飼料中粗蛋白檢測

1、-袁基策袁基策 干物質(zhì)干物質(zhì)水分水分礦物質(zhì)礦物質(zhì)有機(jī)物有機(jī)物粗蛋白粗蛋白維生素維生素氨化物氨化物真蛋白真蛋白無氮物無氮物碳水化合物碳水化合物粗脂肪粗脂肪粗纖維粗纖維無氮浸出物無氮浸出物飼料飼料蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)是一種復(fù)雜的有機(jī)化合物。氨基酸是組成蛋白質(zhì)的基本單位，氨基酸通過脫水縮合連成肽鏈。蛋白質(zhì)是由一條或多條多肽鏈組成的生物大分子，每一條多肽鏈有二十至數(shù)百個(gè)氨基酸殘基（-R）不等；各種氨基酸殘基按一定的順序排列。蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)圖蛋白質(zhì)是由C（碳）、H（氫）、O（氧）、N（氮）組成，一般蛋白質(zhì)可能還會含有P（磷）、S（硫）、Fe（鐵）、Zn（鋅）、Cu（銅）、B（硼）、Mn(錳)、I（碘）、Mo（

2、鉬）等。這些元素在蛋白質(zhì)中的組成百分比約為：碳50% 氫7% 氧23% 氮16% 硫03% 其他微量一切蛋白質(zhì)都含一切蛋白質(zhì)都含N元素，且各種蛋白質(zhì)的含氮量元素，且各種蛋白質(zhì)的含氮量很接近，平均為很接近，平均為16%； ：任何生物樣品中每1g元N的存在，就表示大約有100/16=6.25g蛋白質(zhì)的存在， 6.25常稱為蛋白質(zhì)數(shù)。反芻動物飼料中的粗蛋白包括兩個(gè)部分： 真蛋白： 即上述提到的由肽鏈構(gòu)成的蛋白質(zhì)。也稱為純蛋白。 主要由飼料原料中的餅粕類提供。 非蛋白氮：(Nonprotein NitrogenNPN) 非蛋白氮是指除真蛋白(多肽)以外的其他所有含氮物質(zhì)化合物，主要是一些有機(jī)非蛋白氮化

3、合物如氨、酰胺、胺、氨基酸和無機(jī)氮化合物如銨鹽類。作為非蛋白氮補(bǔ)充飼料的一般為氨的衍生物：尿素、雙縮脲、氨、銨鹽及其它合成的簡單含氮化合物。作為簡單的純化合物質(zhì)，NPN對動物不能提供能量，其作用只是供給瘤胃微生物合成蛋白質(zhì)所需的氮源，以節(jié)省飼料蛋白質(zhì)。 凱氏定氮法質(zhì)譜分析法（MS）雙縮脲法（Biuret法）福林酚試劑法（Lowry法，F(xiàn)olin-酚法）考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）電泳法凱氏定氮法是測定化合物或混合物中總氮量的一種方法也是國家對飼料檢測的標(biāo)準(zhǔn)方法國家對飼料檢測的標(biāo)準(zhǔn)方法。即在有催化劑的條件下，用濃硫酸消化樣品將有機(jī)氮都轉(zhuǎn)變成無機(jī)銨鹽，然后在堿性條件下將銨鹽轉(zhuǎn)化為 氨，隨水蒸

4、氣餾出并為過量的酸液吸收，再以標(biāo)準(zhǔn)堿滴定，就可計(jì)算出樣品中的氮量。然后乘上蛋白質(zhì)常數(shù)，就得出了樣品中蛋白質(zhì)含量。凱氏定氮法測定的是含氮量，即飼料中包括NPN的總蛋白（粗蛋白含量）。特點(diǎn)是結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好。缺點(diǎn)是操作復(fù)雜，耗時(shí)耗試劑。原理：通過電源將蛋白質(zhì)分子轉(zhuǎn)化為氣相離子（電離），然后利用質(zhì)樸分析儀的電場、磁場將具有特定質(zhì)量與電荷比值（M/Z值）的蛋白質(zhì)離子分離開來，經(jīng)過離子檢測器收集離子，確定其M/Z值，分析鑒定蛋白質(zhì)含量。優(yōu)點(diǎn)是很高的靈敏度，能提供亞微克級的檢測結(jié)果，適用于復(fù)雜配方中微量蛋白質(zhì)的鑒定和結(jié)構(gòu)測定。如使用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法可準(zhǔn)確分辨出真蛋白與非蛋白氮的種類和含量。能準(zhǔn)確

5、測定出每一種蛋白質(zhì)的含量，但需要復(fù)雜的技術(shù)水平和精密的儀器設(shè)備。且檢測成本極高。雙縮脲法為傳統(tǒng)的分光光度法測定蛋白質(zhì)的方法，當(dāng)含有兩個(gè)或者兩個(gè)以上肽鍵的物質(zhì)和堿性的硫酸銅反應(yīng)時(shí)，形成紫色的絡(luò)合物，這個(gè)顏色產(chǎn)物是肽鍵中的氮原子和銅離子配價(jià)結(jié)合的結(jié)果。形成顏色產(chǎn)物的量取決于蛋白質(zhì)的濃度，且在一定條件下顏色的深淺與蛋白質(zhì)的濃度成正比，因此可以根據(jù)分光光度法來測量蛋白質(zhì)的含量。可以檢測出真蛋白的含量。雙縮脲法檢測特異性和準(zhǔn)確度好，呈色穩(wěn)定性好，試劑單一，方法簡便，但靈敏度不高，約為lmg?？赡軙伙暳现刑砑拥陌被嵊绊?。Folin一酚法的原理與雙縮脲法大體相同，利用蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合產(chǎn)生雙縮脲反應(yīng)

6、。同時(shí)也由于Folin一酚試劑中的磷鉬酸一磷鎢酸試劑被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產(chǎn)生深藍(lán)色的鉬藍(lán)和鎢藍(lán)的混合物。在一定的條件下，藍(lán)色深度與蛋白的量成正比。由此可測定蛋白質(zhì)的含量。由于NPN中不含肽鍵，所以測定是真蛋白的含量。Folin一酚法是蛋白質(zhì)測定法中最靈敏的方法之一，對水溶性蛋白質(zhì)含量的測定很有效。但飼料中過量添加的氨基酸會對檢測結(jié)果造成一定的影響?？捡R斯亮藍(lán)G250是一種有機(jī)染料，在游離狀態(tài)下呈紅色，在稀酸溶液中與蛋白質(zhì)的堿性氨基酸(特別是精氨酸)和芳香族氨基酸殘基結(jié)合后變?yōu)樗{(lán)色。蛋白質(zhì)在11000微克范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)-色素結(jié)合物在595nm波長下的吸光度與蛋白質(zhì)含量成正比，故

7、可用于蛋自質(zhì)的定量測定。是目前靈敏度最高的檢測方法?？蓽?zhǔn)確測定真蛋白的含量。該法方法簡便，易于操作，所用試劑較少，顯色劑易于配制，干擾物質(zhì)少。缺點(diǎn)是蛋白質(zhì)含量較高（超過150g/ML）時(shí)結(jié)果偏差較大。電泳是指在電場作用下，帶電粒子向著與其所帶電荷電性相反的電極移動的現(xiàn)象。電泳法就是指帶電荷的蛋白質(zhì)在惰性支持介質(zhì)(如濾紙、醋酸纖維素、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等)中，在電場的作用下，向其對應(yīng)的電極方向按各自的速度進(jìn)行泳動，由于各組分之間的移動速度不同，使各組分分離成狹窄的區(qū)帶，并用適宜的檢測方法記錄其電泳區(qū)帶圖譜或計(jì)算其百分含量的方法。近年來蛋白質(zhì)凝膠電泳技術(shù)在國際上迅猛發(fā)展，已成為高分辨(等電

8、聚焦，0001pH)，高靈敏度(銀染色，熒光染色，ng級)和獲得大量信息(雙向電泳，近萬個(gè)點(diǎn))的現(xiàn)代技術(shù)。目前，運(yùn)用于蛋白質(zhì)檢測的電泳法有雙向凝膠電泳法、毛細(xì)管電泳法、火箭免疫電泳法等常用與飼料分析的是SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法。聚丙烯酰胺凝膠電泳法。此方法有操作簡便、快速、樣品用量少、高自動化等優(yōu)點(diǎn)。但是也存在核酸、多糖、脂類等干擾分子，影響檢測結(jié)果。尿素是一種不帶電荷的水溶性化合物。而蛋白質(zhì)是帶有負(fù)電荷的有機(jī)物質(zhì)。故此方法只能檢測出真蛋白的含量。此方法要求技術(shù)水平較高，設(shè)備和耗材的價(jià)格昂貴，且需要建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。目前實(shí)際意義不大。聚丙烯酰胺凝膠電泳可根據(jù)不同種類的蛋白質(zhì)分子所帶電荷的差異及

9、分子大小的不同所產(chǎn)生的不同遷移率將蛋白質(zhì)分離成若干條區(qū)帶，如果分離純化的樣品中只含有同一種蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)樣品電泳后，就應(yīng)只分離出一條區(qū)帶。飼料中的蛋白質(zhì)含有許多種類，會在凝膠上出現(xiàn)多條區(qū)帶，需要分別計(jì)算每條區(qū)帶所表達(dá)的蛋白質(zhì)含量，然后統(tǒng)計(jì)分析出蛋白含量，其過程復(fù)雜且技術(shù)含量極高。愛德使用的方法只是初步的判斷蛋白質(zhì)種類和含量的多少，并不能計(jì)算出準(zhǔn)確的含量。愛德的實(shí)驗(yàn)結(jié)果豆代表豆粕 棉代表棉粕11316 21612 31812 4犢牛顆?？蛻魧ξ覀儺a(chǎn)品的檢測結(jié)果存在質(zhì)疑時(shí)應(yīng)解釋清楚試驗(yàn)方法的不同對結(jié)果的影響非常大，因?yàn)槲覀兊漠a(chǎn)品是合法且科學(xué)地添加了NPN，不會對奶牛和牛奶品質(zhì)產(chǎn)生不良影響。建議客戶使用凱氏定氮法進(jìn)行檢測。取樣過程對檢測結(jié)果的 影響非常大，從黃梅愛德的電泳結(jié)果來看，只有2種可能：一是取樣時(shí)取的粉料的上層。因運(yùn)輸或搬運(yùn)過程中的震蕩，比重較輕的麩皮等物質(zhì)漂浮在袋口上層，比重較大的餅粕類飼料位于中下層。另一種可能就是取得的樣品被別有用心的人摻入了其他物質(zhì)或被掉包。我們以后在取樣時(shí)應(yīng)盡量混合均勻后取樣或者抽取中下層樣品，以免檢測結(jié)