江蘇省職業(yè)暴露人群高致病性禽流感監(jiān)測方案

1、江蘇省職業(yè)暴露人群高致病性禽流感監(jiān)測方案禽流感是禽類中由A型流感病毒株引起的一種急性傳染病。在禽類中，禽流感可引起范圍廣泛的各種癥狀，包括從不宜查覺的疾病到可引起嚴(yán)重流行的快速致命性疾病。禽流感病毒通常不感染人類，但是也出現(xiàn)了特定高致病性毒株在人體中引起嚴(yán)重呼吸道疾病的情況。在多數(shù)病例中，感染者曾與受感染的禽類或被其糞便污染的物體有過密切接觸。因此，有必要針對職業(yè)暴露人群及其環(huán)境開展監(jiān)測，進(jìn)一步監(jiān)測感染來源，確定感染高危因素，監(jiān)測禽流感病毒致病力和傳播能力的改變，為制定科學(xué)的防控策略以及流感大流行預(yù)警提供科學(xué)依據(jù)。一、監(jiān)測目的1、 了解職業(yè)暴露人群高致病性禽流感病毒（H5N1）感染狀況。2、

2、了解高致病性禽流感病毒在環(huán)境中的分布情況。二、監(jiān)測點設(shè)置全省13個省轄市均開展監(jiān)測。各省轄市疾控中心根據(jù)地區(qū)特點，選擇兩類（或以上）下述場所作為監(jiān)測點，記錄監(jiān)測點的基本信息，包括：整體環(huán)境，從業(yè)人員總體情況，禽類養(yǎng)殖、販賣和屠宰等情況（規(guī)模、數(shù)量等），近期禽類免疫情況, 近期禽類發(fā)病情況，日常環(huán)境清潔和防護(hù)措施等，報省疾控中心備案。發(fā)生過動物和/或人禽流感疫情的地區(qū)，優(yōu)先在疫情發(fā)生地或其周邊設(shè)立監(jiān)測點。監(jiān)測場所包括：（1）城鄉(xiāng)活禽市場；（2）家禽規(guī)模養(yǎng)殖場（戶）；（3）家禽散養(yǎng)戶集中的地區(qū)；（4）家禽屠宰加工廠；（5）野生候鳥棲息地。三、監(jiān)測內(nèi)容和方法（一）職業(yè)暴露人群血清流行病學(xué)監(jiān)測1、監(jiān)測

3、對象（1）活禽批發(fā)市場、城鄉(xiāng)農(nóng)貿(mào)市場或菜市場中直接與禽類接觸的人員；（2）家禽規(guī)模養(yǎng)殖場（戶）中直接與禽類接觸的人員；（3）家禽屠宰加工廠中直接與禽類接觸的人員；（4）家禽散養(yǎng)戶的家庭成員；（5）野生候鳥棲息地中與候鳥或其排泄物有接觸的人員；2、監(jiān)測時間和監(jiān)測數(shù)量各省轄市疾控中心每年冬春季（1-4月份）開展職業(yè)暴露人群血清流行病學(xué)監(jiān)測，每年至少采集200 份血清標(biāo)本。3、監(jiān)測內(nèi)容（1）流行病學(xué)調(diào)查收集調(diào)查對象的基本情況、禽類接觸史等內(nèi)容，填寫“職業(yè)暴露人群血清流行病學(xué)監(jiān)測調(diào)查問卷”（附表1），與血清標(biāo)本同時寄送省疾控中心。（2）標(biāo)本采集、運送采集監(jiān)測對象的空腹靜脈血5ml，填寫“職業(yè)暴露人群血

4、清標(biāo)本登記表”（見附表2）。分離血清，無菌條件下分裝為3 份，其中1 份用于抗體檢測，1 份留樣保存，1 份（1ml）送省疾控中心復(fù)核。血清標(biāo)本應(yīng)置20或以下凍存，避免反復(fù)凍融。標(biāo)本采集完成后2周內(nèi)將標(biāo)本及登記表送省疾控中心。標(biāo)本運輸時遵守國家生物安全的有關(guān)規(guī)定。（3）實驗室檢測各網(wǎng)絡(luò)實驗室應(yīng)用單放射免疫擴(kuò)散溶血實驗（SRH）和/或馬血球血凝抑制實驗（HI）進(jìn)行 H5N1 抗體檢測；尚不具備檢測能力和條件的實驗室送省疾控中心檢測（見附件2）。標(biāo)本采集后要求1個月內(nèi)完成檢測工作，填寫“職業(yè)暴露人群血清流行病學(xué)檢測結(jié)果表”（見附表3），檢測結(jié)束后1 周內(nèi)將檢測結(jié)果提交省疾控中心。（二）環(huán)境標(biāo)本高致

5、病性禽流感病原學(xué)監(jiān)測1、監(jiān)測對象職業(yè)暴露人群血清流行病學(xué)監(jiān)測點的水、禽類（含候鳥）糞便及籠具表面等環(huán)境標(biāo)本。2、監(jiān)測時間全年監(jiān)測，每年的1、4、7、10 月各采集標(biāo)本1 次。3、監(jiān)測方法（1）標(biāo)本采集各監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)實驗室至少每個季度采集標(biāo)本1 次，每次采集各類標(biāo)本至少20 份（應(yīng)分布在不同場所），同時填寫“環(huán)境標(biāo)本采樣登記表”（附表4）。標(biāo)本采集種類及方法（見附件1）。（2）標(biāo)本運輸、處理標(biāo)本采集后應(yīng)在4條件下48 小時內(nèi)運送至流感監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)實驗室。實驗室收到標(biāo)本后應(yīng)立即進(jìn)行標(biāo)本處理（見附件1），并將標(biāo)本分為3 份，1 份用于核酸檢測，1 份留樣保存，1 份備送省疾控中心復(fù)核。留樣標(biāo)本要求在70或以

6、下凍存。標(biāo)本運輸時遵守國家生物安全的有關(guān)規(guī)定。（3）實驗室檢測各網(wǎng)絡(luò)實驗室收到標(biāo)本后1 周內(nèi)對標(biāo)本進(jìn)行流感病毒A 和B 型核酸檢測，A 型流感病毒核酸陽性標(biāo)本進(jìn)一步進(jìn)行H5N1亞型檢測，填寫“環(huán)境標(biāo)本病原學(xué)檢測結(jié)果表”（附表5）。網(wǎng)絡(luò)實驗室每季度向省疾控中心提交“環(huán)境標(biāo)本采樣登記表”（附表4）和“環(huán)境標(biāo)本病原學(xué)檢測結(jié)果表”（附表5）。四、職責(zé)分工及組織實施（一）省疾病預(yù)防控制中心1、制定監(jiān)測方案、實施監(jiān)測工作，開展相關(guān)培訓(xùn)。2、定期對監(jiān)測數(shù)據(jù)和結(jié)果進(jìn)行分析，定期進(jìn)行督導(dǎo)、考核及評估。（二）各監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)實驗室所在疾病預(yù)防控制中心1、負(fù)責(zé)轄區(qū)監(jiān)測工作的實施，包括監(jiān)測點的選擇、監(jiān)測人員的技術(shù)培訓(xùn)和指導(dǎo)

7、，數(shù)據(jù)收集整理及上報。2、對采集標(biāo)本進(jìn)行實驗室檢測，并及時向省疾控中心提交檢測結(jié)果，按監(jiān)測方案的要求及時上送各類標(biāo)本。3、每年向省疾病預(yù)防控制中心提交年度監(jiān)測工作總結(jié)。五、考核和評估省疾病預(yù)防控制中心組織對職業(yè)暴露人群高致病性禽流感監(jiān)測工作進(jìn)行年度考核、評估?？己藘?nèi)容包括：（1）疾病預(yù)防控制中心：實施方案的制定，監(jiān)測工作的實施與管理等。（2）網(wǎng)絡(luò)實驗室：標(biāo)本的收集、檢測以及運送等。六、附表和附件附表1、職業(yè)暴露人群血清流行病學(xué)監(jiān)測調(diào)查問卷附表2、職業(yè)暴露人群血清標(biāo)本登記表附表3、職業(yè)暴露人群血清學(xué)檢測結(jié)果表附表4、環(huán)境標(biāo)本采樣登記表附表5、環(huán)境標(biāo)本病原學(xué)檢測結(jié)果表附件1、標(biāo)本的采集、處理、保存

8、與運輸附件2、實驗室操作方法簡介江蘇省疾控中心二一一年三月二十三日附表1、職業(yè)暴露人群血清流行病學(xué)監(jiān)測調(diào)查問卷省市縣編碼 血清標(biāo)本編號 一、一般情況1、姓名： （電話： ） 2、性別： 男性 女性3、年齡： 周歲4、現(xiàn)住址： 5、職業(yè)： 幼托兒童 散居兒童 學(xué)生（大中小學(xué)） 教師 保育員及保姆 餐飲食品業(yè) 商業(yè)服務(wù) 醫(yī)務(wù)人員 工人民工農(nóng)民牧民漁（船）民干部職員離退人員家務(wù)及待業(yè)其他 不詳二、暴露情況（可多選）6、職業(yè)暴露人群種類：散養(yǎng)戶 規(guī)模化養(yǎng)殖場從業(yè)人員 活禽批發(fā)市場人員 農(nóng)貿(mào)市場或菜市場活禽交易人員 家禽屠宰加工廠人員 野生候鳥棲息地接觸鳥類人員 其他 7、暴露方式：喂養(yǎng) 清掃禽舍 加工

9、（宰殺、拔毛、洗切、腌制、烹飪）食用 捕殺 運輸 捕捉 銷售 其他 8、如為養(yǎng)殖人員，禽類養(yǎng)殖方式：雞 羽 1）散養(yǎng) 2）圈養(yǎng)鴨 羽 1）散養(yǎng) 2）圈養(yǎng)鵝 羽 1）散養(yǎng) 2）圈養(yǎng)鴿子 羽 1）散養(yǎng) 2）圈養(yǎng)其他 羽 1）散養(yǎng) 2）圈養(yǎng)9、近一個月來，接觸禽種類：雞 鴨 鵝 鴿子 野禽 其他 10、所接觸的禽類是否接種過禽流感疫苗？ 是 否 不詳11、近一個月以來，是否接觸過病死禽？ 是 否 不詳（如是，繼續(xù)回答，如否或不詳，跳至12題）（1）病死禽種類： 雞 羽 鴨 羽 鵝 羽鴿子 羽 其他 羽（2）接觸方式為： （可多選）喂養(yǎng) 清掃禽舍 加工（宰殺、拔毛、洗切、腌制、烹飪）食用 捕殺 運輸

10、捕捉 其他 （3）接觸病死禽時是否有防護(hù)措施？ 是 否 不詳（否或不詳跳至12題）如果有，采取的措施有： （可多選）戴口罩（N95 口罩、過濾口罩、棉紗口罩、一次性外科口罩） 戴面罩穿防護(hù)服（規(guī)范、不規(guī)范）防護(hù)眼鏡 手套 帽子白大衣 其它 （4）接觸病死禽的持續(xù)時間： 天（ 月 日到 月 日）累計暴露： 小時12、近1 個月是否出現(xiàn)過發(fā)熱？ 是 否 不詳（否或不詳跳至13題）（1）發(fā)熱起始時間 月 日，共持續(xù) 天，最高體溫 （2）發(fā)熱時是否伴有其它不適癥狀？ 是 否 不詳（否或不詳跳至13題）出現(xiàn)癥狀起始時間 月 日，共持續(xù) 天，主要癥狀有：頭痛 咽痛 鼻塞 肌肉酸痛 腹痛 腹瀉 其它 13、

11、近1 年是否接種過流感疫苗？ 是 否 不詳調(diào)查人員單位： 調(diào)查人員： 調(diào)查日期： 審核人員： 審核日期： 附表2、職業(yè)暴露人群血清標(biāo)本登記表采集地點 ： 縣（市、區(qū)） 鄉(xiāng)（鎮(zhèn)） 標(biāo)本編號姓名年齡性別現(xiàn)住址采樣日期標(biāo)本量備注注：1.采集地點：填寫標(biāo)本采集地的禽類場所名稱2.標(biāo)本編號原則：（1）血清標(biāo)本代號 ：B （2）各市字母縮寫（3）采集年份，如11年（4）實驗室標(biāo)本編號，從001開始 例：南京市疾控中心標(biāo)本 BA11001，常州市疾控中心標(biāo)本BC11001，宿遷市疾控中心BN11001采集人： 采集單位 ： 送檢日期： 附表3、職業(yè)暴露人群血清流行病學(xué)檢測結(jié)果表檢測單位 ： 1.檢測方法：馬

12、血球HI SRH 2.使用抗原： 參考血清名稱： 3 實驗結(jié)果標(biāo)本編號檢測結(jié)果標(biāo)本狀態(tài)備注HI 滴度SRH 直徑注：標(biāo)本狀態(tài)：溶血，乳糜血，黃疸，血清少檢測者： 檢測日期： 復(fù)核者： 附表4、環(huán)境標(biāo)本采樣登記表采集地點： 縣（市、區(qū)） 鄉(xiāng)（鎮(zhèn)） 標(biāo)本編號采集日期采集地點標(biāo)本種類備注注：1. 標(biāo)本編號原則：（1）血清標(biāo)本代號 ：B （2）各市字母縮寫（3）采集年份，如11年（4）實驗室標(biāo)本編號，從001開始 例：南京市疾控中心標(biāo)本 BA11001，常州市疾控中心標(biāo)本BC11001，宿遷市疾控中心BN11001采集人： 采樣單位 ： 送檢日期： 附表5、環(huán)境標(biāo)本病原學(xué)檢測結(jié)果表檢測單位 ： 采用的

13、檢測方法：One-step PCR： Real time PCR： 1. One-step 試劑盒2. Real-time 試劑盒：3. 引物來源：4檢測結(jié)果標(biāo)本編號采樣日期檢測結(jié)果備注ABH5N1其他陰性操作者： 檢測日期： 復(fù)核者： 附件1、標(biāo)本的采集、處理、保存與運輸一、標(biāo)本采集與處理1. 血清標(biāo)本取真空負(fù)壓采血管，做好標(biāo)記，采集監(jiān)測對象空腹靜脈血5mL。然后置于室溫數(shù)小時待血完全凝固。1500rpm2000rpm 離心10min，收集血清分裝于3 支帶外螺旋蓋的凍存管中，做好標(biāo)記。2. 環(huán)境標(biāo)本環(huán)境標(biāo)本采樣液可使用Hanks 或Eagles 等培養(yǎng)液加入以下抗菌素和0.5%BSA：氨芐

14、青霉素 (2 x 106 IU/L)、 鏈霉素 (200 mg/L) 、多粘菌素 B (2 x 106IU/L) 、 慶大霉素 (250 mg/L) 、 制霉菌素 (0.5 x 106 IU/L) 、 鹽酸氧氟沙星 (60 mg/L)、磺胺甲基異惡唑 (0.2 g/L)（1）水標(biāo)本在禽類活動或籠具旁的水溝或水池的不同部位共收集水標(biāo)本15-20ml 置于50ml 外螺旋蓋的管內(nèi)。水樣標(biāo)本到實驗室后應(yīng)在采樣管中加入上述抗生素和0.5%BSA，再進(jìn)行分裝。呼吸道和環(huán)境標(biāo)本要在無菌條件下反復(fù)吹打收集的溶液，以便打碎粘液和固體，置4待其自然沉淀510min，取上液分裝。分裝好留1份進(jìn)行核酸檢測。（2）籠

15、具表面標(biāo)本用沾有采樣液的帶有聚丙烯纖維頭的拭子擦拭籠具表面3-5 個不同部位，然后將擦拭過的拭子放入含5ml 采樣液的采樣管中，尾部棄去。二、標(biāo)本保存和運輸1血清標(biāo)本保存可置4存放3 天，存放超過3 天需置-20或以下保存。2. 標(biāo)本運輸標(biāo)本放入專用運輸箱內(nèi)（或疫苗冷藏包），放入冰排，然后以柔軟物質(zhì)填充，內(nèi)襯具吸水和緩沖能力的材料。同時寄送標(biāo)本登記表。異地運輸可以采用郵寄或快遞的方法，運輸要求符合國家生物安全有關(guān)規(guī)定。病原學(xué)標(biāo)本按B 類感染性物質(zhì)進(jìn)行運輸，航空采用UN3373 包裝。（三）標(biāo)本報告和聯(lián)系方式聯(lián)系地址：南京市鼓樓區(qū)江蘇路172號聯(lián)系電話： 02583759529, 025-837

16、59404傳真： 02583759409結(jié)果提交郵箱：huox附件2、實驗室操作方法簡介一、馬紅細(xì)胞血凝抑制試驗檢測禽流感抗體（一）生物安全要求禽流感H5N1 亞型檢測抗原的滅活需要在BSL-3 級實驗室進(jìn)行。其余操作均在BSL-2 級實驗室進(jìn)行。（二）材料1抗原：滅活的H5N1 流感病毒。2血清：（1）陽性對照血清；陰性對照血清（2）待檢血清3其他主要試劑：（1）馬紅細(xì)胞（1:1 的比例保存于阿氏液中，建議采血后72 小時內(nèi)使用）（2）磷酸鹽緩沖液（PH 7.2 PBS）：0.01M；（3）牛血清白蛋白（BSA）；（4）霍亂濾液（RDE）4其他：（1）“V” 型96 孔微量板（2）37及56

17、水浴鍋（3）臺式離心機（4）多道可調(diào)加樣器（5）離心管（三）質(zhì)量控制1、對照血清每塊96 孔板上均需要設(shè)立陽性對照和陰性對照，同批次的陽性對照結(jié)果滴度應(yīng)保持2 倍以內(nèi)。2、紅細(xì)胞對照實驗可根據(jù)紅細(xì)胞對照來判斷反應(yīng)時間，盡可能在每塊96 孔板上設(shè)計一孔紅細(xì)胞對照（PBS+1%紅細(xì)胞懸液）。3、病毒回滴一個紅細(xì)胞凝集單位指能引起等量標(biāo)準(zhǔn)化的紅細(xì)胞凝集時病毒的量。進(jìn)行紅細(xì)胞凝集抑制試驗時一般用4 個紅細(xì)胞凝集單位（指25L 體積中含有4 個紅細(xì)胞凝集單位）的病毒量。（四）實驗步驟1血清處理（1）用單道加樣器吸出1 體積血清置于無菌Eppendorf 管內(nèi)，換滴頭加入4體積RDE，吹打混勻。（2）置3

18、7水浴1618h。（3）從37水浴取出后置56水浴30min 滅活。（4）馬紅細(xì)胞吸附：瞬時離心，待冷卻后加入清洗后的濃紅細(xì)胞達(dá)20%（每100LRDE 處理過的血清加入20L 清洗后的濃紅細(xì)胞）?；靹蚝笫覝匚? h。（5）2000rpm 離心5min。（6）小心吸取上清液至干凈離心管中備用。如不需立即檢測可放4保存。2馬紅細(xì)胞的采集及1%馬紅細(xì)胞懸液的配備（1）在注射器里放入一定體積的阿氏液，從頸靜脈處采集馬血后放入容器中，輕柔混勻，如阿氏液不足則需補足（阿氏液和紅細(xì)胞的比例為1:1）。（2）采集的馬紅細(xì)胞應(yīng)放入冰箱4保存，越新鮮越好，建議在采集后72小時內(nèi)使用。（3）在配置1%馬紅細(xì)胞懸

19、液前需清洗紅細(xì)胞液。首先加入5mL 紅細(xì)胞（沉積在容器底部的紅細(xì)胞）至50mL 離心管。加入45mL PBS-0.5% BSA 使總體積達(dá)到50mL，輕柔混勻。（4）2000rpm(600g) 離心5 min。（5）吸掉上清液后，連續(xù)重復(fù)步驟（3）-（4）兩次。（6）為了精準(zhǔn)馬血球的濃度，取濃縮后的馬血球1ml 于1.5ml 離心管中，3600g（8000rpm）離心10min，吸取壓縮后血球的上清并統(tǒng)計出吸取上清的體積，計算實際的血球百分比（一般達(dá)到未壓縮前體積的60-75%）。將完全壓縮后的馬血球棄去。（7）計算最終的血球量使?jié)舛冗_(dá)到完全壓縮后的1%，取所需洗好馬血球的體積加入PBS-0.

20、5% BSA 中，每次用前輕輕混勻后使用。3. 制備用于紅細(xì)胞凝集抑制試驗的4 個紅細(xì)胞凝集單位的抗原（1）將微量板橫向放置：垂直方向稱列，如孔A1H1 稱為第一列；平行方向稱行，如A1A12 稱為A 行。標(biāo)記好標(biāo)準(zhǔn)診斷抗原及加樣順序。1）吸取50L PBS 加入微量板的第二列至最后一列，于第一列加入100L標(biāo)準(zhǔn)診斷病毒。2）從第一列取50L 病毒液，依次從第二列至第八列做2 倍系列稀釋。最后一列每孔棄去50L 稀釋后的病毒液。3）每孔加入50L 1%的紅細(xì)胞懸液，輕彈微量板，使紅細(xì)胞與病毒充分混合。4）室溫孵育4560min，觀察紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象并記錄結(jié)果。5）結(jié)果判定：紅細(xì)胞凝集滴度的判定以

21、出現(xiàn)完全凝集的最高稀釋度為終點，其稀釋度的倒數(shù)即為病毒的紅細(xì)胞凝集滴度。紅細(xì)胞完全凝集以“+”記錄；無凝集或部分凝集“-”記錄。（2）制備4 個紅細(xì)胞凝集抗原時：首先計算出紅細(xì)胞凝集抑制試驗所需的病毒抗原的總量。如每份血清作8 孔稀釋，每孔用抗原25L 抗原，那么測定一份血清需0.2mL 抗原。根據(jù)參比血清的份數(shù)計算出實驗所需病毒抗原量，然后配制抗原。（3）計算出病毒稀釋度。用病毒紅細(xì)胞凝集滴度（HA 滴度）除以8，得到的商即為4 個紅細(xì)胞凝集單位的稀釋度。如，某病毒的HA 滴度為64，除以8 等于8。按1:8（1mL 病毒液加7mL PBS）稀釋該病毒即可得到4 個凝集單位/25L的抗原病毒

22、量。（4）為了保證紅細(xì)胞凝集抑制試驗中抗原用量一致并且準(zhǔn)確無誤，新配制的4 個凝集單位抗原須復(fù)核滴定：取50L 稀釋好的抗原，用等量PBS 做倍比稀釋（同病毒滴定）后加入50L 紅細(xì)胞懸液，至室溫孵育4560min 后觀察凝集結(jié)果。如只有前4 孔出現(xiàn)凝集，表明每50L 病毒含有8 個凝集單位（即25L中含有4 個紅細(xì)胞凝集），該病毒稀釋準(zhǔn)確，可以用于紅細(xì)胞凝集抑制試驗。如第5 孔也出現(xiàn)凝集，說明每50L 病毒含有16 個凝集單位，該抗原必須等量稀釋。如只有前3 孔凝集，表明每50L 病毒僅含有4 個凝集單位，病毒量需要加倍。此外，4 個凝集單位抗原必須每次用前新配制。4紅細(xì)胞凝集抑制試驗（HI

23、）檢測血清抗體將微量板橫向放置：垂直方向稱列，如孔A1H1 稱為第一列；平行方向稱行，如A1A12 稱為A 行。標(biāo)記好待檢病毒的實驗室編號及加樣順序。（1）每孔加入25L PBS。（2）A1 加入25L 標(biāo)準(zhǔn)診斷血清作為陽性對照；A2 加入25L H5N1 陰性血清作為陰性對照。（3）自A3 孔開始分別加入25L 待檢血清；（4）用多道加樣器吸取25L 血清（A1-A12），由A 行至H 行做2 倍系列稀釋血清，至H 行后棄去25L。系列稀釋時需注意每一次稀釋都應(yīng)混合均勻。（5）加入25L 含4 個凝集單位的抗原。（6）混勻后室溫孵育30min。（7）每孔加入50L 1%馬紅細(xì)胞懸液，輕彈微量

24、板，使紅細(xì)胞與病毒充分混合。（8）室溫孵育45-60min，觀察紅細(xì)胞凝集抑制試驗結(jié)果。（9）結(jié)果判定當(dāng)特定的抗體與相應(yīng)的紅細(xì)胞凝集抗原結(jié)合后，可以抑制病毒引起的紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象。紅細(xì)胞凝集抑制效價是指抑制紅細(xì)胞凝集出現(xiàn)時血清的最高稀釋度的倒數(shù)。如1:80 稀釋的血清孔不出現(xiàn)凝劑（紅細(xì)胞凝集完全抑制），1:160 稀釋的血清孔出現(xiàn)凝集（無紅細(xì)胞凝集抑制），該血清對測定病毒的紅細(xì)胞凝集抑制效價為80。人血清對H5N1 抗原的抑制效價1:160 可判定為陽性（參考WHO 推薦標(biāo)準(zhǔn)），但還需要用另一種血清學(xué)方法驗證。二、流感/禽流感單放射免疫擴(kuò)散溶血技術(shù)抗體檢測（一）生物安全要求抗原的制備和血清滅活根

25、據(jù)所從事病毒的種類在相應(yīng)的生物安全級別實驗室進(jìn)行，SRH 檢測在生物安全二級（BSL-2）實驗室進(jìn)行操作。（二）材料1Alsevers 液2pH 7.2 PBS 緩沖液310%疊氮鈉（sodium azide， NaN3）溶液4510-4mol/L KIO4（過碘酸鉀）溶液11.5 mg KIO4 加入pH7.2 PBS 溶液至100mL，完全溶解后置4保存。51%瓊脂糖61%雞紅細(xì)胞懸液7濃雞紅細(xì)胞（洗滌后去掉上清的雞紅細(xì)胞）8補體的制備至少6 只健康成年豚鼠，采血前一天下午禁食，第二天上午從心臟采血，每只可采510mL，每只采完后速至冰上，多只豚鼠血清混勻后使用，當(dāng)天分離血清，分裝，置-7

26、0冰箱中保存。由于補體耐熱性差，因此，操作時盡量在4條件下進(jìn)行。9抗原一般采用接種雞胚尿囊腔后收獲的流感/禽流感病毒液，甲醛滅活的病毒需在-70中保存，并且注意避免反復(fù)凍融。10參比血清抗H5N1病毒兔血清及普通流感病毒參比兔血清。11測定血清血清檢測前56 30min滅活去除血清中不耐熱的非特異性抑制素和補體；血清從56水浴箱中取出，置室溫冷卻，每管加終濃度為20%的濃雞紅細(xì)胞，混勻，置室溫1h 或4過夜，1500rpm 離心10min，棄沉淀物，留上清。紅細(xì)胞吸附的目的是去除人血清中可能含有對雞紅細(xì)胞的嗜異性抗體（Forssmans antibody）。12免疫擴(kuò)散板13打孔器，孔徑為2m

27、m 和3mm 的打孔器。14小燒杯，帶蓋的可裝擴(kuò)散板的塑料盒。15測量放大鏡（帶有每個刻度0.1mm 的刻度尺）或一般透明并帶刻度的尺子。根據(jù)測量的溶血圈直徑，可按下列公式計算出溶血圈面積（S）：S1=R12 S2=R22 S=S1-S2如用3mm孔徑，測量的溶血圈直徑為8mm，代入上述公式就可算出溶血圈面積：S1=R12 = 42=3.141616=50.27（mm2）S2=R22=1.52=3.14162.25= 7.07（mm2）S=S1-S2=50.27-7.07=43.20 （mm2）（三）實驗步驟1、病毒抗原紅細(xì)胞凝集滴度的測定及1000 個紅細(xì)胞凝集單位計算（1）病毒抗原紅細(xì)胞凝

28、集滴度的測定采用雞血球，按常規(guī)流感病毒96 孔微孔板進(jìn)行病毒滴度測定。（2）1000 個紅細(xì)胞凝集單位計算根據(jù)紅細(xì)胞凝集滴度算出1000 個紅細(xì)胞凝集單位所需測定病毒的量。如病毒滴定時紅細(xì)胞凝集滴度為64，則按下列公式計算：0.05:64=x:1000, x =（0.051000）/64=50/64=0.78（mL）也就是說，每0.1mL濃的雞紅細(xì)胞中需要加入0.78mL測定的病毒溶液。按這個比例算出實驗所需的病毒量。2溶解1%瓊脂糖并恒溫于60水浴箱中。使用PH7.2 的PBS 同時加入1NaN3 以防止細(xì)菌生長。煮沸或者用微波爐使1%瓊脂糖完全溶解，速置60水浴箱中，分裝于小燒杯中，2.9

29、mL/杯，置60水浴箱中。根據(jù)工作量計算出所需燒杯的數(shù)量。3紅細(xì)胞處理按每塊擴(kuò)散板需50l 濃的雞紅細(xì)胞，計算出工作中所需的濃紅細(xì)胞容量，將所需的濃雞紅細(xì)胞放入帶尖底的15mL離心管中，加入等容量的510-4 mol/L KIO4，混勻，置室溫15min。 KIO4處理的目的是使病毒吸附到紅細(xì)胞表面后不會游離下來。4加病毒抗原按每0.1mL 濃雞紅細(xì)胞需1000個紅細(xì)胞凝集單位病毒抗原的比例，加入KIO4處理過的紅細(xì)胞，混之，置室溫10min，1500rpm離心3min，棄上清，用至少5倍量于沉淀物的pH7.2 PBS沖洗，1500rpm離心10min，棄上清，加入與紅細(xì)胞等量的pH7.2 的

30、PBS。5把所需的擴(kuò)散板平排好，并標(biāo)明標(biāo)記。6溶血板制備用吸管將步驟中紅細(xì)胞輕輕吹勻，而后吸出100L放入恒溫在60水浴箱中含2.9mL瓊脂糖的燒杯，置水浴中搖勻，而后迅速倒入擴(kuò)散板中，并迅速用燒杯鋪平之。待第一塊板鋪完后，按同法鋪第二塊板，直至全鋪完。溶血板凝固后應(yīng)為紅細(xì)胞均勻分布的透明凝膠板，若出現(xiàn)芝麻樣顆粒、濃淡不均的血絲等，均應(yīng)重新進(jìn)行鋪板。7打孔待瓊脂糖完全凝固（一般置室溫1520min）后打孔，診斷用打3mm直徑孔，血清流行病學(xué)調(diào)查打2mm直徑孔。打完后用針頭將孔中瓊脂挑出，然后蓋上板蓋。8加樣孔徑3mm的一般10L/孔，孔徑2mm的為45L/孔，每批實驗必須要有陽性和陰性血清對照

31、；配對血清應(yīng)在同一板上進(jìn)行，以便減少板間的誤差。9擴(kuò)散當(dāng)每塊板加完樣本，馬上蓋上板蓋。待全部板加完樣本并蓋上板蓋，平放在帶有濕度的盒子中，置4冰箱擴(kuò)散1618h。10加補體補體從-70冰箱取出，用自來水龍頭沖之，讓其速溶。溶后速置冰上，用冷的pH 7.2 PBS進(jìn)行1:3或1:4稀釋，即1mL補體稀釋成3mL或4mL。將擴(kuò)散板從冰箱取出，平放實驗桌上，每板平鋪稀釋好的補體1mL，平放帶有濕度的盒中，無需板蓋，平放3537 孵箱4h。正常紅細(xì)胞對照板，除病毒用pH7.2 PBS替代外，其余操作步驟完全與實驗板相同。11結(jié)果觀察和判斷4 h以后，從孵箱中取出，倒掉補體，進(jìn)行結(jié)果觀察。（1）陽性對照

32、血清應(yīng)出現(xiàn)清晰，而不是模糊或不透明的溶血圈，并溶血圈面積比預(yù)實驗的不能相差1.5 倍或以上；陰性對照血清不應(yīng)出現(xiàn)任何溶血圈。（2）正常紅細(xì)胞對照板不應(yīng)出現(xiàn)任何溶血圈。（3）恢復(fù)期血清溶血圈面積應(yīng)為急性期的2 倍表示有意義的差異；兩者相差1.5 倍為實驗誤差；兩者相差1.5 倍或以上但不到2 倍，需重復(fù)測定，如仍相差1.5 倍或以上但不到2 倍，可判為有意義差異。如重復(fù)測定相差為1.5倍，表示為實驗誤差。不配對血清測定時，2mm孔徑的，溶血圈直徑需4mm（溶血圈面積9.42mm2）；3mm孔徑的，溶血圈直徑需5mm（溶血圈面積12.57mm2）可認(rèn)為是陽性血清。12注意事項（1）抗原量一定要掌握

33、準(zhǔn)確，量過大一方面使測定敏感性下降，另一方面由于過量的病毒顆粒吸附在紅細(xì)胞表面，紅細(xì)胞不易吹散開，鋪板時易出現(xiàn)芝麻樣顆粒，過少的紅細(xì)胞溶解不清晰或不溶解。（2）血清盡量避免反復(fù)凍融，因反復(fù)凍融會產(chǎn)生抗補體影響溶血圈的清晰度。（3）雙份配對的血清應(yīng)在同一塊板上進(jìn)行測定，以便避免板間的誤差。（4）陽性對照血清，有時由于滴度過高，出現(xiàn)很大的溶血圈，把鄰近的孔覆蓋，因此，最好靠近它的孔不加樣本或?qū)㈥栃匝暹M(jìn)行適當(dāng)稀釋，如1:5 稀釋，而后使用之。（5）對患者進(jìn)行血清學(xué)診斷時，建議用3mm 孔徑的孔，因用2mm 孔徑有時會出現(xiàn)重疊溶血圈影響結(jié)果準(zhǔn)確的判斷。進(jìn)行血清流行病學(xué)調(diào)查時建議用2mm 孔徑。（6）

34、測量溶血圈直徑時，應(yīng)測量最清晰的，因標(biāo)準(zhǔn)的溶血圈常為靠近孔邊緣出現(xiàn)清晰透亮的溶血圈，它的外圍出現(xiàn)不十分清晰的溶血圈，此溶血圈外圍又有個清晰的溶血圈，這是要測量的直徑。測量時，尺子要挨在擴(kuò)散板上。（7）正常紅細(xì)胞對照板所出現(xiàn)的溶血圈面積與實驗板幾乎一樣大小，表明嗜異性抗體未完全去除干凈，應(yīng)再用雞紅細(xì)胞進(jìn)行再吸附來去除之；如對照板所出現(xiàn)的溶血圈面積比實驗板小2 倍或以上，一般不影響對實驗結(jié)果的判斷。（8）瓊脂糖最好用高純度，低熔點，在有效期內(nèi)，新鮮配制的，配好后保存期不超過一個月，因保存期過長，鋪板時易造成瓊脂板出現(xiàn)裂縫。（9）一定要加1NaN3 以防止細(xì)菌生長，因細(xì)菌會造成非特異性溶血。（10）

35、溫度一定要控制好，因補體不耐熱，操作補體時間盡量要縮短，并在4下操作；補體一定為6 只豚鼠的混合血清。（11）禽類血清不結(jié)合豚鼠補體，不應(yīng)用雞的抗血清作為陽性對照血清。（12）如缺乏時間對實驗結(jié)果進(jìn)行觀察和測量，可將實驗板置4冰箱，至少一星期進(jìn)行測量不影響實驗結(jié)果；溶血板制備完后，平放帶濕度的盒中，置4冰箱，最長只能存兩星期。三、A 型流感病毒RT-PCR 檢測（一）生物安全要求分裝標(biāo)本、裂解病毒需在BSL-2 級實驗室生物安全柜內(nèi)操作。核酸檢測區(qū)域要分出試劑配制、核酸提取、擴(kuò)增、檢測的不同分區(qū)。（二）主要材料1提RNA Kit：QIAGEN RNeasy Mini Kit （catalog

36、#74104）2巰基乙醇（SIGMA -Mercaptoethanol Lot 062K0115）370乙醇4RT-PCR Kit：QIAGEN One step RT-PCR Kit（catalog #210212）5Promega RNasin Ribonuclease Inhibitor （catalog #N2111）6檢測引物：Forword and Reverse Primers（均為10M），序列如下：類型序列甲型通用FluA-M-F305- TTC TAA CCG AGG TCG AAA CG -3FluA-M-R2645- ACA AAG CGT CTA CGC TGC AG

37、 -3（三）實驗步驟1RNA 提?。?）根據(jù)標(biāo)本數(shù)量分裝RLT 液：從Kit 中取出RLT 液，用1.5mL 離心管分裝，每管500L（在體系配制區(qū)操作）。（2）加標(biāo)本100ul 到裂解液中。（3）每管分別加入5L -巰基乙醇，混勻后依次加入600L 70%的乙醇，充分混勻。（4）從Kit 中取出帶濾柱的2mL 收集管，打開包裝將其做好標(biāo)記。取步驟2中的混合液600L 加入濾柱中，12000rpm，離心15s，棄收集管中的離心液。（5）濾柱仍放回收集管上，將步驟2 剩余的混合液全部吸入濾柱中，12000rpm，離心15s，棄離心液。（6）于濾柱中加入700L Wash Buffer RW1 液

38、，12000rpm，離心15s。（7）從QIAGEN RNeasy Mini Kit 中取一支干凈的2mL 收集管，將離心后的濾柱移到新的收集管上，于濾柱中加入500L Wash Buffer RPE 液，12000rpm，離心15s。（8）棄收集管中的離心液，再于濾柱中加入500L Wash Buffer RPE 液，1300014000rpm，離心2min。（9）將濾柱移到一個干凈的1.5mL eppendorf 管上，向濾柱中加入3050L的Rnase-free Water，室溫靜置13min。（10）12000rpm，離心1min，收集離心液即為提取的病毒RNA，立即做實驗或-20以下

39、保存。注意：Buffer RPE 使用之前加無水乙醇。2反應(yīng)體系配制（1）實驗設(shè)計：檢測標(biāo)本RNA 時，陰性對照用無菌水，陽性對照用已知病毒RNA。（2）PCR 反應(yīng)體系配制（在體系配制區(qū)配反應(yīng)液）2）將上述反應(yīng)液混勻，分裝到0.2mL PCR 小管中，每管20L，分別做好標(biāo)記。3）加RNA 模板（在核酸提取區(qū)）將上述分裝好的PCR 小管分別加入模板。首先加入陰性對照管（5L 無菌水），然后分別加標(biāo)本RNA（每管5L），最后加入陽性對照RNA（每管5L）。（3）RT-PCR將上述加好模板的反應(yīng)管混勻，短暫離心后放入PCR 儀進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序如下：1）60作用1min， 2）42作

40、用10min， 3）50作用30min4）95作用15min， 5）94變性30s， 6）50退火30s，7）72延伸1min，回到第5 步，34 個循環(huán)， 8）72作用10min，9）4 保存（4）RT-PCR 產(chǎn)物檢測：1）將制備好的1.5瓊脂糖凝膠入電泳槽（帶梳子孔的一端在陰極），倒入電泳液（1TBE）浸過膠面即可。2）PCR 產(chǎn)物各取10L，加入2L 上樣緩沖液（6Loading Buffer），混勻后加入電泳膠孔內(nèi)先加Marker（DL2000）5L，然后依次加標(biāo)本PCR 產(chǎn)物，再加陰性對照，最后加陽性對照產(chǎn)物）。3）觀察結(jié)果并用凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄。（四）結(jié)果判斷：在系統(tǒng)成立，即陰陽性參考均正常的條件下，判斷結(jié)果，陽性各條帶為：甲型（210bp）出現(xiàn)特異性條帶，判為陽性結(jié)果。未出現(xiàn)條帶，或不在上述位置出現(xiàn)非特異性條帶，均判為陰性結(jié)果。四、A型流感病毒實時熒光定量PCR檢測實時熒光定量（Real-time）RT-PCR 技術(shù)，是指在RT-PCR 反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個RT-PCR 進(jìn)程，最后