DB44∕T 2346-2021 木麻黃青枯菌強(qiáng)致病性菌株篩選技術(shù)規(guī)程

1、 ICS65.020.40CCS B6144廣 東 省 地 方 標(biāo) 準(zhǔn)DB44/T23462021木麻黃青枯菌強(qiáng)致病性菌株篩選技術(shù)規(guī)程Technical regulations on screening strains of Ralstonia solanacearum with highpathogenicity to Casuarina spp.2021-12-07發(fā)布2022-03-07實(shí)施 DB44/T23462021目次前言.II1范圍.12規(guī)范性引用文件.13術(shù)語和定義.14原理與方法.15儀器用具.26培養(yǎng)基與試劑.27病菌分離與純化.28檢測鑒定.39菌株鑒定.510強(qiáng)致病性菌

2、株篩選.511菌種保存.5附錄A（資料性）木麻黃青枯菌.6附錄B（規(guī)范性）培養(yǎng)基及試驗(yàn)方法.7附錄C（規(guī)范性）試驗(yàn)調(diào)查表格.11I DB44/T23462021前言本文件按照GB/T1.12020標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則的規(guī)定起草。II DB44/T23462021木麻黃青枯菌強(qiáng)致病性菌株篩選技術(shù)規(guī)程1范圍本文件規(guī)定了木麻黃青枯菌（Ralstoniasolanacearum）分離與純化、檢測鑒定方法、菌株鑒定、強(qiáng)致病性菌株篩選及菌種保存等技術(shù)要求。本文件適用于木麻黃屬植物強(qiáng)致病性青枯菌菌株的篩選。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少

3、的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB4789.28-2013食品微生物學(xué)檢驗(yàn)培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。青枯菌Ralstoniasolanacearum病害英文名：BacterialwiltofCasuarina；屬細(xì)菌界Bacteria，變形菌門Proteobacteria，b-變形菌綱Betaproteobacteria，伯克氏菌目Burkholderiales，伯克氏菌科Burkholderiaceae，青枯菌屬Ralstonia。病原菌通過根部從病株蔓延至健

4、株，通過土壤、水流進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播。木麻黃青枯菌的其他信息參見附錄A。強(qiáng)致病性Strongpathogenicability能讓木麻黃植株迅速感病死亡的能力。褐梗小枝Brownlignifiedtwigs基徑2mm5mm的褐色木質(zhì)化小枝，具多分枝。分枝Branch生長在小枝上的綠色枝條。小苗seedling無性系苗或?qū)嵣纾?0cm70cm高。4原理與方法1 DB44/T23462021青枯病菌菌株間存在著顯著的致病性差異，且在木麻黃青枯菌的病理系統(tǒng)中，木麻黃同時存在水平抗性與垂直抗性，利用不同接種方法、不同抗性植物材料與多菌株交互接種測定的方法，才能準(zhǔn)確篩選出強(qiáng)致病性菌株。5儀器用具儀器植物生

5、長培養(yǎng)箱、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫振蕩培養(yǎng)箱、電子天平（精度0.0001g）、生物顯微鏡（具照相系統(tǒng)）、超凈工作臺、高壓滅菌鍋、高速冷凍離心機(jī)（12000r/min）、PCR儀、電泳儀、電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)、離心機(jī)、恒溫水浴鍋（3095）、低溫冰箱、純水機(jī)、渦旋振蕩器、分光光度計(jì)、可調(diào)微量加樣器等。用具鑷子、手術(shù)剪、解剖刀、量筒、燒杯、培養(yǎng)皿、三角瓶、離心管、試管、接種針、接種環(huán)等。6培養(yǎng)基與試劑培養(yǎng)基CPG培養(yǎng)基：按附錄B中的B.1規(guī)定執(zhí)行。TTC培養(yǎng)基：按附錄B中的B.2規(guī)定執(zhí)行。試劑革蘭氏染色試劑：按附錄B中的B.3規(guī)定執(zhí)行。PCR檢測所需試劑：按附錄B中的B.4規(guī)定執(zhí)行。2,3,5-三苯基氯化

6、四氮唑（TTC）7病菌分離與純化病株判斷小枝黃化，稀疏、凋落，枯枝枯梢多；根系發(fā)黑腐爛；木質(zhì)部局部或全部變褐色至黑褐色；樹皮?？v裂成潰瘍狀；壞死根莖有水浸臭味；根、主莖、側(cè)枝橫切面?zhèn)谟腥榘咨咙S褐色的細(xì)菌膿液溢出。樣本采集挖出病根，剪取直徑0.5cm1.5cm、木質(zhì)部呈水漬狀或半透明狀主根或側(cè)根2段3段，每段10cm20cm，封口袋封裝，記錄采集時間、地點(diǎn)，帶回實(shí)驗(yàn)室分離病菌。病菌分離7.3.1稀釋分離法2 DB44/T23462021取病根（約3cm），自來水洗凈，75的酒精浸泡消毒30s，置無菌水沖洗3次，每次30s，在超凈工作臺上剝?nèi)ネ馄ぃ糜跓o菌培養(yǎng)皿中切除兩端，最后將其橫切成3份5

7、份，放入含有5ml10ml無菌水的培養(yǎng)皿內(nèi)30min，攪拌形成病菌懸浮液。用接種環(huán)蘸取菌液在TTC培養(yǎng)基平板上劃線分離，至少3個平板，編號，于30下恒溫培養(yǎng)24h48h。7.3.2根系溢出法將8cm10cm長的病根洗凈，兩端切成平整的新鮮斷面，把其中一端浸泡于裝有無菌水中的玻璃瓶中，室溫放置12h36h后，在病根的另一端斷面會流出乳白色的菌膿。用接種針挑取菌膿劃線培養(yǎng)于TTC培養(yǎng)基平板上，至少3個平板，編號，置于30下恒溫培養(yǎng)24h48h。病菌純化在培養(yǎng)皿內(nèi)挑取不規(guī)則圓形，乳白色、中心部位粉紅色，具有流動性的單菌落，接種于TTC培養(yǎng)基平板上，30條件下擴(kuò)大培養(yǎng)36h48h，每個菌落接種3個培養(yǎng)

8、皿并編號。病菌培養(yǎng)7.5.1固體培養(yǎng)接種于TTC或CPG固體培養(yǎng)基中，30條件下培養(yǎng)24h48h。7.5.2液體懸浮培養(yǎng)將分離純化后的青枯病菌接種于三角瓶中，CPG液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)，液體培養(yǎng)基體積不超過三角瓶容積的1/2，150r/min200r/min，30條件下培養(yǎng)12h24h。8檢測鑒定菌落特征在TTC固體培養(yǎng)基平板上菌落呈不規(guī)則圓形，略隆起，白色或乳白色，中心部位淡紅色或粉紅色（有的中央部位出現(xiàn)螺旋樣紅色沉著），不透明，具有流動性。形態(tài)特征青枯菌菌體呈短桿狀，兩端鈍圓，大小為（1.5 mm2.5 mm）×（0.5 mm0.7 mm），多數(shù)無鞭毛，少數(shù)具1根3根極生鞭毛，無芽

9、胞，無莢膜。革蘭氏染色按GB4789.28-2013中的方法進(jìn)行革蘭氏染色反應(yīng)。若革蘭氏染色呈陰性，則進(jìn)行下一步檢測。16SrRNA測序鑒定從分離的菌株中提取DNA作為模板，PCR擴(kuò)增青枯菌16SrRNA基因片段，以無菌雙蒸水模板做為空白對照，用已知青枯菌菌株DNA做陽性對照，擴(kuò)增目的片段大小約為280bp。PCR產(chǎn)物回收后測序、比對，具體檢測方法步驟按附錄B中的B.4規(guī)定執(zhí)行。LAMP快速檢測3 DB44/T23462021以青枯菌的lpxC基因序列作為檢測靶標(biāo)，設(shè)計(jì)4條LAMP特異性引物，其中F3（5-CCTGTACGTGGTCGGCTAT-3）和B3（5-ACCGCAACACGGGATC

10、A-3）為外側(cè)引物，F(xiàn)IP（5-TACGCCGTTTCATCGGCCAGGTACACGGCGCACAAGT-3）和BIP（5-ATCGTCACGTTCGACAAGGTGGAATGCCGGCTGCAACTG-3）為內(nèi)側(cè)引物。LAMP反應(yīng)結(jié)束后對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，具體檢測方法步驟按附錄B中的B.5規(guī)定執(zhí)行。致病性測定8.6.1褐梗小枝水培接種材料選擇對青枯病抗性具有差異的木麻黃無性系，如A13與K18（感?。珿1與30（抗?。┑?。方法恒溫水培接種法，具體操作方法按附錄B中的B.6規(guī)定執(zhí)行。相對病害強(qiáng)度分級標(biāo)準(zhǔn)相對病害強(qiáng)度分級標(biāo)準(zhǔn)如下：a)0級：分枝無癥狀

11、，級數(shù)值為0；b)1級：分枝萎蔫下垂，保持綠色，級數(shù)值為1；c)2級：分枝枯黃、萎蔫下垂，級數(shù)值為2；d)3級：分枝干枯死亡，級數(shù)值為3。病情指數(shù)病情指數(shù)是全面考慮發(fā)病率與嚴(yán)重度的綜合指標(biāo)。病情指數(shù)按式（1）計(jì)算。楰 ······························

12、3;································(1) 式中：ID病情指數(shù)；Ni各級病級分枝數(shù)；Gi各級病級相應(yīng)級數(shù)值；Gk最高級數(shù)值；Nt調(diào)查總分枝數(shù)。8.6.2小苗盆栽接種材料選擇對青枯病抗性具有差異的木麻黃無性系，如A13與K18（感?。?，

13、G1與30（抗病）等。方法移栽浸根接種法，具體操作方法按附錄B中的B.7規(guī)定執(zhí)行。死亡率計(jì)算4 DB44/T23462021以株為單位調(diào)查，記錄無病植株與死亡植株數(shù)。死亡率按式（2）計(jì)算。 楰 × ······························&#

14、183;································(1)式中：P死亡率；D死亡植株數(shù)，單位為株；N調(diào)查總株數(shù)，單位為株。9菌株鑒定分離純化得到的細(xì)菌菌株符合以下幾方面的檢測結(jié)果，則可以判定為青枯菌菌株。a)在TTC半選擇性培養(yǎng)基上的菌落特征與描述相符。b)革

15、蘭氏染色反應(yīng)呈陰性。c)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序結(jié)果與已知的Ralstoniasolanacearum16SrRNA基因序列同源性達(dá)99%以上或經(jīng)LAMP快速檢測，反應(yīng)結(jié)束后反應(yīng)管中反應(yīng)液呈現(xiàn)綠色。10強(qiáng)致病性菌株篩選符合以下兩個方面的檢測結(jié)果，則可以判定為青枯菌強(qiáng)致病性菌株。a)褐梗小枝水培接種法，參試植物材料的病情指數(shù)均在70以上。b)小苗盆栽接種參試植物材料死亡率均在70%以上。11菌種保存蒸餾水保存法將分離純化后的病原菌放入盛有滅菌蒸餾水的試管中，控制菌的濃度約10恒溫冰箱中臨時保存，保存時間不超過1周。78cfu/ml，加塞放入4甘油液保存法將純甘油配制成50%的水溶液，高壓滅菌后置于-2

16、0冰箱待用。保存菌種時將50%甘油與菌液按2:1比例混合，劇烈震蕩，充分混勻，置-20至-80可保存3年左右。液氮超低溫保存法將冰浴過的青枯菌菌懸液分裝到冷凍管內(nèi)，套上熱收縮塑料管，加熱，并使之完全密封。將密封好的冷凍管快速在液氮中冷凍，再將冷凍過的冷凍管放入液氮罐的格子內(nèi)保存，經(jīng)常注意補(bǔ)充液氮，可保存10年以上。冷凍干燥保存法在培養(yǎng)皿中分離純化好菌種后，加入高壓滅菌過的保護(hù)劑，用接種環(huán)將菌苔輕輕刮起，制成菌懸液。將菌懸液分裝于安瓿管中，在-80冰箱預(yù)凍1h2h，再將冷凍后的樣品安瓿管置于冷凍干燥機(jī)內(nèi)開始冷凍干燥8h20h，可保存10年以上。5 DB44/T23462021AA附錄A（資料性）

17、木麻黃青枯菌A.1地理分布亞洲、歐洲、非洲、北美洲、南美洲均有分布；我國主要分布于福建、廣東、廣西、海南、浙江、江蘇、湖北、湖南、江西、云南、貴州、四川、重慶、山東、河南、河北、安徽、北京、天津、上海、臺灣。A.2寄主范圍該病菌可侵染茄科、豆科、芭蕉科等54個科的450余種植物，主要有：木麻黃、桉樹、番茄、馬鈴薯、茄子、煙草、香蕉、海里康、桑樹、龍葵、辣椒、花生、芝麻、甘薯、油橄欖和姜等。A.3病株癥狀植株感染青枯菌后，小枝黃化，稀疏、凋落，枯枝枯梢多，根系發(fā)黑腐爛，木質(zhì)部局部或全部變褐色至黑褐色，樹皮常縱裂成潰瘍狀，壞死根莖有水浸臭味，根、主莖、側(cè)枝橫切面?zhèn)谟腥榘咨咙S褐色的細(xì)菌膿液溢出。

18、A.4病原菌形態(tài)特征生物學(xué)特性病菌呈短桿狀，兩端鈍圓，大小為（1.5 mm2.5 mm）×（0.5 mm0.7 mm），多數(shù)無鞭毛，少數(shù)具1根3根極生鞭毛，無芽胞，無莢膜，革蘭氏陰性菌。病菌從植物根系或受傷部位侵入木質(zhì)部的維管束，并在維管束中大量繁殖并迅速擴(kuò)散至整個植株，產(chǎn)生大量胞外多糖、細(xì)胞壁降解酶等物質(zhì)，堵塞維管束中的液流運(yùn)輸，破壞導(dǎo)管組織，從而引起植物萎蔫死亡。A.5木麻黃青枯病病害流行規(guī)律通常發(fā)生在臺風(fēng)暴雨后，造成大量樹木死亡；積水等低洼地容易導(dǎo)致病害發(fā)生；高溫干旱季節(jié)是病害的高發(fā)期。6 DB44/T23462021BB附錄B（規(guī)范性）培養(yǎng)基及試驗(yàn)方法B.1CPG（Casam

19、inoacid-Peptone-Glucose）培養(yǎng)基蛋白胨10g，酪朊水解物1g，葡萄糖5g，蒸餾水1000ml，瓊脂17g（配制液體培養(yǎng)基時不加入瓊脂），調(diào)節(jié)PH至7.0，121濕熱滅菌20min。B.2TTC選擇性培養(yǎng)基蛋白胨10g，酪朊水解物1g，葡萄糖5g，蒸餾水1000ml，瓊脂17g，調(diào)節(jié)PH至7.0，121濕熱滅菌20min后，溫度降至50左右，用過濾滅菌方法加入2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）0.05mg/L。B.3革蘭氏染色法B.3.1結(jié)晶紫染色液結(jié)晶紫1.0g，95%乙醇20.0ml，1%草酸銨水溶液80.0ml，將結(jié)晶紫溶解于乙醇中，然后與草酸銨溶液混合。B.3.

20、2革蘭氏碘液碘1.0g，碘化鉀2.0g，蒸餾水300.0ml，將碘與碘化鉀先進(jìn)行混合，加入蒸餾水少許，充分振搖，待完全溶解后，再加蒸餾水至300ml。B.3.3沙黃復(fù)染液沙黃0.25g，95%乙醇10.0ml，蒸餾水90.0ml，將沙黃溶解于乙醇中，然后用蒸餾水稀釋。B.3.4染色法染色步驟如下：a)將涂片在火焰上固定，滴加結(jié)晶紫染色液，染1min，水洗；b)滴加革蘭氏碘液，作用1min，水洗，用吸水紙吸去水分；c)滴加95%乙醇脫色，約30s；或?qū)⒁掖嫉螡M整個涂片，立即傾去，再用乙醇滴滿整個涂片，脫色10s。水洗，吸去水分；d)沙黃復(fù)染液染1min，自來水沖洗；干燥，鏡檢；e)被染成紫色的細(xì)

21、菌稱為革蘭氏陽性菌（G菌），染成紅色的稱為革蘭氏陰性菌（G菌）。+ B.4PCR檢測方法B.4.1細(xì)菌DNA模板的制備無菌操作下，將純化后的待測菌制成菌懸液，或取可疑植物組織，按照細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒方法提取基因組DNA，測定DNA濃度，-20保存?zhèn)溆谩.4.2引物OLI1：5-GGGGGTAGCTTGCTACCTGCC-37 DB44/T23462021Y2：5-CCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3B.4.3PCR反應(yīng)體系體系為25µL：1×PCR緩沖液（20mMTris-HCl，pH8.4，20mMKCl，10mM(NH4)2SO4，1.5mMM

22、gCl2）0.2mM，dNTP0.2mM，引物各1M，Taq酶1U，模版2L，加ddH2 O至25L。B.4.4PCR反應(yīng)條件變性：96，2min。三溫循環(huán)：94，20s；68，20s；72，30s。50個循環(huán)后，72延伸10min。B.4.5PCR結(jié)果判定2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，如能觀察到280bp左右的PCR產(chǎn)物條帶，則可判定為可疑木麻黃細(xì)菌性青枯病菌，進(jìn)一步測序鑒定，否則為陰性。B.4.6測序?qū)CR產(chǎn)物回收后，進(jìn)行克隆、測序，或者直接測序（測序可由生物公司完成），測序引物為OLI1、Y2。B.4.7比對測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中已有青枯菌（R.solanacearum）

23、菌株的16SrRNA基因序列進(jìn)行比對，同源性99%以上時將該病原菌鑒定為青枯菌。B.5LAMP快速檢測鑒定B.5.1細(xì)菌DNA模板的制備按附件B中的B.4.1規(guī)定執(zhí)行。B.5.2引物設(shè)計(jì)和合成以青枯菌的lpxC作為檢測靶標(biāo)，利用PrimerExplorerVersion4.0（http:/primerexplorer.jp/e/）在線設(shè)計(jì)4條LAMP特異性引物，其中F3（5-CCTGTACGTGGTCGGCTAT-3）和B3（5-ACCGCAACACGGGATCA-3）為外側(cè)引物，F(xiàn)IP（5-TACGCCGTTTCATCGGCCAGGTACACGGCGCACAAGT-3）和BIP（5-ATCG

24、TCACGTTCGACAAGGTGGAATGCCGGCTGCAACTG-3）為內(nèi)側(cè)引物。B.5.3LAMP反應(yīng)體系LAMP反應(yīng)體系設(shè)定為25L：體系中內(nèi)引物FIP和BIP的濃度分別為1.6mol·L，外引物F3和B3-1的濃度分別為0.2mol·L-1，dNTP的濃度為1.4mmol·L-1 -1，甜菜堿1.0mol·L，基礎(chǔ)反應(yīng)液（20mmol·L-1-1Tris-HCl，10mmol·L(NH4)2SO4 ，50mmol·L-1-1KCl，6mmol·LMgSO4 ，0.1%Tween-20），模板DNA1L，

25、然后加入8個單位的Bst2.0DNA聚合酶，補(bǔ)水至25L。混勻離心后，63孵育45min。B.5.4擴(kuò)增產(chǎn)物檢測反應(yīng)前在PCR管內(nèi)蓋上加入1LSYBRGreen熒光染料，反應(yīng)結(jié)束后瞬時離心，將染料與反應(yīng)液混勻后觀察顏色變化，若反應(yīng)管中有青枯菌DNA的大量擴(kuò)增，則反應(yīng)管顏色呈現(xiàn)綠色，反之為橙色。8 DB44/T23462021B.6恒溫水培接種法B.6.1試驗(yàn)設(shè)計(jì)無性系與菌株的雙因素交叉試驗(yàn)。每個無性系與每個菌株的一次試驗(yàn)為一個處理。B.6.2植物材料15cm20cm木麻黃褐梗小枝，每個褐梗小枝含有8個10個分枝。每個處理需要3段4段褐梗小枝（共包含約30個分枝）。B.6.3菌株經(jīng)分離純化、鑒定后的青枯菌菌株作為