白電泳(SDS-PAGE)(SDS-PAGE)與免疫印跡反應(yīng)與免疫印跡反應(yīng) (Western-Blot) (Western-Blot) 76抗體抗體Y字形下面的主干部分稱為恒定區(qū)字形下面的主干部分稱為恒定區(qū)(Fc)，所有人的抗體的，所有人的抗體的Fc都是一樣的都是一樣的 ，所有鼠的抗體所有鼠的抗體Fc也都是一樣，所有山羊的也都是一樣，所

29、有山羊的Fc也都是一樣也都是一樣 。ProteinA識別抗體的識別抗體的FC段。段。77金黃色葡萄球菌蛋白金黃色葡萄球菌蛋白A（proteinA）能與數(shù)種哺乳）能與數(shù)種哺乳動物動物IgG分子的分子的Fc段結(jié)合。段結(jié)合。（1）膠體金技術(shù)）膠體金技術(shù)78Immunogold electron microscopy. Electron micrographs of an insulin-secreting cell in which the insulin molecules have been labeled with anti-insulin antibodies bound to tiny c

30、olloidal gold spheres. Most of the insulin is stored in the dense cores of secretory vesicles; in addition, some cores are being degraded in lysosomes.79Figure 3-41. The detergent sodium dodecyl sulfate (SDS) and the reducing agent beta-mercaptoethanol. These two chemicals are used to solubilize pro

31、teins for SDS polyacrylamide-gel electrophoresis. The SDS is shown here in its ionized form. SDS polyacrylamide-gel electrophoresis（2）western技術(shù)技術(shù)8081Figure 3-42. SDS polyacrylamide-gel electrophoresis (SDS-PAGE).Electrophoresis8283PVDF膜表面有膜表面有很多洞洞很多洞洞，通過電轉(zhuǎn)，通過電轉(zhuǎn)， 膠上的蛋白膠上的蛋白被轉(zhuǎn)移到了膜上，蛋白被轉(zhuǎn)移到了膜上，蛋白以機械填補（堆

32、積）和吸附以機械填補（堆積）和吸附的方式結(jié)合的方式結(jié)合于表面。于表面。 電轉(zhuǎn)后的電轉(zhuǎn)后的NC或或PVDF膜上，有很多空白區(qū)，膜上，有很多空白區(qū)，這些洞這些洞洞并沒有填進(jìn)東西，而抗體也是蛋白洞并沒有填進(jìn)東西，而抗體也是蛋白，也會被吸附，也會被吸附在空的洞里，這樣就會有很多非特異的信號。在空的洞里，這樣就會有很多非特異的信號。封閉液中的蛋白可以與表面上的空白位置結(jié)合，同封閉液中的蛋白可以與表面上的空白位置結(jié)合，同樣以機械填補（堆積）和吸附覆蓋的方式結(jié)合在膜樣以機械填補（堆積）和吸附覆蓋的方式結(jié)合在膜上，以上，以避免一抗的非特異結(jié)合避免一抗的非特異結(jié)合，所以起，所以起“封閉封閉”的的作用。這樣抗體就

33、不會被非特異性的吸附到膜上，作用。這樣抗體就不會被非特異性的吸附到膜上，而只會跟而只會跟特異性蛋白結(jié)合特異性蛋白結(jié)合。封閉原理封閉原理84底物化學(xué)發(fā)光底物化學(xué)發(fā)光ECL ,反應(yīng)底物為過氧化物反應(yīng)底物為過氧化物+魯米諾，如遇到魯米諾，如遇到HRP，即發(fā)光，即發(fā)光，可使膠片曝光，可顯影出條帶。可使膠片曝光，可顯影出條帶。辣根過氧化物酶在催化過氧化氫的情況下，魯米諾底物被氧化而產(chǎn)生的發(fā)辣根過氧化物酶在催化過氧化氫的情況下，魯米諾底物被氧化而產(chǎn)生的發(fā)光反應(yīng)光反應(yīng) 原理：原理：利用放射性同位素所發(fā)射出來的利用放射性同位素所發(fā)射出來的帶電離子（帶電離子（或或粒子粒子等）等）作用于鹵化銀乳膠（如作用于鹵化銀

34、乳膠（如X光片光片)，乳膠顆粒，乳膠顆粒曝光曝光形形成成潛影潛影，通過顯影液顯示。，通過顯影液顯示。半衰期：原子不斷衰變，當(dāng)衰變掉一半時所需要的時間半衰期：原子不斷衰變，當(dāng)衰變掉一半時所需要的時間 32P(14天天)、131I(8.1天天)、35S(87天天)、 3H(12.3年年)、 45Ca (164天天)和和14C（5590年）等。年）等。步驟：步驟：測定放射性前體物質(zhì)滲入細(xì)胞后，測定放射性前體物質(zhì)滲入細(xì)胞后，不同時間所在的位置和化學(xué)變化。不同時間所在的位置和化學(xué)變化。86用用3H標(biāo)記亮氨酸標(biāo)記亮氨酸10分鐘后，在高爾基體中出現(xiàn)分鐘后，在高爾基體中出現(xiàn)45分鐘后，在分泌泡中出現(xiàn)分鐘后，在分泌泡中出現(xiàn)8788染色染色89Figure 3-31. A fluorescence-activated cell sorter. When a cell passes through the laser beam, it is monitored for fluorescence. Droplets containing single cells are given a negative or positive charge, depending