細(xì)胞生物學(xué)：常規(guī)制片技術(shù)

1、l切片法l非切片法1.分離標(biāo)本2.活體標(biāo)本3.涂片標(biāo)本4.磨片標(biāo)本5.整體封藏標(biāo)本6.鋪片標(biāo)本7.組織印片精精 子子動(dòng)物致死和取材動(dòng)物致死和取材致死方法：麻醉、空氣栓塞、股動(dòng)脈放血等。取材取材 順序：先腹腔（肝臟、膽囊、 腎、腎上腺、胰腺、脾、胃、 十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸），然后取胸腔和盆腔內(nèi)的器官組織。取材關(guān)鍵取材關(guān)鍵材料新鮮勿使組織塊受擠壓組織塊力求小而薄選好組織塊的切面盡量保持組織的原有形態(tài)保持材料的清潔 固定：固定：借助化學(xué)藥品使組織和細(xì)胞中的有機(jī)和無(wú)機(jī)成分凝固成沉淀，防止發(fā)生死后組織變化，以保持其生活時(shí)狀態(tài)的過(guò)程。此藥品稱為固定劑固定劑。 目的和意義目的和意義保持組織和細(xì)胞與正常

2、生活時(shí)的形態(tài)相似。 使細(xì)胞內(nèi)的各種成分轉(zhuǎn)變成不溶性物質(zhì)。 增加組織硬度，便于組織切片。 防止細(xì)胞過(guò)度收縮或膨脹而失去其原有的形態(tài)結(jié)構(gòu)。固定的對(duì)象和方法l小塊組織固定法l注射、灌注固定法l蒸汽固定法固定劑的性質(zhì)和條件固定劑的性質(zhì)和條件 迅速滲入組織而固定細(xì)胞質(zhì)。有較強(qiáng)的滲透力。避免死后變化。避免過(guò)度膨脹或收縮。 l注意事項(xiàng)組織必須新鮮組織的厚度防止因固定發(fā)生變形用量 時(shí)間促使固定固定劑固定劑l單純固定劑單純固定劑甲醛甲醛 滲透力強(qiáng)，固定均勻，對(duì)組織收縮少。經(jīng)甲醛固定的組織，細(xì)胞核染色甚佳，胞質(zhì)著色較差。除單獨(dú)使用外，常與其他藥品配成混合液，效果更佳。氧化汞氧化汞 俗稱升汞，劇毒，必須嚴(yán)格 保管和

3、注意使用。穿透力慢，適于固定薄塊組織。能沉淀一切蛋白質(zhì)，升汞可增加對(duì)酸性燃料的親和力，如卡紅等。 醋酸醋酸 又名乙酸、冰醋酸，為無(wú)色透明液體，有刺激性氣味。醋酸的滲透力強(qiáng)。經(jīng)單純醋酸固定的組織，可不經(jīng)水洗，直接入酒精脫水。用作固定劑的醋酸濃度一般在0.3-5%。 苦味酸苦味酸 黃色粉末結(jié)晶。能沉淀蛋白質(zhì)，對(duì)脂肪類脂無(wú)效，滲透力較弱，一般很少單獨(dú)使用。 乙醇乙醇 又名酒精，為無(wú)色液體，可與水在任何比例下相混合。一般用作固定液的濃度為95%或純酒精。其他常用的單純固定劑還有重鉻酸鉀、鉻酸、四氧化鋨、丙酮、三氯乙酸等。l常用混合固定劑常用混合固定劑Bouin氏液氏液 配方：苦味酸飽和水溶液 75 m

4、l；甲醛 25 ml；冰醋酸 5m。此液臨用時(shí)配制。 為一種常用良好的固定液，滲透力強(qiáng)，對(duì)組織固定均勻，收縮較小，染色效果好。一般組織固定12-24小時(shí)。Carnoy氏液氏液 配方：純酒精 60 ml；冰醋酸 10 ml；氯仿（三氯乙酸） 30ml。 此液滲透迅速。適用于一般細(xì)胞學(xué)研究。固定后不經(jīng)水洗，即入95%酒精脫水或直接入純酒精，可縮短制片時(shí)間。 Zenker氏液氏液 配方：升汞 5g；重鉻酸鉀 2.5g；冰醋酸 5 ml；蒸餾水 100 ml。 為組織學(xué)、細(xì)胞學(xué)及病理學(xué)常用的固定劑，多用于固定一般組織。固定時(shí)間24小時(shí)，加熱固定可以加快滲透作用。固定后流水沖洗12小時(shí)，并在以后的脫水過(guò)

5、程中除去汞鹽沉淀。 其他常用的混合固定液有中性甲醛固定液、甲醛-乙醇固定液、Helly固定液固定液等。 l目的目的 組織在固定后一定要把滲入組織里面的固定液洗去，防止組織中留有較多的固定液而影響脫水劑，甚至可在組織中發(fā)生沉淀或結(jié)晶而影響觀察。l常用方法固定劑以水配制的固定劑含乙醇的l目的和原則目的和原則 組織經(jīng)固定和水洗后，含有大量的水分，而水和苯及石蠟根本不相融合，所以組織在透明前必須經(jīng)過(guò)脫水這一環(huán)節(jié)。就是用某些溶劑逐步將組織塊吸收的水分置換出來(lái)，以利于透明劑和石蠟等的滲入，這一過(guò)程就叫做脫水脫水，使用的藥品為脫水劑脫水劑。 l種類非石蠟溶劑的脫水劑石蠟溶劑的脫水劑方法 將脫水劑配成各種濃度

6、，自低到高濃度循序進(jìn)行。l常用脫水劑常用脫水劑酒精酒精 為常用的脫水劑。脫水能力強(qiáng)，并能使組織硬化，能較好地與二甲苯透明劑相融合。其缺點(diǎn)是易使組織收縮，變脆。在一般脫水過(guò)程中，采用循序漸進(jìn)的方法，逐步升級(jí)，經(jīng)一系列的不同濃度的酒精，使組織中的水分逐漸被酒精所替代。丙酮丙酮 脫水作用比乙醇強(qiáng)，但對(duì)組織塊的收縮較大，價(jià)格較高，一般少用。主要用于快速脫水或固定兼脫水。正丁醇正丁醇 脫水能力較弱，但能與水、乙醇及石蠟相混合，故這種脫水的組織塊可直接浸蠟包埋。這種脫水劑兼透明劑的最大優(yōu)點(diǎn)是很少引起組織塊的收縮與變脆。正丁醇在使用時(shí)易揮發(fā)，吸入后能發(fā)生頭痛，使用時(shí)應(yīng)注意安全。 時(shí)間：時(shí)間：脫水時(shí)間應(yīng)根據(jù)組

7、織的體積和厚度而定，組織在純酒精中脫水時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)，過(guò)長(zhǎng)則組織過(guò)度硬化變脆，不易切片。此外，脫水的時(shí)間與固定液的種類也有關(guān)。 如用酒精脫水，一般經(jīng)水洗的小塊組織可從50%開始，依次經(jīng)過(guò)70%、80%、95% I、 95%II、100% I 和100% II，每一級(jí)酒精脫水時(shí)間約為30分鐘。簡(jiǎn)便的酒精稀釋法：簡(jiǎn)便的酒精稀釋法：無(wú)論任何濃度的酒精稀釋時(shí)，需稀釋到多大濃度就取多少毫升酒精，然后用蒸餾水加至該酒精原有濃度即可。例：將95%酒精稀釋為70%濃度時(shí)，則將95%酒精70毫升倒入量筒中，然后加入蒸餾水至總量95毫升即可。簡(jiǎn)便的酒精稀釋法：簡(jiǎn)便的酒精稀釋法： 無(wú)論任何濃度的酒精稀釋時(shí)，需稀釋到多

8、大濃度就取多少毫升酒精，然后用蒸餾水加至該酒精原有濃度即可。例：將95%酒精稀釋為70%濃度時(shí)，則將95%酒精70毫升倒入量筒中，然后加入蒸餾水至總量95毫升即可。l目的目的 一、組織塊透明的目的是便于浸蠟包埋，但組織塊脫水后其內(nèi)部的脫水劑與石蠟不相溶，還必須用石蠟誘導(dǎo)劑過(guò)度，這種物質(zhì)能夠同時(shí)溶解于脫水劑及包埋劑中，它能逐漸滲入組織最終將脫水劑完全排出，誘導(dǎo)劑滲入后，組織塊往往呈透明狀故稱之為“透明”。這種藥劑稱為透明劑。 二、切片透明的目的是有利于光線的透過(guò)，便于顯微鏡的觀察。當(dāng)組織塊中全部為透明劑占有時(shí)，光線可以透過(guò)，組織可呈現(xiàn)不同程度的透明狀態(tài)。l透明劑的種類和使用方法 二甲苯 易揮發(fā)，

9、無(wú)色透明液體，長(zhǎng)期接觸對(duì)呼吸道粘膜有刺激作用。透明能力強(qiáng)，但易使組織收縮、變脆，所以組織塊在二甲苯中不宜久留。時(shí)間 二甲苯I、II各15-30分鐘。l目的 浸蠟是為包埋做準(zhǔn)備，目的是除去組織中的透明劑而代之以石蠟，并滲入組織內(nèi)部（因透明劑和石蠟相溶的性質(zhì)，將透明的組織投入溶化的石蠟中，石蠟即浸入組織），把軟組織變?yōu)檫m當(dāng)硬度的蠟塊，便于切成薄片。l方法 將組織塊經(jīng)過(guò)二甲苯透明后，投入到已溶化的石蠟中。在透蠟時(shí)必須經(jīng)過(guò)數(shù)次純石蠟（石蠟1、2、3），使石蠟中存有的剩余透明劑完全去盡，以免影響切片質(zhì)量。 l時(shí)間時(shí)間 透蠟時(shí)間應(yīng)根據(jù)不同組織類型及其大小而定，基本上與組織固定時(shí)間成正比。 最好先入1/2石

10、蠟（含1/2二甲苯），然后入石蠟I、II，總時(shí)間不超過(guò)1小時(shí)。l浸蠟劑的種類浸蠟劑的種類石蠟石蠟 有高熔點(diǎn)和低熔點(diǎn)之分，一般應(yīng)用熔點(diǎn)為56。C以上的石蠟。低熔點(diǎn)在54 。C以下，用于酶的顯示和保存抗原活性。經(jīng)過(guò)浸蠟的組織被包埋起來(lái)，有利于組織切片的連續(xù)性，展片平整，烤片方便，結(jié)構(gòu)成分保存較好，特別是整個(gè)蠟塊的材料保存可靠。火棉膠火棉膠明膠明膠 l目的 將組織埋入石蠟等凝固成塊。l方法石蠟包埋法 先在紙制的小長(zhǎng)形盒或金屬包埋框內(nèi)倒入融化的蠟，用加溫的鑷子將浸蠟的組織塊置于其內(nèi)。放入時(shí)應(yīng)注意組織的切面朝下并放平整；石蠟的溫度不宜過(guò)高而損傷組織，過(guò)低使組織和石蠟不適宜而影響切片。組織包埋好后，等到石

11、蠟?zāi)?，將包埋框打開，用刀片把組織蠟塊切開，待完全冷卻后再修整蠟塊，要求組織外圍的石蠟保留適中以便連續(xù)切片。 注意事項(xiàng)包埋時(shí)夾取組織的鑷子，應(yīng)隨時(shí)烤熱。包埋操作要敏捷。包埋后的蠟塊應(yīng)呈均質(zhì)半透明狀。包埋恒溫箱中的溫度必須保持恒定。若包埋后發(fā)現(xiàn)滲蠟不夠，或包埋的不好，可將蠟塊熔化，重新滲蠟和包埋。 l切片機(jī) 制作組織切片標(biāo)本必備的緊密儀器，可以制出以微米為單位的薄切片。種類石蠟切片機(jī)火棉膠切片機(jī)冰凍恒溫箱切片機(jī)保養(yǎng) l切片方法石蠟切片法石蠟切片法包埋好的蠟塊，切片前，將蠟塊從包埋紙盒中取出并修整蠟塊，用切蠟刀視組織大小，切去邊緣余蠟的一部分，但應(yīng)在組織的周邊留有石蠟邊0.2cm，蠟塊的四邊留蠟的

12、距離要均等，不能一邊多，一邊少，否則將使連續(xù)切片受到影響，修整好的蠟塊可放在冰箱中備用。準(zhǔn)備好切片用具 磨好的切片刀，毛筆一支，小手術(shù)刀一把，盛蠟片盤，二甲苯或氯仿一小瓶，藥棉等，夏天還要準(zhǔn)備冰塊。將修整好的蠟塊固定在持蠟器（木塊）上。用一小銅片鏟加上石蠟，加熱至70-80C，先倒一部分融化的蠟液于木塊上，并將蠟塊略融化后與之融合，冷卻后，蠟塊可牢固地粘附在持蠟器上。也可不用持蠟器，即將修整好的蠟塊，經(jīng)冷凍后，直接安裝在切片機(jī)的組織塊支持器中進(jìn)行切片，當(dāng)然如果蠟塊太小，還須用持蠟器。 將修整好的持蠟器上的蠟塊，再安裝到切片機(jī)的蠟塊夾持器上固定。將切片刀裝在切片機(jī)的夾刀座上，并把刀座上的螺旋旋緊

13、，以固定切片刀。切片刀與蠟塊應(yīng)保持一定的角度，將刀座下部前后移動(dòng)，以調(diào)整好切片刀與蠟塊的距離。調(diào)整切片機(jī)厚度調(diào)節(jié)器所需的厚度。切片機(jī)上各部件調(diào)節(jié)好后，便開始切片，用右手握住切片機(jī)旋轉(zhuǎn)輪的手柄，搖動(dòng)旋轉(zhuǎn)輪進(jìn)行切片。冰凍切片法冰凍切片法 組織塊不經(jīng)任何包埋劑而直接放在制冷臺(tái)上冷卻后再進(jìn)行切片?；鹈弈z切片法火棉膠切片法 將切片機(jī)切下的蠟片，貼附在載玻片上的過(guò)程。l粘片劑 蛋白甘油l用具 潔凈的載玻片，酒精燈或切片伸展器，撥針等。l方法直接貼片法溫水漂浮貼片法l溫度一般在37-45。C，時(shí)間不少于24小時(shí)，以防切片從載玻片上剝離。l染料 原理：對(duì)纖維或組織有親和力。根據(jù)其酸堿度不同，把染料分為酸性和堿

14、性染料。細(xì)胞核的主要成分是DNA，帶負(fù)電荷的磷酸基，所以細(xì)胞核能接受堿性染料。細(xì)胞質(zhì)的成分主要是蛋白質(zhì)，還有RNA、脂蛋白等，大多是兩性離子化合物，當(dāng)溶液PH低于其等電點(diǎn)時(shí)，胞質(zhì)中蛋白質(zhì)等帶正電荷的與帶負(fù)電荷的酸性染料結(jié)合。 蘇木精伊紅染色（HE染色） 應(yīng)用兩種染料，一種是天然的蘇木精，另一種是煤焦油染料伊紅。蘇木精主要用于對(duì)細(xì)胞核的染色，伊紅主要用于對(duì)細(xì)胞質(zhì)的染色。 l蘇木精配方（Harris蘇木精）A液（蘇木精1克，無(wú)水酒精10ml）B液（鉀明礬20克，蒸餾水200ml） 先將A液攪拌溶解，再將B液煮沸溶化去火，緩緩加A液，然后加氯化汞0.5克，再煮沸冷卻后加入8ml冰醋酸，過(guò)濾后使用，存

15、放時(shí)間越長(zhǎng)，顏色越鮮艷。 伊紅配方1%伊紅：95%酒精100ml中含1克伊紅。 l染色的步驟：1. 脫蠟到水 （1）石蠟切片烤干后，浸入二甲苯I 20分鐘，洗去石蠟。 （2）浸入二甲苯II 1分鐘。 （3） 純酒精I(xiàn) 1分鐘，洗去二甲苯。 （4）純酒精I(xiàn)I 1分鐘。 （5）按順序入95%、80%、70%、50%酒精各1分鐘。 （6）蒸餾水中洗1分鐘，洗去酒精。 2.染色、脫水（1） 蘇木素染細(xì)胞核，5-30分鐘。（2） 自來(lái)水洗去浮色，流水沖洗20分鐘。（3） 1%鹽酸酒精分色。（4） 蒸餾水洗。（5） 入1%伊紅水溶液或酒精溶液復(fù)染1-10分鐘。（6） 按順序經(jīng)95%酒精I(xiàn)、II中脫水各1分鐘。 (7) 純酒精I(xiàn)、II各2分鐘。 1 3. 透明、封固 （1）