堿性磷酸酶基因實驗論文

1、. 本科生基因工程實驗論文堿性磷酸酶基因堿性磷酸酶基因表達載體的構建及在大腸桿菌中的表達大學生命科學學院生物系本科生基因工程實驗論文堿性磷酸酶基因表達載體的構建及在大腸桿菌中的表達帆 01011017 生物科學摘要堿性磷酸酶廣泛分布于人體各臟器器官中這種酶能催化核酸分子脫掉5磷酸基團從而使DNA或RNA片段的5-P末端轉換成5-OH末端。堿性磷酸酶在酶聯(lián)免疫等生化檢測中有重要作用是許多生化反響試劑盒的檢測酶。從大腸桿菌提取的堿性磷酸酶本錢低熱穩(wěn)定性好而且能用基因方法實現(xiàn)蛋白質定向標記等。本文主要介紹利用基因工程實驗技術操作堿性磷酸激酶基因將已經(jīng)連接在pMD19-T載體上的堿性磷酸激酶酶源基因用

2、PCR擴增出837bp的堿性磷酸激酶的基因片段與T載體連接后導入感受態(tài)的DH5菌中篩選鑒定。用雙酶切切下堿性磷酸激酶的成熟基因片段插入帶有6個組氨酸標簽的原核表達載體pET-his導入 BL(21)DE3感受態(tài)菌中誘導表達堿性磷酸激酶蛋白質用SDS鑒定。關鍵詞堿性磷酸酶基因表達載體大腸桿菌 SDSConstruction and E*pression of Alkaline Phosphatase E*pression Vector in E.coli ABSTRACTAlkaline phosphatase is a widely distributed in human organs in

3、 various organs , the enzyme catalyzes the nucleic acid molecule off the 5 phosphate group , so that the DNA or RNA fragments of the 5-P terminal converts 5-OH ends . Alkaline phosphatase in ELISA and other biochemical detection plays an important role in many biochemical reactions kit detection enz

4、ymes. E*tracted from E. coli alkaline phosphatase , low cost, good thermal stability, but also can be used genetic methods to achieve protein orientation markings.Main of this article describe the gene engineering operation in BAP gene which has already connected with pMD-1-T vector amplified by PCR

5、 in which can get 837bp nattokinase gene fragments ,then liBAPing with T vector that transform it into DH5 bacteria which were screened after identification. The mature peptide can be cutted by double-digested and insert with si* histidine-tagged prokaryotic e*pression vector pET-his. At last, induc

6、ed the protein e*pression of nattokinase in the e*pression of E.coli BL (21) DE3. Eventually , identify that by SDS. KEYWORDS: Bacterial alkaline phosphatase , gene e*pression, vectorE. coli, SDS大學生命科學學院生物系本科生基因工程實驗論文目錄引言 . 1 材料與方法 . 1材料 . 1.1試劑、儀器及實驗用具 . 1.2菌種 . 1.3質粒 . 1.4常用溶液的配制 . 2方法 . 2.1引物的設計

7、. 2.2 堿性磷酸激酶基因的PCR擴增 . 2.3 DH5a和BL21感受態(tài)的制備 . 2.4 pMD19-T-BAP的構建及轉化和檢測 . 2.5 pET-his及BAP的酶切和回收 . 2.6 pET-his-BAP的構建及轉化和檢測 . 2.7 pET-his-BAP的誘導表達 . 2.8 細菌堿性磷酸酶表達的SDS檢測 . 3結果與分析 . 3.1 堿性磷酸激酶基因的PCR擴增 . 3.2 pET-his的提取酶切及膠回收檢驗 . 3.3 pMD19-T-BAP的構建轉化檢測 . 3.4 pMD19-T-BAP的酶切 . 3.5 pMD19-T-BAP膠回收的結果 . 3.6 pET

8、-his-BAP的構建及轉化和檢測 . 3.7 SDS檢測pET-his-BAP的表達 . 4討論 . 參考文獻 . 致 . 感想 . 大學生命科學學院生物系本科生基因工程實驗論文引言: 堿性磷酸酶廣泛分布于人體各臟器器官中其中以肝臟為最多其次為腎臟骨骼、腸、和胎盤等組織。這種酶能催化核酸分子脫掉5磷酸基團從而使DNA或RNA片段的5-P末端轉換成5-OH末端。但它不是單一的酶而是一組同功酶。目前已發(fā)現(xiàn)有 AKP1 、AKP2 、AKP3 、AKP4 、AKP5 與 AKP6 六種同功酶。細菌堿性磷酸酶是分子生物學的重要工具酶。在堿性條件下可以催化磷酸單脂水解生成無機磷酸。在ELISA過程中B

9、AP常用作標記二抗的酶顯色。近年來國外一些學者直接將BAP與抗體蛋白融合表達防止了酶標二抗的使用和穿插反響不僅在疾病診斷中有顯著優(yōu)勢還可以檢測與之融合的各種單鏈抗體的活性。堿性磷酸酶在酶聯(lián)免疫等生化檢測中有重要作用是許多生化反響試劑盒的檢測酶。目前國市場引用的堿性磷酸酶都是從國外進口并且是有牛、豬肝臟提取價格昂貴且產(chǎn)量不高。從大腸桿菌提取的堿性磷酸酶本錢低熱穩(wěn)定性好而且能用基因方法實現(xiàn)蛋白質定向標記等。材料與方法 1.材料 1.1試劑、儀器及實驗用具儀器臺式離心機旋渦混合器微量移液取樣器氣浴振蕩搖床制冰機超凈工作臺微波爐和電磁爐電泳儀和電泳槽電子分析天平恒溫水浴鍋紫外分光光度計PCR儀三用紫外

10、分析儀恒溫細菌培養(yǎng)箱凝膠成像儀高壓蒸汽滅菌鍋。實驗用具超凈工作臺玻璃涂布棒酒精燈雙面微量離心管架試管架記號筆,手表搖菌試管1.5mL離心管0.5mL微量離心管槍頭010uL20200uL2001000uL100mL三角瓶250mL 三角瓶凝膠成像系統(tǒng)一次性薄膜手套等,0.2mLPCR微量管泡沫塑料保溫盒培養(yǎng)皿瓊脂糖凝膠電泳槽和梳子及其制膠模塊, 垂直電泳槽及配套的玻璃板、夾子、密封條、梳子。試劑LB 培養(yǎng)基氨芐青霉素儲存液無菌ddwater 200mg/mLM/VIPTG 20%葡萄糖1.0mol/L Tris HClpH8.8 0.5mol/L Tris HCl pH6.810%SDS大學生

11、命科學學院生物系本科生基因工程實驗論文 30% Acr/Bis 10% Aps2上樣緩沖液TEMED 低分子量蛋白分子量 Marker考馬斯亮藍染色液 5 *電泳緩沖液20%M/VIPTG2%M/V*-gal50 * TAE電泳緩沖液溴化乙錠儲存液10加樣緩沖液6加樣緩沖液DNA分子量Marker電泳級瓊脂糖粉Premi* Taq 10mg/mL RNase ATE緩沖液95%和 70%乙醇EcoR I 和 BamH I 限制性切酶10切酶緩沖液0.1 mol/L CaCl2溶液T4 DNA連接酶連接酶緩沖液。1.2菌種帶有 pET-his 質粒載體DH5菌,帶有pMD19-T-BAP載體的D

12、H5菌 E.coli DH5E.coli BL21由基因工程實驗室提供。1.3 質粒表達載體pET-his 1.4 常用溶液的配制 1.4.1 氨芐青霉素儲存液無菌水配制 100mg/mL分裝后-20C保存。 1.4.2 LB 培養(yǎng)基胰化蛋白胨 10g酵母提取物 5gNaCl 10g加 200mL ddwater 攪拌完全溶解用約NaOH 調 pH 至 7.0加 dd water 至 1L分裝4個200ml和2個100ml,121 20min 滅菌。使用時可參加氨芐青霉素終濃度100ug/mL。1.4.3 溶液NaOH/SDS溶液0.2mol/L NaOH1%SDS,現(xiàn)用現(xiàn)配。1.4.4 50

13、TAE電泳緩沖液pH約8.5Tris堿242g,57.1ml冰乙酸37.2g Na2EDTA2H2Odd water 定容至1L。使用時稀釋成1。1.4.5 瓊脂糖凝膠稱取0.25g瓊脂糖粉放入三角瓶參加25ml 1TAE 電泳緩沖液注意原液是50按照1:49的比例稀釋用保鮮膜蓋住放入微波爐里大學生命科學學院生物系本科生基因工程實驗論文燒開30 s取出觀察假設無顆粒則置于桌面上冷卻至不燙手即可灌膠假設仍然有顆粒狀物需要再繼續(xù)加熱直至無顆粒后冷卻灌膠。1.4.6 1.0mol/L Tris HCl pH8.8稱取12.1g Tris堿, 加50mL蒸餾水緩慢地加濃鹽酸至pH8.8約加 8mL。讓

14、溶液冷卻至室溫pH將會升高然后再調至pH8.8加蒸餾水至 100mL。高溫高壓滅菌后 4保存。1.4.7 0.5mol/L Tris HCl pH6.8稱取 6.05g Tris 堿溶于 40mL 蒸餾水中加約48mL 1mol/L HCl讓溶液冷卻至室溫再用 HCl 調至 pH6.8加水稀釋到100mL 終體積。高溫高壓滅菌后 4保存。1.4.8 30% Acr丙烯酰胺/BisN,N-亞甲基雙丙烯酰胺30g Acr+0.8g Bis用 dd water定容至100mL4C棕色瓶避光保存現(xiàn)用現(xiàn)配。1.4.9 10% Aps過硫酸銨蒸餾水配制-20保存。過硫酸銨會緩慢分解一周使用完。1.4.10

15、 上樣緩沖液0.5mol/L Tris HCl pH6.8 2mL甘油 2mL20% SDS 2mL0.1%溴酚藍0.5mL-2-巰基乙醇1.0mLdd water 2.5mL室溫存放。1.4.11 電泳緩沖液Tris 7.5g 甘氨酸36gSDS2.5g加ddwater 至500mL。使用時稀釋5倍。1.4.12 考馬斯亮藍染色液考馬斯亮藍 R250 0.25g + 45mL 甲醇+10mL 冰醋酸用ddwater 定容至100mL 。1.4.13 LB 平板培養(yǎng)基LB 培養(yǎng)基中含 1.2 %1.2g/100ml瓊脂高壓滅菌后參加氨芐青霉素至100g/mL每個培養(yǎng)皿中約 20mL 倒制平板。

16、 2. 方法2.1 設計引物PCR引物2.2 BAP基因的PCR擴增2.2.1 由教師提供pMD-19-T-BAP質粒進展PCR擴增。2.2.2 在 0.2mL PCR微量離心管中按以下劑量配制 50L 的PCR反響體系。大學生命科學學院生物系本科生基因工程實驗論文 2.2.3 設置 PCR 儀的循環(huán)程序 94 3min 94 30s 58 30s 72 1min 72 10min PCR完畢后取9l產(chǎn)物進展瓊脂糖凝膠泳。觀察是否有預計分子量的主要產(chǎn)物帶。注退火溫度: 58PCR3h。2.3 DH5和BL21(DE3)感受態(tài)的制備2.3.1 取2個1.5mL 預冷10 min的無菌微量離心管做

17、上相應標記。2.3.2 其中一管參加1.0mL BL21(DE3)菌液另外一管加1.0mL DH5菌液然后在冰上放置 10min 5000r/min 4離心 10min棄上清。2.3.3 參加 1ml 冰冷的 0.1 mol/L CaCl2溶液立即在渦旋混合器上混勻插入冰中靜置 30min。2.3.3 45000r/min 離心 10min。棄上清液后用 1mL 冰冷的 0.1 mol/L CaCl2溶液重懸菌體插入冰中放置 30min。2.3.4 45000r/min 離心 10min。棄上清液后用 200uL 冰冷的 0.1 mol/L CaCl2溶液重懸菌體。2.3.5 在超凈工作臺將兩

18、種菌按50ul/管分裝在1.5ml管放于4冰箱待用。2.4 pMD19-T-BAP的構建及轉化和檢測2.4.1 PCR 產(chǎn)物(BAP)與pMD-19-T PCR 2.1載體直接連接陽性PCR產(chǎn)物與pMD-19-T載體PCR 2.1連接。在離心管中參加 PCR體系 50L總 PCR Supermi* 45L 模板質粒 1L已稀釋50倍Primer1 1L Primer2 1L dd water 2L 循環(huán)30次大學生命科學學院生物系本科生基因工程實驗論文在干式恒溫氣浴中16連接3 h。(實際操作時考慮到PCR產(chǎn)物濃度不高,故加了4L, 沒有加水。) 2.4.2 感受態(tài)細菌的轉化2.4.2.1 將

19、恒溫水浴的溫度調節(jié)到 42。2.4.2.2 從4冰箱中取出感受態(tài)菌冰浴7min。2.4.2.3 取10 uL連接好的質粒與感受態(tài)細菌DH5a混勻在冰上放置20min。2.4.2.4 于42水浴中90S進展熱休克然后在冰中放置4 min在超凈臺上加入300uL LB培養(yǎng)基不含氨芐青霉素37振蕩培養(yǎng)45 min。2.4.2.5 超凈臺上取上述轉化的混合液150L、200L于新的1.5ml的離心管中參加40L 20% *-gal7L 20% IPTG 混勻。2.4.2.6 將上述菌液用涂布棒均勻的涂布在含Amp的LB固體培養(yǎng)基上37恒溫培養(yǎng)過夜。2.4.3 pMD-19-T-BAP的鑒定提取質粒使用

20、tiangen試劑盒2.4.3.1 觀察菌落生長狀態(tài)用10uL槍頭挑取3個白菌落分別置于含1.7mL LB培養(yǎng)基中37搖菌培養(yǎng)8h。2.4.3.2 分別取 1.4mL 的菌液于 1.5mL 離心管中12000r/min 離心1min棄上清。2.4.3.3 柱平衡向吸附柱CP3吸附柱參加收集管中參加500l的平衡液BL,12000rmp離心1分鐘倒掉收集管中的液體將吸附柱放回到收集管中。2.4.3.4 將留有菌體沉淀的離心管加250ul 溶液 P1懸浮細胞沉淀。2.4.3.5 再向離心管中加250ul溶液 P2溫和上下翻轉6-8次。2.4.3.6 向離心管中加350ul溶液 P3溫和上下翻轉6-

21、8次充分混勻此時將出現(xiàn)白色絮狀沉淀12000r/min離心10min。2.4.3.7 吸取上步中離心上清液并轉移到吸附柱12000r/min離心1min棄濾液。2.4.3.8 將吸附柱置回收集管中加500ul 去蛋白液12000r/min離心1min棄pMD-19-T連接反響體系 10L總 pMD-19-T vector 1L PCR 產(chǎn)物 3L dd water 1L Solution 1 5L 大學生命科學學院生物系本科生基因工程實驗論文濾液。2.4.3.9 將制備管置回離心管加600ul 漂洗液 PW12000r/min離心1min棄濾液。2.4.3.10 重復上一步操作。將吸附柱移入收

22、集管中12000r/min空柱離心2分鐘。將吸附柱至于干凈的離心管中向吸附膜的中間部位滴加60lEB室溫放置2分鐘12000r/min離心2min。電泳檢測以藍菌落作對照電泳檢測T4-BAP是否連接并轉化成功。點樣順序為質粒3個藍菌落11個白菌落。2.5 pET-his、pMD19-T-BAP的酶切與回收2.5.1 pET-his、plasmid雙酶切2.5.1.1 pET-his質粒 DNA雙酶切體系 2.5.1.2 BAP質粒 DNA雙酶切體系 2.5.2 pET-his、BAP膠回收2.5.2.1 用 1TAE 和瓊脂糖配制 1%回收膠。2.5.2.2 從恒溫水浴鍋中取出酶切產(chǎn)物分別參加

23、4uL的10 Loading Buffer終止反響并混勻。2.5.2.3 pET-his膠回收點樣順序為pET-his空質粒pET-his大片段小樣pET-his大片段大樣pET-his大片段大樣pET-his質粒DNA雙酶切體系40L總 pET-his質粒 34L Quick Hind 1L Quick Hind 1L 10 Quick Buffer 4 L plasmid 質粒DNA雙酶切體系40L總 plasmid 34L Hind 1L BamH I 1L Buffer 4 L 大學生命科學學院生物系本科生基因工程實驗論文 BAP膠回收點樣順序為pET-his空質粒BAP的PCR 產(chǎn)物

24、pMD19-T-BAP小片段小樣pMD19-T-BAP小片段大樣2.5.2.4 電泳完畢后用卡將含有大量酶切產(chǎn)物的泳道切下EB 染色含小樣的膠塊。在紫外燈下找到目的 DNA 帶用刀片在目的 DNA帶的下上下邊緣各切一個小口作為標記。2.5.2.5 將做好切口標記的凝膠與未染色的凝膠原位對齊根據(jù)小膠條上的切口標記估計未染色的膠塊上大樣的 DNA 酶切產(chǎn)物的位置。2.5.2.6 用刀片切下大膠中 DNA 產(chǎn)物所在的凝膠盡量不要多余的凝膠分別轉移至一個事先稱量過的、滅活的 1.5mL 微量離心管中。再稱量后計算出其中膠塊的重量。2.5.2.7 再用 EB 染色切除 DNA 以后的大膠與小膠條并在一起

25、在紫外燈下檢查是否已把 DNA 帶切走。2.5.2.8 按照 DNA 凝膠回收試劑盒的說明書操作回收 DNA 酶切產(chǎn)物。2.5.2.8.1 向吸附柱CA2中參加500L 的BL12000r/min 1min 離心棄廢液將吸附柱從新回收到收集管中。2.5.2.8.2 將單一的目的DNA條帶膠塊的離心管中參加3倍體積的溶膠劑PN。2.5.2.8.3 在50水浴鍋中放置10 min中間隔2-3 min輕晃幾次確保膠體完全融化沒有膠體顆粒剩余。2.5.2.8.4 將上一步所得的溶液放置室溫后參加吸附柱中室溫放置2分鐘12000r/min離心 1min。2.5.2.8.5 離心后棄廢液。向吸附柱中參加6

26、00L漂洗液pw12000r/min 60s。棄廢液。2.5.2.8.6 重復上步。2.5.2.8.7 空柱離心12000r/min2min棄廢液。開蓋放置徹底晾干。2.5.2.8.8 將CA2參加新的ep管中先參加洗脫緩沖液EB 80L放置2min。12000r/min 2min。收集DNA洗脫液。2.5.2.9 pET-his 、 BAP gene 膠回收電泳驗證 pET-his 膠回收電泳點樣順序為pET-his空質粒膠回收片段 BAP gene 膠回收電泳點樣順序為pET-his空質粒BAP的PCR 產(chǎn)物膠回收片段2.6 pET-his-BAP的構建及轉化和檢測大學生命科學學院生物系本

27、科生基因工程實驗論文 2.6.1 pET- his -BAP的構建1提前將干式恒溫儀或泡沫塑料保溫盒里的水溫度調整到 16。2取一個高壓滅活的 0.5mL 微量離心管參加如下連接體系將上述混合液輕輕震蕩后再短暫離心然后置于 16水中保溫過夜連接。2.6.2 pET-his-BAP轉化BL21DE32.6.2.1 將恒溫水浴的溫度調到 42。2.6.2.2 從4冰箱中取出一管BL21(DE3)感受態(tài)菌插入冰上。2.6.2.3 參加10L 連接好的pET-his-BAP質?；旌弦狠p輕震蕩后放置冰上25min。2.6.2.4 輕輕搖勻后插入 42水浴中90s進展熱休克然后迅速放回冰中靜置5 min。

28、2.6.2.5 在超凈工作臺中向上述管中參加300uL LB不含氨芐青霉素培養(yǎng)基輕輕混勻然后固定到搖床的彈簧架上 37震蕩 45min。2.6.2.6 在超凈工作臺中取上述轉化混合液300ul混勻后滴到含適宜抗菌素(Amp+)的固體 LB 平板培養(yǎng)皿中。從酒精中取出玻璃涂布棒在火上點燃熄滅后稍等片刻待其冷卻后輕輕涂布均勻。2.6.2.7 在涂好的培養(yǎng)皿上做上標記先放置在 37恒溫培養(yǎng)箱中約30min 直到外表的液體都滲透到培養(yǎng)基里后再倒置過來放入 37恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。2.7 pET-his-BAP的誘導表達2.7.1 觀察平板上菌落生長狀態(tài)選擇大小適宜的單菌落以便后續(xù)試驗步驟。2.7.2

29、 將LB培養(yǎng)基分裝到100ml的三角瓶中后參加氨芐青霉素100mL/100L。2.7.3 將加好Amp+的LB培養(yǎng)基分裝到滅菌的試管中1.8mL/管2.7.4 挑菌37搖床中進展搖菌擴培。pET-his-BAP連接體系10L總 pET-his 回收Product 1L (根據(jù)所提質粒濃度確定) BAP 回收Product 7L 10* Ligation Buffer 1L T4 Ligase 1L 大學生命科學學院生物系本科生基因工程實驗論文 2.7.5 質粒提取使用tiangen試劑盒步驟與小提質粒一樣。2.7.6 提質粒后進展電泳檢測。2.7.7 將LB培養(yǎng)基配制成含0.2%的LB-葡萄糖

30、培養(yǎng)基Amp+濃度為120g/ml即100ml/120l的比例參加Amp+2.7.8 將正確的質粒對應的菌液參加6ml的LB-葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)基30慢搖過夜。2.8 SDS檢測pET-his-BAP的表達2.8.1 電泳槽的組裝及配膠2.8.1.1 組裝電泳玻璃并用細橡膠管密封底部和側面然后用夾子夾住玻璃兩側的中央部位。插入梳子后在玻璃上距離梳子齒底部 1cm處做一個標記。拔掉梳子倒入蒸餾水檢驗是否漏水。如不漏水棄掉蒸餾水。2.8.1.2 配制 10%別離膠按順序和量取以下溶液混在一個 50mL 的小燒杯中Acrylamide-Bis 3.96ml 1M Tris(pH8.8) 4.38ml

31、dd water 3.432ml 10% SDS 118.8L TEMED 9.9L 10%APS 118.8L 2.8.1.3 加完TEMED 后拿起燒杯輕輕轉動幾下底部將溶液混勻后立刻緩緩倒入玻璃夾縫中直到液面與所作的標記齊平。剩下的膠液留在小燒杯中傾斜放置。在膠液面上部用 1000uL 微量移液器輕輕地沿玻璃壁來回移動加滿 dd water。靜置約 30min。直到燒杯中剩余的膠液凝固。倒出蒸餾水。2.8.1.5 配支持膠按順序和量取以下溶液混在一個 50mL 的小燒杯中Acrylamide-Bis 0.675ml 0.5M Tris(pH6.8) 0.563ml dd water 3.

32、165ml 10% SDS 45L TEMED 7.5L 10%APS 45L 2.8.1.6 加完TEMED 后拿起燒杯輕輕轉動幾下底部將溶液混勻后立刻倒入玻璃大學生命科學學院生物系本科生基因工程實驗論文夾縫中液面與玻璃上邊緣齊平。然后再慢慢插入梳子靜置約 20min。燒杯中剩下的膠液傾斜放置直到其中的溶液凝固。去掉橡膠管將裝有膠的玻璃和梳子翻轉,貼在電泳槽側面用夾子把玻璃兩邊的中部與電泳槽中部夾在一起。2.8.1.8 在上面的槽中加滿自來水試驗一下是否漏水然后倒掉自來水。2.8.1.9 配制1*加樣緩沖液400mL從上面的電泳槽倒入假設不從下面的電泳槽漏水則加滿緩沖液在將下面的電泳槽也加滿

33、電泳緩沖液小心緩慢地拔出梳子。2.8.2 外源基因的誘導表達2.8.2.1 超凈臺中接種 pET-his-BAP的BL21DE3菌空pET-his轉化BL21DE3菌 BL21DE3空菌。 37搖菌。2.8.2.2 150-170r/min 搖菌設置時間梯度比照。統(tǒng)一加3lIPTG進展誘導。樣品時間梯度34, 5, 6, 7 1.5ha 2hb 3hc2.8.3 各取1.5ml菌液12000rpm離心15min棄上清收獲菌體。用20uldd water重懸菌體參加20ul的2加樣緩沖液煮沸5min。2.8.4 電泳泳道設計1-11泳道加樣順序依次為marker、堿性磷酸酶、IPTG空菌BL2D

34、E3、空載體BL21DE3。3a、3b、3c、4a、4b、4c、7b。另一電泳泳道設計1-11泳道加樣順序依次為marker、堿性磷酸酶、IPTG空菌BL21DE3、空載體BL21DE3。5a、5b、5c、6a、6b、6c、7c。2.8.5 電泳時15mA恒流電泳。直至到條帶到支持膠處改為20 mA電流電泳。2.8.6 染色考馬斯亮藍染色30min流水沖掉染料后清水脫色浸泡過夜。 3 實驗結果與分析 3.1. BAP基因的PCR擴增將實驗室提供的pMD-18-T-BAP質粒進展PCR擴增在30個PCR循環(huán)中得到BAP基因的擴增片段進展瓊脂糖凝膠電泳后沒有得到條帶。而且我們整個在基因工程實驗室做

35、實驗的同學的PCR電泳均沒有條帶產(chǎn)生可能是因為PCR儀有些許的問題影響了實驗結果。因沒有條帶產(chǎn)生進而也沒有照相。3.2 pET-his的提取酶切及膠回收檢驗大學生命科學學院生物系本科生基因工程實驗論文 3.2.1 pET-his的提取電泳檢測如圖1所示3.2.1.1 1-6號樣均為質粒提取的結果本組位于右起第2個泳道。3.2.1.2 實驗結果說明提取質粒成功,但是含量不高,分析原因可能是菌體濃度不夠,所含質粒數(shù)量較少,提取質粒時操作猛烈,導致片段化等。由于第一次照相的效果不好結果看得不太清楚。3.2.2 pET-his酶切結果分析如圖2所示3.2.2.1 左數(shù)第一條帶為pET-his質粒2,3

36、為pET-his質粒酶切的大片段小樣。此為酶切圖譜小的片段已經(jīng)跑出凝膠了我們主要回收大的片段。由小圖1 圖2 大學生命科學學院生物系本科生基因工程實驗論文樣清晰度來看酶切成功的含量應該很大。由于未被酶切的質粒呈現(xiàn)超螺旋構造故電泳時跑的位置靠下。而被酶切的片段呈現(xiàn)線性跑的速率相對較慢故呈現(xiàn)上圖的情形。3.2.3 pET-his酶切膠回收電泳檢驗,如圖3所示3.2.3.1 圖中,2號孔代表未被酶切的質粒,3-7號孔代表膠回收的產(chǎn)物3.2.3.2 由于含量很低照相后無法很清楚的看到條帶在紫外燈下能夠看到條帶但很微量不太清晰。3.3 pMD19-T-BAP的構建轉化檢測 3.3.1 pMD19-T-B

37、AP的構建轉化檢測。3.3.1.1 用已經(jīng)擴增好的PCR 產(chǎn)物(BAP)與pMD-19-T PCR 2.1載體直接連接。并將連接好的pMD19-T-BAP質粒導入DH5感受態(tài)菌中進展誘導鑒定。將轉化的DH5感受態(tài)菌搖菌培養(yǎng)后涂平板。涂到LB(Amp+)的固體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)進展藍白斑鑒定。將每個平板挑取三個白菌落一個藍菌落分別參加加了3mlLB(+Amp)的試管中標記在超凈工作臺中工作。然后培養(yǎng)3h 3.3.1.2 將培養(yǎng)的菌取出按照試劑盒提質粒后進展電泳鑒定。我組的電泳結果過于模糊因而用的別組的照片進展分析圖4 圖3 大學生命科學學院生物系本科生基因工程實驗論文 1為pET-his質粒23,

38、4為藍菌落所提質粒5-10為白菌落所提質粒。3.3.1.3 由圖可知5和7號樣的連接錯誤而6號樣出現(xiàn)兩個條帶可能是因為在挑取菌落的時候挑了兩個以上的單菌落而真正成功連接的為10號樣。3.3.1.4 失敗的原因可能是菌落太小在挑取時顏色分辨的不是很清楚感受態(tài)菌體本身有問題PCR產(chǎn)物有問題T載體有問題平板涂布不均勻連接出現(xiàn)問題等。3.4 pMD19-T-BAP的酶切的酶切結果借用別組的照片我們的在紫外燈下看得到微弱的條帶可是在成像儀照相后看不到條帶3.4.1.1 1為pET-his質粒2為PCR產(chǎn)物3-6為酶切產(chǎn)物。3.4.1.2 3-6中明顯可以看到2條條帶分別為大片段和小片段本次我們需要回收的

39、為大小和PCR產(chǎn)物相近的小片段。所以采用這些酶切結果進展膠回收。3.5 pMD19-T-BAP膠回收的結果圖6 3.5.1 1為PCR產(chǎn)物2-5為膠回收產(chǎn)物。圖5 大學生命科學學院生物系本科生基因工程實驗論文 3.5.2 我組的產(chǎn)物位于第三泳道在紫外燈下能夠看到條帶可能是由于含量太少成像儀照相的照片沒有條帶。3.6 pET-his-BAP的構建及轉化和檢測圖7 3.6.1 由右到左依次為 1為pET-his質粒其余皆為連接載體的提取物3.6.2 由圖可知除了marker外3、4、5、6、7皆有亮度出現(xiàn)但由于有嚴重的拖尾現(xiàn)象所以目前不能確定是否連接正確但為了后續(xù)試驗我組決定擴大培養(yǎng)該五組菌體然后進展蛋白質檢驗。出現(xiàn)嚴重的拖尾現(xiàn)象可能是因為電泳槽的溫度太高導致DNA 片段化進而出現(xiàn)大圍的拖尾現(xiàn)象但具體原因尚不明確。3.7 SDS檢測pET-his-BAP的表達將正確的質粒對應的菌液上步對應的3、4、5、6、7的菌液參加6ml的LB-葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)基30慢搖過夜,參加IPTG進展誘導,本組做的為時間梯度,檢測如圖8所示。圖8 大學生命科學學院生物系本科生基因工程實驗論文分析電泳泳道設計1-11泳道加樣順序依次為m