Gene_6000_熒光定量PCR儀介紹

1、Rotor-Gene 6000Rotor-Gene 6000熒光定量熒光定量PCRPCR儀儀儀器概述Rotor-Gene 6000采用轉(zhuǎn)子式設(shè)計(jì)的檢測系統(tǒng)用于檢測、定量和對樣品的基因型進(jìn)行分析Rotor-Gene 6000的升降溫示意圖。Rotor-Gene 6000具有轉(zhuǎn)子式設(shè)計(jì)樣品以400rpm持續(xù)離心，防止樣品凝結(jié)，除去氣泡，省去了反應(yīng)前離心步驟。樣品在空氣倉內(nèi)加熱和降溫。通過蓋上的鎳鉻線圈加熱。通過頂部氣孔將熱空氣排出，底部風(fēng)扇吹入冷空氣實(shí)現(xiàn)降溫。Rotor-Gene 6000光學(xué)系統(tǒng)示意圖?？勺赃x的6個(gè)激發(fā)光源和6片檢測濾鏡樣品由反應(yīng)倉底部的的發(fā)光二極管激發(fā)能量通過薄壁管底部激發(fā)染料

2、發(fā)射熒光通過反應(yīng)倉側(cè)壁的發(fā)射濾鏡由光電倍增管收集光信號常用配件36-孔轉(zhuǎn)子 36-孔轉(zhuǎn)子壓環(huán) 72-孔轉(zhuǎn)子72-孔轉(zhuǎn)子壓環(huán)Rotor 支架準(zhǔn)備一個(gè)反應(yīng)1. 選擇轉(zhuǎn)子類型36孔轉(zhuǎn)子及壓環(huán)，使用0.2ml的管子，在實(shí)驗(yàn)中最為常用。管子無需是頂部透明的，因?yàn)闊晒庑盘柺怯晒艿撞繖z測的?，F(xiàn)在同樣可以使用圓蓋的管子。 72孔轉(zhuǎn)子和壓環(huán)，使用0.1ml的四聯(lián)管，它允許最小達(dá)5ul的反應(yīng)體積。它的蓋子提供了安全可靠的密封性準(zhǔn)備一個(gè)反應(yīng)2.反應(yīng)設(shè)置將反應(yīng)管插入樣品板、分裝試劑蓋好管蓋，確保蓋緊。準(zhǔn)備一個(gè)反應(yīng)將三針壓環(huán)固定在轉(zhuǎn)子上，壓環(huán)保證了反應(yīng)中蓋子與管子的緊密結(jié)合。反應(yīng)管插入相應(yīng)的轉(zhuǎn)子，確保每個(gè)管子都正確放置

3、，可選配轉(zhuǎn)子支撐架以便于管子的放置。為了達(dá)到最大的溫度均一性，轉(zhuǎn)子中的每個(gè)孔都必需放置有管子。為了達(dá)到最大的溫度均一性，轉(zhuǎn)子中的每個(gè)孔都必需放置有管子。將插好管子的轉(zhuǎn)子固定在Rotor-Gene的中心轉(zhuǎn)軸上。軸上的位置指針保證轉(zhuǎn)子的正確安裝。要拆下轉(zhuǎn)子，只需推動上部的轉(zhuǎn)子桿即可釋放轉(zhuǎn)子。設(shè)置一個(gè)運(yùn)行新的反應(yīng)可用快速啟動進(jìn)行設(shè)置?？焖賳酉?qū)共僮髡吣軌虮M快的完成設(shè)置，開始一個(gè)反應(yīng)，向?qū)?nèi)含有多個(gè)程序模板，它們包括了默認(rèn)的循環(huán)條件下及采集通道。第一步是選擇一個(gè)運(yùn)行模板：Perform Last Run:從上一個(gè)反應(yīng)中導(dǎo)入循環(huán)設(shè)置、通道設(shè)置及樣品定義。Three Step with Melt：三步

4、法并運(yùn)行熔解曲線，信號采集為FAM/SYBR通道。Two Step：雙標(biāo)記探針，默認(rèn)兩步法，信號采集為所有通道。設(shè)置一個(gè)運(yùn)行選擇轉(zhuǎn)子類型選中壓環(huán)已蓋緊的小框，以繼續(xù)向?qū)Р僮髟O(shè)置一個(gè)運(yùn)行可輸入操作者的名字及注釋信息必需輸入PCR反應(yīng)體積。反應(yīng)體積為20-25 uL設(shè)置一個(gè)運(yùn)行修改溫度循環(huán)通道設(shè)置點(diǎn)擊Edit ProfileEdit Profile編輯鍵進(jìn)入編輯器以修改循環(huán)條件及選擇采集通道設(shè)置一個(gè)運(yùn)行流程編輯器在選中的循環(huán)后插入一個(gè)循環(huán)在選中的循環(huán)后插入一個(gè)循環(huán)在選中的循環(huán)前插入一個(gè)循環(huán)在選中的循環(huán)前插入一個(gè)循環(huán)從流程中刪除選中的循環(huán)從流程中刪除選中的循環(huán)設(shè)置一個(gè)運(yùn)行設(shè)定循環(huán)的重復(fù)數(shù)設(shè)定溫度/時(shí)

5、間窗口中顯示了每一個(gè)循環(huán)點(diǎn)擊左側(cè)溫度和時(shí)間指示并進(jìn)行修改通過右側(cè)的+/-鍵進(jìn)行添加或刪除循環(huán)設(shè)置一個(gè)運(yùn)行采集可在循環(huán)中的任一步，任一個(gè)通道設(shè)置點(diǎn)擊Not AcquisitionNot Acquisition鍵。點(diǎn)擊后，會顯示采集窗口。設(shè)置一個(gè)運(yùn)行染料通道選擇表可以根據(jù)使用的染料找出相應(yīng)的通道要設(shè)置采集通道，只需將可用通道列表中的通道添加到采集通道中即可設(shè)置一個(gè)運(yùn)行完成設(shè)置后點(diǎn)擊CalibrateCalibrate校正鍵以進(jìn)入增益值校正窗口設(shè)置一個(gè)運(yùn)行自動增益校正讓機(jī)器自動進(jìn)行校正，直至所有選中的通道的熒光讀數(shù)都落在一個(gè)閾值范圍內(nèi)；優(yōu)化所有/ /優(yōu)化采集：“優(yōu)化所有”將校正軟件所知的所有通道。選

6、擇“優(yōu)化采集”將只校正該反應(yīng)中所用到的通道（循環(huán)和熔解）；通道設(shè)置：這是一個(gè)下拉式的菜單，允許你向增益值校正窗口中添加新的通道，選中需要的通道并點(diǎn)擊添加 。設(shè)置一個(gè)運(yùn)行總結(jié)反應(yīng)的總體情況。確定參數(shù)設(shè)置。點(diǎn)擊Start RunStart Run開始反應(yīng)。 設(shè)置一個(gè)運(yùn)行此時(shí)會彈出文件保存窗口該文件包括一次運(yùn)行的所有信息設(shè)置一個(gè)運(yùn)行當(dāng)反應(yīng)開始后，可以在等待反應(yīng)完成的這段時(shí)間里輸入樣品的類型及描述。這一界面的功能與樣品樣品編輯器編輯器完全一致。你同樣也可以在反應(yīng)結(jié)束后對樣品進(jìn)行編輯。程序運(yùn)行后，可以在軟件界面上實(shí)時(shí)觀察到如下的窗口：顯示原始的熒光信號收集界面，溫度界面和反應(yīng)進(jìn)程界面，窗口右邊是樣品信息

7、欄。通過此界面可以實(shí)時(shí)檢測PCR 反應(yīng)，反應(yīng)剩余時(shí)間，以及升降溫情況。原始的熒光信號收集界面溫度界面反應(yīng)進(jìn)程界面反應(yīng)完成后，可通過“Analysis”鍵，對結(jié)果進(jìn)行分析。選擇所需要的分析方法，如：定量分析，熔解曲線分析等之后，按鍵，則可以在窗口中看到相關(guān)圖表結(jié)果?！癘ther”里有其他分析方法。Comparative Delta-delta Ct Comparative Delta-delta Ct 定量流程簡介1.先對樣品中的目的基因與看家基因分別做標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線確定兩個(gè)基因的擴(kuò)增效率是否一致或接近，將擴(kuò)增效率優(yōu)化為一致；2.同一樣品分別進(jìn)行看家基因和目的基因的擴(kuò)增，分列在兩頁中Co

8、mparative Delta-delta Ct Comparative Delta-delta Ct 定量流程簡介 反應(yīng)最初，雖然產(chǎn)物是指數(shù)增長，但是熒光處于背景水平，檢測不到熒光增加。當(dāng)累積了足夠的擴(kuò)增產(chǎn)物，可以產(chǎn)生可檢測的熒光信號時(shí)，這個(gè)循環(huán)數(shù)叫初始循環(huán)數(shù)，即Ct。 由于Ct值處于指數(shù)期內(nèi)，這時(shí)的反應(yīng)成分不會抑制擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行，因此熒光定量PCR結(jié)果是可靠的，可以準(zhǔn)確的反映反應(yīng)體系中模板的初始量。 假定的例子介紹使用Delta-delta Ct 法來決定一個(gè)目標(biāo)基因（p53）在腫瘤和正常卵巢組織的表達(dá)的相對水平。Comparative Delta-delta Ct Comparative

9、Delta-delta Ct 定量流程簡介例子：正常和腫瘤組織50ngRNA得到的cDNA用來分析p53（目標(biāo)基因）和GAPDH（參照基因）。 研究表明GAPDH在正常和腫瘤組織中沒有差異。 樣品 Ct p53（目標(biāo)基因） Ct GAPDH（參照基因） 正常（校準(zhǔn)樣本） 15.0 16.5 腫瘤（試驗(yàn)樣本） 12.0 15.9進(jìn)行相對定量分析之前，在檢測和校準(zhǔn)的樣品中靶基因的Ct值和內(nèi)參的Ct值進(jìn)行歸一化： Ct（正常）=15.0-16.5=-1.5 Ct（腫瘤）=12.0-15.9=-3.9然后，試驗(yàn)樣本與校準(zhǔn)樣本的 Ct值進(jìn)行歸一化 Ct = Ct（腫瘤）- Ct（正常）=-3.9-(-1

10、.5)=-2.4最后，計(jì)算表達(dá)比率： 2 - Ct =2-（-2.4）=5.3因此，腫瘤組織細(xì)胞的p53表達(dá)水平比正常細(xì)胞高5.3倍。Comparative Delta-delta Ct Comparative Delta-delta Ct 法的特點(diǎn)、注意事項(xiàng)1). 1). Comparative Delta-delta Ct 法是常用的相對定量方法，其最大特點(diǎn)是，當(dāng)優(yōu)化的體系已經(jīng)建立后，在每次實(shí)驗(yàn)中無需再對看家基因和目的基因做標(biāo)準(zhǔn)曲線，而只需對待測樣品分別進(jìn)行PCR 擴(kuò)增即可。2). 2). 其缺點(diǎn)是，每次實(shí)驗(yàn)都默認(rèn)目的基因和看家基因的擴(kuò)增效率一致，而并非真實(shí)擴(kuò)增情況的反映，這里勢必存在一定

11、的誤差。3). 3). Comparative Delta-delta Ct 法展開定量實(shí)驗(yàn)前，在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，必需對目的基因和看家基因做兩組標(biāo)準(zhǔn)曲線。Rotor-Gene 的軟件會自動給出兩組標(biāo)準(zhǔn)曲線的R 值、擴(kuò)增效率等信息，如果兩組標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，即M 值的差小于0.1，那么后續(xù)實(shí)驗(yàn)中就可以用Comparative Delta-delta Ct 法進(jìn)行相對定量分析。反之，如果M 差值大于0.1，就無法用該方法進(jìn)行相對定量分析。此時(shí)的解決方法有兩種，一是優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，使兩組標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率差值小于0.1，二是換用其它的相對定量方法。Comparative Delta-delta Ct Comparat

12、ive Delta-delta Ct 定量流程簡介Comparative Delta-delta Ct Comparative Delta-delta Ct 定量流程簡介應(yīng)用實(shí)例：將標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行梯度稀釋后，分別對目的基因和看家基因做標(biāo)準(zhǔn)曲線軟件自動繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并給出相應(yīng)的參數(shù)。兩組標(biāo)準(zhǔn)曲線的M 值的差值0.1Comparative Delta-delta Ct Comparative Delta-delta Ct 定量流程簡介在完成上述預(yù)實(shí)驗(yàn)之后，接下來就可以正式對待測樣品進(jìn)行定量分析。在該實(shí)驗(yàn)中，分別對待測樣品的看家基因和目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，下圖即為一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的擴(kuò)增分析結(jié)果：為進(jìn)行Compara

13、tive Delta-delta Ct 分析，需要對樣品進(jìn)行一些編輯。簡而言之，即將目的基因和看家基因分別編輯在兩頁中（page），并將同一樣品命名成相同名稱。Comparative Delta-delta Ct Comparative Delta-delta Ct 定量流程簡介在該實(shí)驗(yàn)中，分別對三個(gè)樣品A、B、C 進(jìn)行了分析，其中1-9 號管檢測了看家基因，10-18 號管檢測了目的基因?？赏ㄟ^NEW 新建一個(gè)page，并通過Selected 選擇每頁中分析的對像。將兩組基因分別編輯在兩頁中，并將相同的樣品命名成同一名稱后，即為下圖所示：Comparative Delta-delta Ct

14、Comparative Delta-delta Ct 定量流程簡介Page 2：目的基因，其中10-18 號管通過YES選中，樣品分別命名為A、B、C，其它未選中的樣品可以不進(jìn)行編輯。Page 1：看家基因，其中1-9 號管通過YES選中，樣品分別命名為A、B、C，其它未選中的樣品可以不進(jìn)行編輯。Comparative Delta-delta Ct Comparative Delta-delta Ct 定量流程簡介樣品編輯好后就可進(jìn)行分析工作。通過進(jìn)入Analysis，分別對page1 和page2進(jìn)行分析。注意：由于沒有標(biāo)準(zhǔn)品，軟件無法自動給出閾值，需用手動設(shè)定，軟件會提示需手動進(jìn)行閾值設(shè)定

15、，此時(shí)只要在熒光曲線圖中上下拖動光標(biāo)即可。Comparative Delta-delta Ct Comparative Delta-delta Ct 定量流程簡介完成兩頁分析之后，再進(jìn)入Delta Delta CT 分析界面，選擇show，此時(shí)，軟件的向?qū)Ы缑鏁崾臼褂谜咭徊酵瓿稍O(shè)置：第一項(xiàng)：Validation Run Performed，提示是否已驗(yàn)證過兩個(gè)基因的擴(kuò)增效率一致，可用該定量方法進(jìn)行分析。選擇Yes；第二項(xiàng)：Gene of Interest Quantitation，選中Page 1 或Page 2 中編輯了目的基因的那一頁；第三項(xiàng)：Normaliser Quantitatio

16、n，選中Page 1 或Page 2 中編輯了看家基因的那一頁；第四項(xiàng)：Calibrator Defined，選中A、B、C 三個(gè)樣品中用來作為對照組的一個(gè)。Comparative Delta-delta Ct Comparative Delta-delta Ct 定量流程簡介完成上述四項(xiàng)設(shè)置之后，在窗口右側(cè)就顯示相對定量結(jié)果，如圖所示：結(jié)果給出三個(gè)樣品目的基因和看家基因的平均CT 值，以及樣品B、C 中目的基因的濃度相對于對照組A 的比值。雙雙 標(biāo)標(biāo) 準(zhǔn)準(zhǔn) 曲曲 線線 法法 定定 量量 流流 程程1). 1). 用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量時(shí)，每次每個(gè)基因都需要做目的基因和看家基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，必需有一

17、組穩(wěn)定的標(biāo)準(zhǔn)品。2). 2). 同一樣品做標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別對目的基因和看家基因做標(biāo)準(zhǔn)曲線，分列在兩頁上。雙雙 標(biāo)標(biāo) 準(zhǔn)準(zhǔn) 曲曲 線線 法法 定定 量量 流流 程程雙雙 標(biāo)標(biāo) 準(zhǔn)準(zhǔn) 曲曲 線線 法法 定定 量量 流流 程程雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法的特點(diǎn)、注意事項(xiàng)及實(shí)際應(yīng)用1. 雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法做相對定量分析的最大特點(diǎn)是，應(yīng)用簡便，無需像Delta-delta CT 法那樣對實(shí)驗(yàn)進(jìn)行嚴(yán)格的優(yōu)化。2. 其不足之處是每次實(shí)驗(yàn)都必需對目的基因和看家基因做兩組標(biāo)準(zhǔn)曲線。3. 并且，如果用于做標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)品不同于樣品，比如標(biāo)準(zhǔn)品為質(zhì)?；蚣兓腜CR 產(chǎn)物，而待測樣品為cDNA，那么標(biāo)準(zhǔn)曲線的擴(kuò)增效率并不能真實(shí)地反映樣品的擴(kuò)

18、增情況，因此以標(biāo)準(zhǔn)曲線來計(jì)算樣品的實(shí)際濃度就存在一定誤差。雙雙 標(biāo)標(biāo) 準(zhǔn)準(zhǔn) 曲曲 線線 法法 定定 量量 流流 程程樣品管1-6 為目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線， 7-12 為看家基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線；待測樣品A、B、C， 15-17 擴(kuò)增了樣品的看家基因， 18-20 擴(kuò)增了樣品的目的基因。雙雙 標(biāo)標(biāo) 準(zhǔn)準(zhǔn) 曲曲 線線 法法 定定 量量 流流 程程在用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法做相對定量之前，同樣需要對樣品進(jìn)行一些編輯。方法與Delta-delta CT 法類似，即將所有目的基因編輯在一個(gè)page 里，所有看家基因編輯在另一個(gè)page 里，且相同的樣品以同樣名稱命名。Page 1：看家基因，其中7-12 號管為標(biāo)準(zhǔn)曲線，

19、通過YES 選中，15-17 號管為待測樣品，分別命名為A、B、C，其它未選中的樣品可不以不進(jìn)行編輯。Page 2：目的基因，其中1-6 號管為標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過YES 選中，18-20 號管為待測樣品，分別命名為A、B、C，其它未選中的樣品可不以不進(jìn)行編輯。雙雙 標(biāo)標(biāo) 準(zhǔn)準(zhǔn) 曲曲 線線 法法 定定 量量 流流 程程樣品編輯好后就可進(jìn)行分析工作，從Other 進(jìn)入，選擇2 Standard Curves Relative Quantitation。根據(jù)提示向?qū)б来瓮瓿稍O(shè)置。依次選中目的基因的page、看家基因的page 以及對照組（例，以A 為對照組）雙雙 標(biāo)標(biāo) 準(zhǔn)準(zhǔn) 曲曲 線線 法法 定定 量量 流流 程程結(jié)果包括計(jì)算所得的各標(biāo)準(zhǔn)品及待測樣品的濃度以及樣品B、C 的目的基因相對于對照組A 的濃度。用用SYRB GreenSYRB Green進(jìn)行體系的優(yōu)化與驗(yàn)證進(jìn)行體系的優(yōu)化與驗(yàn)證檢測特異性：熔解曲線熔解曲線、瓊脂糖凝膠電泳、酶切、測序借助溫度梯度溫度梯度優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件并驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)體系最合合的的退溫度高特異性、高產(chǎn)率發(fā)現(xiàn)并并除除物二二體的的在在威發(fā)現(xiàn)并并除擴(kuò)增子二二結(jié)結(jié)的的在在威降降除物濃度差異的的在在威利用標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線檢驗(yàn)驗(yàn)證下列因素?cái)U(kuò)增效率標(biāo)準(zhǔn)品的動動范圍PCR抑制劑的存在與影響特特 異異 性性樣本熔解曲線圖中有單一清晰的峰陰性對照中無