微生物實(shí)驗(yàn)(生物實(shí)驗(yàn)三)

1、生物大實(shí)驗(yàn)三微生物學(xué)部分實(shí)驗(yàn)?zāi)夸泴?shí)驗(yàn)一、 培養(yǎng)基的配制和滅菌實(shí)驗(yàn)二、 微生物的分離、接種及培養(yǎng)法實(shí)驗(yàn)三、 水中細(xì)菌總數(shù)和大腸菌群的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)四、 微生物的快速鑒定和自動(dòng)化分析技術(shù)實(shí)驗(yàn)五、 抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)六、 微生物的生理生化反應(yīng)實(shí)驗(yàn)七、 微生物菌種保藏實(shí)驗(yàn)八、 沉淀反應(yīng)實(shí)驗(yàn)九、 細(xì)菌鞭毛染色及其運(yùn)動(dòng)的觀察實(shí)驗(yàn)十、 細(xì)菌芽孢、莢膜的染色及觀察實(shí)驗(yàn)一、培養(yǎng)基的配制和滅菌一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.了解配制培養(yǎng)基的原理，并掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟。2.學(xué)習(xí)幾種常用培養(yǎng)基的配制、分裝和滅菌的操作方法。3.進(jìn)一步熟練掌握手提式高壓蒸汽滅菌鍋的使用方法。二、實(shí)驗(yàn)器材1.藥品及試劑：可溶性淀粉，葡萄糖，

2、KNO3，K2HPO4·3H2O，MgSO4·7H2O，F(xiàn)eSO4·7H2O，K2HPO4，1mol/L NaOH，瓊脂，牛肉膏，蛋白胨，NaCl，馬鈴薯2.儀器及其它試管、三角瓶、燒杯、量筒、玻棒、天平、藥匙、高壓蒸汽滅菌鍋、pH試紙(5.5-9.0)、棉花、牛皮紙、記號(hào)筆、麻繩、紗布、干燥箱、培養(yǎng)皿、涂布棒、吸管（1ml）、玻璃珠、PH試紙三、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1.分組配制高氏一號(hào)培養(yǎng)基300ml。配方：可溶性淀粉20g NaCl 0.5g KNO3 1g K2HPO4·3H2O 0.5g MgSO4·7H2O 0.5g FeSO4·7H2

3、O 0.01g 瓊脂 15-25g 水 1000ml pH 7.4-7.62.配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配方：牛肉膏3g 蛋白胨10g NaCl 5g 水1000ml PH 7.4-7.63.配制馬丁氏培養(yǎng)基配方：K2HPO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，蛋白胨5g，葡萄糖l0g，瓊脂1520g，水1000mL，自然pH。配制方法配制20馬鈴薯浸汁 取去皮馬鈴薯200g，切成小塊，加水1000ml。80浸泡1h，用紗布過濾，然后補(bǔ)足失水至所需體積。100Pa滅菌20min。即成20馬鈴薯浸汁，貯存?zhèn)溆?。配制時(shí)，按每100ml馬鈴薯浸汁加入2g葡萄糖，加熱煮沸后加入2g瓊脂，繼續(xù)

4、加熱融化并補(bǔ)足失水。4.每組制備玻璃珠無(wú)菌水(45ml)三角瓶2個(gè)。5.每組制備無(wú)菌水試管(4.5ml/管)10支。6.每組包9cm培養(yǎng)皿24套，6套為一包。7.每組包1ml吸管5支，玻璃刮鏟4個(gè)。四、方法步驟（一）培養(yǎng)基的制備與分裝1.稱量 按培養(yǎng)基配方比例依次準(zhǔn)確地稱取藥品。可溶性淀粉先用少量熱水溶化后再加入其他成份，補(bǔ)足所需水分，混勻后加入瓊脂。2.熔化 在沸水浴鍋中加熱熔化。3.調(diào)pH 用1mol/L NaOH調(diào)pH至7.4-7.6。4.過濾 趁熱用多層紗布過濾（本實(shí)驗(yàn)勿需過濾）5.分裝 將溶化的固體培養(yǎng)基趁熱加至漏斗上，裝試管時(shí)，注意管口不要沾上培養(yǎng)基。液體分裝裝量不超過試管的1/4

5、，固體分裝裝量不超過試管的1/5，分裝三角瓶的量不超過三角瓶容積的一半，半固體分裝裝量為試管的1/3，滅菌后垂直待凝。6.加棉塞 培養(yǎng)基分裝完畢后，在試管口或三角瓶口塞上棉塞，以阻止外界微生物進(jìn)入培養(yǎng)基內(nèi)而造成污染，并保證有良好的通氣性能，然后包扎一層牛皮紙。試管應(yīng)先捆成一捆后再于棉塞外包扎牛皮紙，貼上標(biāo)簽，注明培養(yǎng)基名稱、日期、組別。（二）無(wú)菌水的制備7.用量筒量取45ml水于帶玻璃珠三角瓶中，塞上棉塞，包扎牛皮紙。8.用5ml吸管取4.5ml水于試管中，塞上棉塞，包扎牛皮紙。（三）器皿的準(zhǔn)備9.培養(yǎng)皿的包裝 每6套一包，用舊報(bào)紙包扎（或放在特制鐵皮圓筒里，加蓋扣嚴(yán)）。10.吸管的包裝 首先

6、在吸管的上端塞上一小段棉花，用長(zhǎng)紙條包扎、打結(jié)。11.玻璃涂布棒的包裝方法同吸管的包裝。（四）培養(yǎng)基、無(wú)菌水、器皿的滅菌12.將培養(yǎng)基、無(wú)菌水放入高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)，1.05kg/cm2壓力，121.3,20min濕熱滅菌。如因特殊情況不能及時(shí)滅菌，則應(yīng)放入冰箱內(nèi)暫存。13.滅菌完畢，將試管培養(yǎng)基冷至50左右，將試管棉塞擱在玻棒（或木棍）上，擱成斜面，擱置的斜面長(zhǎng)度以不超過試管總長(zhǎng)度的一半為宜。14.將滅菌的培養(yǎng)基放入37的溫室中培養(yǎng)2448h，以檢查滅菌是否徹底。15.器皿放入干熱滅菌箱內(nèi)，加熱滅菌。五、思考題1.培養(yǎng)基配好后，為什么必須立即滅菌？如何檢查滅菌后的培養(yǎng)菌是無(wú)菌的？2.加壓蒸汽滅

7、菌的原理是什么？是否只要壓力表上的指針指到所需的壓力時(shí)就能達(dá)到所需滅菌溫度？為什么？3.干熱滅菌應(yīng)該注意哪些事項(xiàng)？4.管口、瓶口為什么要用棉塞？能否用木塞或棉皮塞代替？為什么？六、實(shí)驗(yàn)報(bào)告實(shí)驗(yàn)二、微生物的分離、接種及培養(yǎng)法一、目的要求1.掌握倒平板的方法、劃線分離法、稀釋平板分離法和菌落（活菌）計(jì)數(shù)法。2.熟練掌握微生物的接種技術(shù)，學(xué)會(huì)微生物的一般培養(yǎng)方法和無(wú)菌操作技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原理從混雜的微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過程稱為微生物的分離與純化。常用的分離方法有：1)平板劃線分離法；2）稀釋平板分離法。在食品發(fā)酵工業(yè)中，通過微生物的分離、純化，選育優(yōu)良的微生物菌種，以提高產(chǎn)品的

8、質(zhì)量和產(chǎn)量；在食品衛(wèi)生管理方面，需要進(jìn)行微生物檢測(cè)，必須將微生物單一分離出來，加以鑒別和研究。土壤是微生物生活的大本營(yíng)，它所含微生物無(wú)論是數(shù)量還是種類都是極其豐富的。因此土壤是微生物多樣性的重要場(chǎng)所，可以從中分離、純化得到許多有價(jià)值的菌株。微生物的分離和接種是微生物學(xué)中重要的技術(shù)之一，需要嚴(yán)格的無(wú)菌操作。三、實(shí)驗(yàn)材料1.菌種：葡萄球菌、枯草桿菌、大腸桿菌、酵母菌、毛霉、曲霉、青霉等含菌樣品。2.培養(yǎng)基：肉湯蛋白胨培養(yǎng)基（斜面、平板）、肉湯蛋白胨液體培養(yǎng)基、蔡氏瓊脂培養(yǎng)基（斜面、平板）。3.土壤（自帶）或其他物品；無(wú)菌水，無(wú)菌培養(yǎng)基，無(wú)菌吸管，無(wú)菌三角瓶等。 四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與步驟（一）微生物的分離

9、技術(shù)1.平板劃線分離法 借助劃線使混雜的微生物在平板的表面分散開，以獲得單個(gè)菌落，從而達(dá)到 分離的目的。具體方法如下：倒制平板制備含菌樣品稀釋液劃線倒置適溫培養(yǎng)觀察記錄1)倒制平板：將固體培養(yǎng)基熔化冷卻至50-55注入培養(yǎng)皿內(nèi)15ml（無(wú)菌操作）旋勻靜置凝固即成平板在皿蓋邊貼標(biāo)。2)含菌樣液制備：樣品少許（1-10g），加入盛有無(wú)菌水的試管內(nèi)，搖勻，制成菌懸液即可，能直接劃線的樣品（如體液、黏液、污水等），可省去這操作。3)劃線：左手持平板，接種環(huán)經(jīng)灼燒滅菌后，以無(wú)菌操作取樣，迅速將接種環(huán)伸入培養(yǎng)皿，輕輕劃線（切勿把平板表面劃破）。然后將培養(yǎng)皿倒置放入恒溫培養(yǎng)箱37，培養(yǎng)24-48小時(shí)，觀察

10、平板上出現(xiàn)的現(xiàn)象，注意菌落的形狀，并做記錄2.稀釋平板分離法：采用稀釋手段，使樣品分散到最低限度，然后吸取一定量注入平皿內(nèi)，倒入培養(yǎng)基，搖勻靜置凝固后培養(yǎng)，這樣被分離的細(xì)菌被固定在原處而形成菌落，可作為一種計(jì)數(shù)方法。1)制備土壤稀釋液：（細(xì)菌的分離）以無(wú)菌操作，稱取樣品10g，加入裝有90ml無(wú)菌水的錐形瓶中，振蕩10-20分鐘，使土樣與水充分混合，即成 10-1土壤稀釋液，然后在酒精燈火焰旁，用無(wú) 菌移液管吸取1ml10-1的稀釋液注入9ml無(wú)菌水的試管內(nèi)，制成10-2的稀釋液。用同樣方法再制成10-3，10-4，10-5，10-6的稀釋液。稀釋完畢后，可用原來的移液管，從菌液濃度最小的10

11、-6的稀釋液開始吸取1ml的10-6稀釋液，加到相應(yīng)編號(hào)10-6的無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)，以相同方法分別吸取1ml的10-5、10-4的稀釋液加到相應(yīng)編號(hào)為10-5、10-4的無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)。注意：每稀釋一個(gè)濃度，必須更換一支無(wú)菌吸管。用稀釋平板計(jì)數(shù)時(shí)，待測(cè)菌稀釋度的選擇應(yīng)根據(jù)樣品確定。樣品中所含待測(cè)菌的數(shù)量多時(shí)，稀釋度應(yīng)高，反之則低。測(cè)定土壤細(xì)菌數(shù)量時(shí)，采用10-4、10-5、10-6稀釋度，測(cè)定放線菌數(shù)量時(shí)，采用l0-3、10-4、10-5稀釋度，測(cè)定真菌數(shù)量時(shí)，采用10-2、10-3、10 -4稀釋度。2)平板的制作：將固體培養(yǎng)基融化，待冷卻至45-50左右，分別傾入已盛有10-4、10-5、10-

12、6稀釋液的無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)，輕輕搖勻，靜置凝固。凝固后將平板倒置于37恒溫箱中，培養(yǎng)24-48小時(shí)，細(xì)菌即在所固定的位置長(zhǎng)成肉眼能見的菌落。（二）微生物的接種方法將有菌的材料或純粹的菌種轉(zhuǎn)移到另一無(wú)菌的培養(yǎng)基上，這個(gè)過程就稱為接種。常用的接種方法如下：1.斜面接種：從已長(zhǎng)好微生物的菌種管移接到另一斜面管的方法。左手持菌種管和斜面管，使斜面向上，并盡量放平。用右手先將棉塞擰轉(zhuǎn)松動(dòng)，再拿接種環(huán)，滅菌后，接種。此法用于好氣性微生物的接種。2.液體接種：由斜面菌接種到液體培養(yǎng)基（如試管或三角瓶等）中的方法。在將接種環(huán)送入液體培養(yǎng)基中時(shí)，使環(huán)在液體與管壁接觸的地方輕輕磨擦，使菌體分散，然后塞上棉塞，再輕輕搖

13、動(dòng)均勻，即可培養(yǎng)。如果菌種是培養(yǎng)在液體培養(yǎng)基中時(shí)，一般用移液管或滴管接種。3.穿刺接種：用接種針挑取菌種后，插入深層固體培養(yǎng)基內(nèi)，（不要刺到底部），再沿原路拔出，此法用于厭氣性細(xì)菌接種、檢查細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)能力。4.平板接種：將菌種接至培養(yǎng)皿的方法，平板接種的目的是觀察菌落形態(tài)、分離純化菌種，活菌計(jì)數(shù)以及在平板上進(jìn)行各種試驗(yàn)時(shí)采用的一種接種方法，可分為下面幾種：1)斜面接平板a.劃線法：見平板劃線分離法。b.點(diǎn)種法：一般用于觀察霉菌和酵母細(xì)胞，輕輕點(diǎn)在平板的表面（根霉點(diǎn)一點(diǎn)，曲霉、酵母可點(diǎn)3-4點(diǎn)）即可。2)平板接斜面：一般是將經(jīng)平板分散培養(yǎng)得到的單菌落接種到斜面，以便作鑒定或擴(kuò)大培養(yǎng)、保 存之用。

14、注意事項(xiàng)不同種類的微生物，其培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間有所不同。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告1觀察劃線分離的菌落形態(tài)。2采用菌落計(jì)數(shù)法，計(jì)算出所檢土壤樣品的細(xì)菌總數(shù)（活菌數(shù)）。3稀釋分離時(shí)，為何要將融化的培養(yǎng)基冷卻到50左右，才倒入裝有菌液的培養(yǎng)皿內(nèi)？實(shí)驗(yàn)三、水中細(xì)菌總數(shù)和大腸菌群的檢測(cè)（一)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1)了解和學(xué)習(xí)水中細(xì)菌總數(shù)和大腸菌群的測(cè)定原理和測(cè)定意義。(2)學(xué)習(xí)和掌握用稀釋平板計(jì)數(shù)法測(cè)定水中細(xì)菌總數(shù)的方法。(3)學(xué)習(xí)和掌握水中大腸菌群的檢測(cè)方法。（二）實(shí)驗(yàn)原理水是微生物廣泛分布的天然環(huán)境。各種天然水中常含有一定數(shù)量的微生物。水中微生物的主要來源有：水中的水生性微生物(如光合藻類)、來自土壤徑流、降雨的外來菌群

15、和來自下水道的污染物和人畜的排泄物等。水中的病原菌主要來源于人和動(dòng)物的傳染性排泄物。水的微生物學(xué)的檢驗(yàn)，特別是腸道細(xì)菌的檢驗(yàn)，在保證飲水安全和控制傳染病上有著重要意義，同時(shí)也是評(píng)價(jià)水質(zhì)狀況的重要指標(biāo)。國(guó)家飲用水標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，飲用水中大腸菌群數(shù)每升中不超過3個(gè)，細(xì)菌總數(shù)每ml不超過100個(gè)。所謂細(xì)菌總數(shù)是指1ml或1g檢樣中所含細(xì)菌菌落的總數(shù)，所用的方法是稀釋平板計(jì)數(shù)法，由于計(jì)算的是平板上形成的菌落(colony-forming unit，cfu)數(shù)，故其單位應(yīng)是cfu/g(ml)。它反映的是檢樣中活菌的數(shù)量。所謂大腸菌群，是指在3724h內(nèi)能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸、產(chǎn)氣的兼性厭氧的革蘭氏陰性無(wú)芽胞桿菌的總稱

16、，主要由腸桿菌科中四個(gè)屬內(nèi)的細(xì)菌組成，即埃希氏桿菌屬、檸檬酸桿菌屬、克雷伯氏菌屬和腸桿菌屬。水的大腸菌群數(shù)是指100ml水檢樣內(nèi)含有的大腸菌群實(shí)際數(shù)值，以大腸菌群最近似數(shù)(MPN)表示。在正常情況下，腸道中主要有大腸菌群、糞鏈球菌和厭氧芽胞桿菌等多種細(xì)菌。這些細(xì)菌都可隨人畜排泄物進(jìn)入水源，由于大腸菌群在腸道內(nèi)數(shù)量最多，所以，水源中大腸菌群的數(shù)量，是直接反映水源被人畜排泄物污染的一項(xiàng)重要指標(biāo)。目前，國(guó)際上已公認(rèn)大腸菌群的存在是糞便污染的指標(biāo)。因而對(duì)飲用水必須進(jìn)行大腸菌群的檢查。水中大腸菌群的檢驗(yàn)方法，常用多管發(fā)酵法和濾膜法。多管發(fā)酵法可運(yùn)用于各種水樣的檢驗(yàn)，但操作繁瑣，需要時(shí)間長(zhǎng)。濾膜法僅適用于

17、自來水和深井水，操作簡(jiǎn)單、快速，但不適用于雜質(zhì)較多、易于阻塞濾孔的水樣。(三)實(shí)驗(yàn)器材(1)菌落總數(shù)的測(cè)定：1)培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，無(wú)菌生理鹽水。2)器材：滅菌三角瓶，滅菌的具塞三角瓶，滅菌平皿，滅菌吸管，滅菌試管等。(2)大腸菌群的測(cè)定；1)培養(yǎng)基：乳糖膽鹽蛋白胨培養(yǎng)基：蛋白胨20g，豬膽鹽(或牛、羊膽鹽)5g，乳糖10g，0.04%溴甲酚紫水溶液25ml，水1000ml，pH7.4。制法：將蛋白胨、膽鹽從乳糖溶于水中，校正pH，加入指示劑，分裝，每瓶50ml或每管5ml，并倒置放入一個(gè)杜氏小管，l15滅菌15min。伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨10g，乳糖10g， K2HP04

18、2g，2伊紅水溶液20ml，0.65美藍(lán)水溶液l0ml，瓊脂17g，水1000ml，pH7.1。制法：將蛋白胨、磷酸鹽和瓊脂溶于水中，校正pH后分裝121滅菌15min備用。臨用時(shí)加入乳糖并熔化瓊脂，冷至50-55，加入伊紅和美藍(lán)溶液，搖勻，傾注平板。乳糖發(fā)酵管：除不加膽鹽外其余同乳糖膽鹽蛋白胨培養(yǎng)基。2)器材：滅菌三角瓶，滅菌的具塞三角瓶，滅菌平皿，滅菌吸管，滅菌試管等。（四）實(shí)驗(yàn)方法(1)水樣的采集：1)自來水：先將自來水龍頭用酒精燈火焰灼燒滅菌，再開放水龍頭使水流5min，以滅菌三角瓶接取水樣以備分析。2)池水、河水、湖水等地面水源水：在距岸邊5m處，取距水面10-15cm的深層水樣，先

19、將滅菌的具塞三角瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻轉(zhuǎn)過來，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛滿后，將瓶塞蓋好，再?gòu)乃腥〕?。如果不能?h內(nèi)檢測(cè)的，需放入冰箱中保存。(2)細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定：1)水樣稀釋及培養(yǎng)：按無(wú)菌操作法，將水樣作10倍系列稀釋。根據(jù)對(duì)水樣污染情況的估計(jì)，選擇2-3個(gè)適宜稀釋度(飲用水如自來水、深井水等，一般選擇1、1:10兩種濃度；水源水如河水等，比較清潔的可選擇1:10、1:100、1:1000三種稀釋度；污染水被選擇1:100、1:1000、1:10000三種稀釋度)，吸取1ml稀釋液于滅菌平皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度作3個(gè)重復(fù)。將熔化后保溫度45的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基倒平皿，每皿約15ml

20、，并趁熱轉(zhuǎn)動(dòng)平皿混合均勻。待瓊脂凝固后，將平皿倒置于37培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24±1h后取出，計(jì)算平皿內(nèi)菌落數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，即得1mL水樣中所含的細(xì)菌菌落總數(shù)。2)計(jì)算方法：作平板計(jì)數(shù)時(shí)，可用肉眼觀察，必要時(shí)用放大鏡檢查，以防遺漏。在記下各平板的菌落數(shù)后，求出同稀釋度的各平板平均菌落數(shù)。3)計(jì)數(shù)的報(bào)告：平板菌落數(shù)的選擇：選取菌落數(shù)在30-300之間的平板作為菌落總數(shù)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)。一個(gè)稀釋度使用兩個(gè)重復(fù)時(shí)，應(yīng)選取兩個(gè)平板的平均數(shù)。如果一個(gè)平板有較大片狀菌落生長(zhǎng)時(shí)，則不宜采用，而應(yīng)以無(wú)片狀菌落生長(zhǎng)的平板計(jì)數(shù)作為該稀釋度的菌數(shù)。若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，可計(jì)算半個(gè)平板

21、后乘2以代表整個(gè)平板的菌落數(shù)。稀釋度的選擇：a. 應(yīng)選擇平均菌落數(shù)在30-300之間的稀釋度，乘以該稀釋倍數(shù)報(bào)告之(表1例1)。b若有兩個(gè)稀釋度，其生長(zhǎng)的菌落數(shù)均在30-300之間，則視二者之比如何來決定。若其比值小于2，應(yīng)報(bào)告其平均數(shù)；若比值大于2，則報(bào)告其中較小的數(shù)字(l例2、例3)。c若所有稀釋度的平均菌落均大于300，則應(yīng)按稀釋倍數(shù)最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之(l例4)。d若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30、則應(yīng)按稀釋倍數(shù)最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之(1例5)。e. 若所有稀釋度均無(wú)菌落生長(zhǎng)，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)報(bào)告之（表1例6)。f. 若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在

22、30-300之間，則以最接近30或300的平均菌落數(shù)乘以該稀釋倍數(shù)報(bào)告之(表l例7)。細(xì)菌總數(shù)的報(bào)告：細(xì)菌的菌落數(shù)在l00以內(nèi)時(shí)，按其實(shí)有數(shù)報(bào)告；大于100時(shí)，用二位有效數(shù)字，在二位有效數(shù)字后面的數(shù)字，以四舍五入方法修約。為了縮短數(shù)字后面的0的個(gè)數(shù)，可用10的指數(shù)來表示，如表1“報(bào)告方式”一欄所示。(3)大腸菌群的測(cè)定(多管發(fā)酵法)：表1 稀釋度的選擇及細(xì)菌數(shù)報(bào)告方式稀釋度及菌落數(shù)兩稀釋度之比菌落總數(shù)/（cfu/g或cfu/ml）報(bào)告方式（菌落總數(shù)）/（cfu/ml或cfu/g）10-110-210-31多不可計(jì)16420-1640016000或1.6×1042多不可計(jì)295461.

23、63775038000或3.8×1043多不可計(jì)271602.22710027000或2.7×1044多不可計(jì)多不可計(jì)313-313000310000或3.1×105527115-270270或6000-10107多不可計(jì)30512-3050031000或3.1×1041)生活飲用水或食品生產(chǎn)用水的檢驗(yàn)：初步發(fā)酵試驗(yàn)：在2個(gè)各裝有50ml的3倍濃縮乳糖膽鹽蛋白胨培養(yǎng)液(可稱為三倍乳糖膽鹽)的三角瓶中(內(nèi)有倒置杜氏小管)，以無(wú)菌操作各加水樣100ml。在10支裝有5ml的三倍乳糖膽鹽的發(fā)酵試管中(內(nèi)有倒置小管)，以無(wú)菌操作各加入水樣10ml。如果飲用水的大

24、腸菌群數(shù)變異不大，也可以接種3份100ml水樣。搖勻后，37培養(yǎng)24h。平板分離：經(jīng)24h培養(yǎng)后，將產(chǎn)酸產(chǎn)氣及只產(chǎn)酸的發(fā)酵管(瓶)，分別劃線接種于伊紅美藍(lán)瓊脂平板(EMB培養(yǎng)基)上，37培養(yǎng)1824h。大腸菌群在EMB平板上，菌落呈紫黑色，具有或略帶有或不帶有金屬光澤，或者呈淡紫紅色，僅中心顏色較深；挑取符合上述特征的菌落進(jìn)行涂片，革蘭氏染色，鏡檢。復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)：將革蘭氏陰性無(wú)芽胞桿菌的菌落的剩余部分接于單倍乳糖發(fā)酵管中，為防止遺漏，每管可接種來自同一初發(fā)酵管的平板上同類型菌落13個(gè)，37培養(yǎng)24h，如果產(chǎn)酸又產(chǎn)氣者，即證實(shí)有大腸菌群存在。報(bào)告：根據(jù)證實(shí)有大腸菌群存在的復(fù)發(fā)酵管的陽(yáng)性管數(shù)，查表2

25、（或表3），報(bào)告每升水樣中的大腸菌群數(shù)(MPN)。2)水源水的檢驗(yàn)：用于檢驗(yàn)的水樣量，應(yīng)根據(jù)預(yù)計(jì)水源水的污染程度選用下列各量。嚴(yán)重污染水：1，01，001000lml各1份。中度污染水：101，01，001ml各1份。輕度污染水：100，10，1，01mll各l份。大腸菌群變異不大的水源水：10ml各l0份。表2 大腸菌群檢索表（飲用水）012備注每升水樣中大腸菌群數(shù)03411接種水樣總量300ml（100 ml2份，10 ml10份）138182713273111838414245251830706223692727431208315116193660230104069230表3 大腸菌群數(shù)

26、變異不大的飲用水陽(yáng)性管數(shù)0123接種水樣總量300ml（3份100 ml）每升水樣中大腸菌群數(shù)341118表4 大腸菌群檢索表（嚴(yán)重污染水）接種水樣量/ml每升水樣中大腸菌群數(shù)備注10.10.010.001-900接種水樣總量為1.111（1，0.1，0.01，0.001ml各一份）-+900-+-900-+-950-+1800-+-+1900-+-2200+-2300-+2800+-+9200+-+-9400+-+18000+-23000+-+96000+-238000+238000表5大腸菌群檢索表（中度污染水）接種水樣量/ml每升水樣中大腸菌群數(shù)備注1010.10.01-90接種水樣總量

27、為11.11（10，1，0.1，0.01 mL各一份）-+90-+-90-+-95-+180-+-+190-+-220+-230-+280+-+920+-+-940+-+1800+-2300+-+9600+-23800+23800表6大腸菌群檢索表（輕度污染水）接種水樣量/ml每升水樣中大腸菌群數(shù)備注1001010.1-9接種水樣總量為111.1（100，10，1，0.1ml各一份）-+9-+-9-+-9.5-+18-+-+19-+-22+-23-+28+-+92+-+-94+-+180+-230+-+960+-2380+2380表7 大腸菌群變異不大的水源水陽(yáng)性管數(shù)012345678910每

28、升水樣中大腸菌群數(shù)10112236516992120160230230備注接種水樣總量100mL(10ml10份)操作步驟同生活用水或食品生產(chǎn)用水的檢驗(yàn)。同時(shí)應(yīng)注意，接種量1ml及1ml以內(nèi)用單倍乳糖膽鹽發(fā)酵管；接種量在1ml以上者，應(yīng)保證接種后發(fā)酵管(瓶)中的總液體量為單倍培養(yǎng)液量。然后根據(jù)證實(shí)有大腸菌群存在的陽(yáng)性管(瓶)數(shù)，查表4、表5、表6或表7，報(bào)告每升水樣中的大腸菌群數(shù)(MPN)。附：濾膜法濾膜法所使用的濾膜是一種微孔濾膜。將水樣注入已滅菌的放有濾膜的濾器中，經(jīng)過抽濾，細(xì)菌即被均勻地截留在膜上，然后將濾膜貼于大腸菌群選擇性培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。再鑒定濾膜上生長(zhǎng)的大腸菌群的菌落，計(jì)算出每升

29、水樣中含有的大腸菌群數(shù)(MPN)。(1)準(zhǔn)備工作：1)濾膜滅菌：將3號(hào)濾膜放入燒杯中，加入蒸餾水，置于沸水浴中蒸煮滅菌3次，每次15min。前兩次煮沸后需換無(wú)菌水洗滌2-3次，以除去殘留溶劑。2)濾器滅菌：準(zhǔn)備容量為500ml的濾器，用點(diǎn)燃的酒精棉球火焰滅菌，也可用121高壓滅菌20min。3)培養(yǎng)：將品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基放入37培養(yǎng)箱內(nèi)預(yù)溫30-60min。(2)過濾水樣：1)用無(wú)菌鑷子夾取滅菌濾膜邊緣部分，將祖糙面向上貼放于已滅菌的濾床上，輕輕地固定好濾器漏斗。水樣搖勻后，取333ml注入濾器中，加蓋，打開濾器閥門，在50kPa壓力下進(jìn)行抽濾。2)水樣濾完后再抽氣約5s，關(guān)上濾器閥門，取下濾

30、器，用無(wú)菌鑷子夾取濾膜邊緣部分，移放在品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基上，濾膜截留細(xì)菌面向上與培養(yǎng)基完全緊貼，兩者間不得留有間隙或氣泡。若有氣泡需用鑷子輕輕壓實(shí)，倒放在37培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)16-18h。(3)結(jié)果判定：1)挑選符合下列特征的菌落進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢。紫紅色，具有金屬光澤的菌落。深紅色，不帶或略帶金屬光澤的菌落。淡紅色，中心顏色較深的菌落。2)凡是革蘭氏陰性無(wú)芽胞桿菌，需再接種于乳糖蛋白胨半固體培養(yǎng)基，37培養(yǎng)6-8h，產(chǎn)氣者，則判定為大腸菌群陽(yáng)性。3)1L水樣中大腸菌群數(shù)等于濾膜法生長(zhǎng)的大腸菌群菌落數(shù)乘以3。實(shí)驗(yàn)四、微生物的快速鑒定和自動(dòng)化分析技術(shù)如何使微生物學(xué)技術(shù)方法快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)易和自動(dòng)化，

31、一直是微生物學(xué)工作者研究的熱點(diǎn)，尤其是臨床醫(yī)學(xué)方面，對(duì)微生物的快速準(zhǔn)確鑒定，更是"時(shí)間就是生命"。近20多年來，隨著微電子、計(jì)算機(jī)、分子生物學(xué)、物理、化學(xué)等先進(jìn)技術(shù)向微生物學(xué)的滲透和多學(xué)科的交叉，這方面已取得了突破性進(jìn)展，許多快速、準(zhǔn)確、敏感、簡(jiǎn)易、自動(dòng)化的方法技術(shù)，不僅在微生物鑒定中廣為使用，而且在微生物學(xué)的其它方面也被采用，推動(dòng)了微生物學(xué)的迅速發(fā)展。一、微量多項(xiàng)試驗(yàn)鑒定系統(tǒng)該系統(tǒng)的根本原理是根據(jù)微生物生理生化特征鑒定的結(jié)果，而進(jìn)行的數(shù)碼分類鑒定。這種技術(shù)也稱為簡(jiǎn)易診檢技術(shù)，或數(shù)碼分類鑒定法。它是針對(duì)微生物的生理生化特征，配制各種培養(yǎng)基、反應(yīng)底物、試劑等，分別微量（約0.

32、1ml）加入各個(gè)分隔室中（或用小圓紙片吸收），冷凍干燥脫水或不干燥脫水，各分隔室在同一塑料條或板上構(gòu)成檢測(cè)卡。試驗(yàn)時(shí)加入待檢測(cè)的某一種菌液，培養(yǎng)248小時(shí)，觀察鑒定卡上各項(xiàng)反應(yīng)，按判定表判定試驗(yàn)結(jié)果，用此結(jié)果編碼，查檢索表(根據(jù)數(shù)碼分類鑒定的原理編制成)，得到鑒定結(jié)果，或?qū)⒕幋a輸入計(jì)算機(jī)，用根據(jù)數(shù)碼分類鑒定原理編制的軟件鑒定，打印出結(jié)果。微量多項(xiàng)試驗(yàn)鑒定系統(tǒng)已廣泛用于動(dòng)、植物檢疫、臨床檢驗(yàn)、食品衛(wèi)生、藥品檢查、環(huán)境監(jiān)測(cè)、發(fā)酵控制、生態(tài)研究等方面，尤其是臨床檢驗(yàn)中深受歡迎，迅猛發(fā)展。國(guó)際上此技術(shù)的產(chǎn)品，或稱系統(tǒng)，種類繁多，國(guó)內(nèi)有河南開封醫(yī)學(xué)生物研究所的腸桿菌科細(xì)菌鑒定卡E-15；上海市衛(wèi)生防疫站

33、的發(fā)酵性革蘭氏陰性桿菌鑒定系統(tǒng)SWF-A；中國(guó)人民解放軍一八一醫(yī)院的厭氧菌快速生化鑒定系列ARB-ID；深圳華士達(dá)生物科技有限公司的腸桿菌科的細(xì)菌生化鑒定卡ENT等。國(guó)外的產(chǎn)品已標(biāo)準(zhǔn)化、系統(tǒng)化和商品化，主要有法國(guó)生物-梅里埃集團(tuán)的API/ATB；瑞士羅氏公司的Micro-ID，Enterotube,Minitek；美國(guó)的Biolog全自動(dòng)和手動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)：日本的微孔濾膜塊等，其中API/ATB包括眾多的鑒定系統(tǒng)，共計(jì)有750種反應(yīng)，可鑒定幾乎所有常見的細(xì)菌。微量多項(xiàng)鑒測(cè)技術(shù)優(yōu)點(diǎn)突出，不僅能快速、敏感、準(zhǔn)確、重復(fù)性好地鑒檢微生物，而且簡(jiǎn)易，節(jié)省人力、物力、時(shí)間和空間，缺點(diǎn)是各系統(tǒng)差異較大，有的

34、價(jià)格貴，有的個(gè)別反應(yīng)不準(zhǔn)，難判定，但毫無(wú)疑問，它是微生物技術(shù)方法向快速、簡(jiǎn)易和自動(dòng)化發(fā)展的重要方向之一。API20E系統(tǒng)是API/ATB中最早和最重要的產(chǎn)品，也是國(guó)際上應(yīng)用最多的系統(tǒng)。該系統(tǒng)的鑒定卡是一塊有20個(gè)分隔室的塑料條，分隔室由相連通的小管和小環(huán)組成，各小管中含不同的脫水培養(yǎng)基、試劑，或底物等，每一分隔室可進(jìn)行一種生化反應(yīng)，個(gè)別的分隔室可進(jìn)行兩種反應(yīng)，主要用來鑒定腸桿菌科細(xì)菌，如圖1所示。圖1 API 20E鑒定卡示意圖鑒定未知細(xì)菌的主要過程：將菌液加入每一個(gè)分隔室；培養(yǎng)后，有的分隔室的小杯中需要添加試劑，觀察鑒定卡上20個(gè)分隔室中的反應(yīng)變色情況，根據(jù)反應(yīng)判定表（表1），判定各項(xiàng)反應(yīng)是

35、陽(yáng)性還是陰性反應(yīng)；按鑒定卡上反應(yīng)項(xiàng)目從左到右的順序，每三個(gè)反應(yīng)項(xiàng)目編為一組，共編為七組，每組中每個(gè)反應(yīng)項(xiàng)目定為一個(gè)數(shù)值，依次是1、2、4，各組中試驗(yàn)結(jié)果判定的反應(yīng)是陽(yáng)性者記""，則寫下其所定的數(shù)值，反應(yīng)陰性者記""，則寫為0，每組中的數(shù)值相加，便是該組的編碼數(shù)，這樣便形成了7位數(shù)字的編碼，表2為舉例說明；用7位數(shù)字的編碼查API20E系統(tǒng)的檢索表，或輸入計(jì)算機(jī)檢索，則能將檢驗(yàn)的細(xì)菌鑒定出是什么菌種或生物型。表1 API20E反應(yīng)判定表鑒定卡上的反應(yīng)項(xiàng)目反 應(yīng) 結(jié) 果 代 號(hào)項(xiàng) 目 名 稱陰 性陽(yáng) 性O(shè)NPN-半乳糖苷酶無(wú)色黃ADH精氨酸水解黃綠紅，橘紅L

36、DC賴氨酸脫羧黃綠紅，橘紅ODC鳥氨酸脫羧黃綠紅，橘紅CIT枸椽酸鹽利用黃綠綠藍(lán)H2S產(chǎn)H2S無(wú)色黑色沉淀URE尿素酶黃紅紫TDA色胺酸脫氨酶黃紅紫IND吲哚形成黃綠紅VPV.P.試驗(yàn)無(wú)色紅GEL蛋白酶黑粒黑液GLU葡萄糖產(chǎn)酸藍(lán)黃綠MAN甘露醇產(chǎn)酸藍(lán)黃綠INO肌醇產(chǎn)酸藍(lán)黃綠SOR山梨醇產(chǎn)酸藍(lán)黃綠RHA鼠李糖產(chǎn)酸藍(lán)黃綠SAC蔗糖產(chǎn)酸藍(lán)黃綠MEL密二糖產(chǎn)酸藍(lán)黃綠AMY淀粉產(chǎn)酸藍(lán)黃綠 ARA阿拉伯糖產(chǎn)酸藍(lán)黃綠表2 API20E舉例說明項(xiàng)目名稱ONPGADHLDCODCCITH 2SURETDAINDVPGELGLUMANINOSORRHASACMELAMYARA所定數(shù)值124124124124124

37、12412試驗(yàn)結(jié)果+-+-+-+記下數(shù)值10412000010412412412編 碼5305773檢索結(jié)果5305773 產(chǎn)氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes）另一種應(yīng)用廣泛的是Enterotube系統(tǒng)，可以稱為腸道管系統(tǒng)。它的鑒定卡是由帶有12個(gè)分隔室的一根塑料管組成，每個(gè)分隔室內(nèi)裝有不同的培養(yǎng)基瓊脂斜面，能檢驗(yàn)微生物的15種生理生化反應(yīng)，一根接種絲穿過全部分隔室的各種培養(yǎng)基，并在塑料管的兩端突出，被兩個(gè)塑料帽蓋著，像一根火腿腸，如圖2所示。圖2 Enterotube系統(tǒng)示意圖 鑒定未知菌時(shí)，將塑料管的兩端帽子移去，用接種絲一端的突出尖端接觸平板上待鑒定的菌落中心，然后

38、在另一端拉出接種絲，通過全部分隔室，使所有培養(yǎng)基都被接種，再將一段接種絲插回到4個(gè)分隔室的培養(yǎng)基中，以保持其還原或厭氧條件。圖3示意腸道管系統(tǒng)的接種過程。培養(yǎng)后，有的分隔室也需加試劑。然后按API20E類似的步驟，觀察反應(yīng)變色情況，判定試驗(yàn)結(jié)果陰性或陽(yáng)性，寫出編碼數(shù)，形成5位數(shù)的編碼，因12個(gè)分隔中有3個(gè)分隔中的培養(yǎng)基都能觀察到2種生化反應(yīng)，此腸道管系統(tǒng)共15個(gè)反應(yīng)，可分為5個(gè)組。根據(jù)編碼查腸道管系統(tǒng)的索引，或用計(jì)算機(jī)檢索，獲得鑒定細(xì)菌的種名或生物型。圖3 Enterotube系統(tǒng)的接種過程有一種可攜帶的檢測(cè)水中大腸菌數(shù)的大腸菌測(cè)試卡，即微孔（Milliporo）濾膜菌落計(jì)數(shù)板（圖4）。它是在

39、一塊拇指大小的塑料板上，裝有一薄層脫水干燥的大腸菌選擇鑒定培養(yǎng)基，其上覆蓋微孔濾膜(0.45m)，整個(gè)塑料板有一外套。檢測(cè)時(shí)，脫下外套，將塑料板浸入受檢水中約半分鐘，濾膜僅允許1毫升水進(jìn)入有培養(yǎng)基的一邊，干燥的培養(yǎng)基則吸水溶解，擴(kuò)散與濾膜相連，而1毫升水中的大腸菌則滯留在膜的另一邊，再將外套套上，培養(yǎng)12-24小時(shí)，統(tǒng)計(jì)濾膜上形成的蘭或綠色菌落數(shù)。菌落的多少可以表明水中污染大腸菌群的狀況。該測(cè)定卡攜帶和培養(yǎng)都方便，適于野外工作和家庭使用，因可以放在人體內(nèi)衣口袋中培養(yǎng)。置換塑料板上的培養(yǎng)基，可以制成檢測(cè)各種樣品的微孔濾膜塊。圖4 大腸菌測(cè)試卡示意圖國(guó)際上常用的6種微量多項(xiàng)試驗(yàn)鑒定系統(tǒng)的優(yōu)、缺點(diǎn)比

40、較，見表3。表3 6個(gè)鑒定系統(tǒng)的優(yōu)、缺點(diǎn)比較特 點(diǎn)EnterotubeR/BAPI20EMinitekPathoTecMicroID準(zhǔn)確性(和常規(guī)法比較)95%9098%9398%91100%95%95+%診檢時(shí)間(小時(shí))182418241824182444最后報(bào)告時(shí)間(小時(shí))4848484824302430系統(tǒng)的簡(jiǎn)單性簡(jiǎn)單簡(jiǎn)單不簡(jiǎn)單較簡(jiǎn)單不簡(jiǎn)單較簡(jiǎn)單底物載體培養(yǎng)基培養(yǎng)基脫水培養(yǎng)基圓紙片紙條圓紙片試驗(yàn)項(xiàng)目數(shù)15142014(35)1215 選擇性良好良好良好很好一般良好不夠穩(wěn)定的項(xiàng)目檸、尿乳、葡/氣 DNaseH2S、賴、鳥、檸H2S尿、七賴、山、肌實(shí)驗(yàn)五、抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康目?/p>

41、微生物藥物敏感性試驗(yàn)（藥敏試驗(yàn)）的主要目的檢出細(xì)菌的耐藥性，預(yù)測(cè)抗微生物藥物的臨床治療效果，并為臨床醫(yī)生針對(duì)某一特定的臨床感染選用藥物提供依據(jù)。對(duì)所有臨床分離的可疑致病菌，如不能從該菌的種屬特征可靠地推知其對(duì)抗菌藥物的敏感性，就需要進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。紙片擴(kuò)散法二、實(shí)驗(yàn)原理此法是臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所（CLSI/NCCLS）所推薦的臨床微生物理學(xué)室常規(guī)開展的藥敏試驗(yàn)方法。將含有定量抗菌藥物的紙片（藥敏紙片）貼在已接種待檢菌的瓊脂平板表面特定部位。藥物借其分子的擴(kuò)散力向周圍瓊脂中擴(kuò)散，形成了隨著離紙片距離加大，瓊脂中的藥物濃度逐漸減少的梯度濃度。其紙片周圍一定區(qū)域瓊脂內(nèi)的藥物濃度高于抑制待檢菌所需濃

42、度時(shí)，則該區(qū)域內(nèi)細(xì)胞不能生長(zhǎng)，形成透明抑制圈。抑菌圈的大小可以反映待檢對(duì)測(cè)定藥物的敏感程度，并與該藥對(duì)待檢菌的最低抑菌濃度（MIC）呈負(fù)相關(guān)，即抑菌圈愈大，MIC愈小。三、實(shí)驗(yàn)器材和試劑1菌種 金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853或臨床分離的菌株。2培養(yǎng)基 MH（Mueller-Hintion）瓊脂。3試劑 無(wú)菌生理鹽水，0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)比濁管（McFarland standard，相當(dāng)于1.5×108CFU/ml），抗菌藥物紙片：選用直徑6.35mm吸水量20l的專用藥敏紙片，包括阿米卡星（AMK）、青霉素（PEN）、氨芐西林

43、（AMP）、哌拉西林（PIP）、頭孢唑啉（FZN）、頭孢呋辛（FRX）、頭孢他啶（CAZ）、頭孢他啶/棒酸（CD03）、氨曲南（ATM）、亞胺培南（IMP）、環(huán)丙沙星（CIP）、萬(wàn)古霉素（VAN）、克林霉素（CLI）、復(fù)方新諾明（SXT）。4其他 無(wú)菌棉拭子、鑷子、毫米尺、接種環(huán)。四、方法步驟1菌液制備（1）對(duì)數(shù)生長(zhǎng)法：從瓊脂平板上選取至少3-5個(gè)形態(tài)特征一致的菌落，用接種環(huán)轉(zhuǎn)移至含45ml的肉湯培養(yǎng)管（如胰酶消化大豆肉湯）中，35孵育2-6h。用無(wú)菌鹽水或肉湯調(diào)整菌液濁度相當(dāng)于0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)。（2）直接菌落法：從孵育18-24h的非選擇性培養(yǎng)基（如血瓊脂）平板上，挑取單個(gè)菌落，直接用肉湯或無(wú)

44、菌鹽水制成0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)濁度的懸液。2接種 細(xì)菌懸液制備后15min內(nèi)接種至MH瓊脂平板。用無(wú)菌棉拭醮取菌懸液，在管內(nèi)壁液面上方旋轉(zhuǎn)緊壓，將多余菌液擠去，最后沿平板內(nèi)緣涂抹一周。3貼藥敏紙片 涂布后的平板在室溫下干燥3-5min，用紙片分配器或無(wú)菌鑷子將紙片貼于瓊脂表面并輕壓，使紙片與瓊脂表面完成接觸。各紙片中心相距應(yīng)大于24mm，紙片貼上后就不能再移動(dòng)位置。4孵育將平板倒置放入35孵箱（苛養(yǎng)菌敏平板應(yīng)放置于5%-10%CO2環(huán)境中），16-18h讀取結(jié)果，葡萄球菌和腸球菌必須孵育24h以檢測(cè)對(duì)苯唑西林和萬(wàn)古霉素的耐藥性。五、結(jié)果判斷抑菌圈的直徑（包含紙片的直徑），以毫米數(shù)報(bào)告（取整數(shù)）。根據(jù)

45、CLSI判定標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量抑菌圈直徑大小可以判斷細(xì)菌對(duì)該抗生素是敏感、中介還是耐藥。敏感（S）：表示常規(guī)劑量的測(cè)定藥物在體內(nèi)所達(dá)到的濃度能抑制或殺滅待測(cè)菌。中介（I）：不是敏感性的度量，而是一個(gè)“緩沖區(qū)”，用以防止因微小的技術(shù)因素失控導(dǎo)致的結(jié)果偏差，因而其臨床意義是不確定的，故不應(yīng)作臨床報(bào)告。耐藥（R）：表示常規(guī)劑量的測(cè)定藥物在體內(nèi)達(dá)到有效濃度時(shí)不能抑制待測(cè)菌生長(zhǎng)。六、藥敏試驗(yàn)結(jié)果判斷注意事項(xiàng)（1）藥敏試驗(yàn)的結(jié)果容易受培養(yǎng)基、抗菌藥物、孵育條件等多種因素影響，實(shí)驗(yàn)室開展藥敏試驗(yàn)時(shí)應(yīng)定期用標(biāo)準(zhǔn)菌株對(duì)上述因素進(jìn)行質(zhì)量控制。（2）變形桿菌屬的菌株可擴(kuò)散到某些抗菌藥物的抑菌圈內(nèi)，所以在明顯的抑菌圈內(nèi)有薄膜樣

46、爬行生長(zhǎng)可以忽略。（3）對(duì)于鏈球菌應(yīng)檢測(cè)生長(zhǎng)抑制圈而不是溶血抑制圈。對(duì)于甲氧芐啶和磺胺，拮抗物可使細(xì)菌輕微生長(zhǎng)，所以抑菌圈直徑的檢測(cè)不考慮細(xì)微生長(zhǎng)的部分（生長(zhǎng)菌苔的20%或以下）而測(cè)量比較明顯的邊緣。（4）對(duì)于沙門菌屬和志賀菌屬的分離株只有氨芐西林、一種喹諾酮類藥物和磺胺甲唑/甲氧芐啶可用于常規(guī)試驗(yàn)和報(bào)告，第一、第二代頭孢菌素和氨基糖苷類抗生素體外可能對(duì)這些菌株有活性，但臨床卻無(wú)效，所以對(duì)上述藥物不應(yīng)報(bào)告為敏感。（5）沙門菌屬的腸道外分離株應(yīng)測(cè)試并報(bào)告氯霉素和一種三代頭孢菌素的敏感性。（6）腸球菌屬對(duì)頭孢菌素類、氨基糖苷類（僅篩選高水平耐藥性）、磺胺甲 唑/甲氧芐啶和克林霉素在體外可能有活性，

47、但在臨床上耐藥，所以不能報(bào)告對(duì)這些藥物敏感。對(duì)抑菌環(huán)大小的解釋標(biāo)準(zhǔn)七、影響藥敏結(jié)果的因素1.培養(yǎng)基：應(yīng)根據(jù)試驗(yàn)菌的營(yíng)養(yǎng)需要進(jìn)行配制。傾注平板時(shí)，厚度合適（約5-6mm），不可太薄，一般90mm直徑的培養(yǎng)皿，傾注培養(yǎng)基18-20ml為宜。培養(yǎng)基內(nèi)應(yīng)盡量避免有抗菌藥物的拮抗物質(zhì)，如鈣、鎂離子能減低氨基糖苷類的抗菌活性，胸腺嘧啶核苷和對(duì)氨苯甲酸（PABA）能拮抗磺胺藥和TMP的活性。2.細(xì)菌接種量：細(xì)菌接種量應(yīng)恒定，如太多，抑菌圈變小，能產(chǎn)酶的菌株更可破壞藥物的抗菌活性。3.藥物濃度：藥物的濃度和總量直接影響抑菌試驗(yàn)的結(jié)果，需精確配制。商品藥應(yīng)嚴(yán)格按照其推薦治療量配制。4.培養(yǎng)時(shí)間：一般培養(yǎng)溫度和時(shí)

48、間為37 8-18小時(shí)，有些抗菌藥擴(kuò)散慢如多粘菌素，可將已放好抗菌藥的平板培養(yǎng)基，先置4冰箱內(nèi)2-4小時(shí)，使抗菌藥預(yù)擴(kuò)散，然后再放37溫箱中培養(yǎng)，可以推遲細(xì)菌的生長(zhǎng)，而得到較大的抑菌圈。八、思考題1.操作藥敏試驗(yàn)并說出注意事項(xiàng)。2.試述藥敏試驗(yàn)的意義？3.如何根據(jù)藥敏試驗(yàn)的結(jié)果選擇藥物？4.什么叫抑菌圈？如何根據(jù)抑菌圈大小判斷細(xì)菌對(duì)藥物的敏感度？九、實(shí)驗(yàn)報(bào)告附：干燥抗菌紙片的制備取直徑6mm的無(wú)菌濾紙片，浸于一定濃度的抗菌藥液中，一般每毫升抗菌藥液中，裝濾紙片100片，浸泡12h后，37干燥或真空干燥，密封冷藏備用。實(shí)驗(yàn)六、微生物的生理生化反應(yīng)微生物生理生化反應(yīng)的多樣性在自然界產(chǎn)生了兩種結(jié)果:

49、第一是使自然界的有機(jī)分子都有可能得到分解;第二是使不同微生物之間有了互相作用和互相依賴的基礎(chǔ).例如,一種微生物能利用另一種微生物所分解的產(chǎn)物,或者一種微生物的產(chǎn)物可抑制或殺死另一種微生物.所以微生物的生理生化反應(yīng)也被作為細(xì)菌鑒定和分類的內(nèi)容。一、大分子物質(zhì)的水解試驗(yàn)(一)目的要求1.證明不同微生物對(duì)各種有機(jī)大分子的水解能力不同,從而說明不同微生物有著不同的酶系統(tǒng)。2.掌握進(jìn)行微生物大分子水解試驗(yàn)的原理和方法。(二)基本原理微生物對(duì)大分子的淀粉,蛋白質(zhì)和脂肪不能直接利用,必須靠產(chǎn)生的胞外酶將大分子物質(zhì)分解才能被微生物吸收利用.胞外酶主要為水解酶,通過加水裂解大的物質(zhì)為較小的化合物,使其能被運(yùn)輸至

50、細(xì)胞內(nèi).如淀粉酶水解淀粉為小分子的糊精,雙糖和單糖;脂肪酶水解脂肪為甘油和脂肪酸;蛋白酶水解蛋白質(zhì)為氨基酸等.這些過程均可通過觀察細(xì)菌菌落周圍的物質(zhì)變化來證實(shí):淀粉遇碘液會(huì)產(chǎn)生藍(lán)色,但細(xì)菌水解淀粉的區(qū)域,用碘測(cè)定不再產(chǎn)生藍(lán)色,表明細(xì)菌產(chǎn)生淀粉酶.脂肪水解后產(chǎn)生脂肪酸可改變培養(yǎng)基的pH,使pH降低,加入培養(yǎng)基的中性紅指示劑會(huì)使培養(yǎng)基從淡紅色變?yōu)樯罴t色,說明胞外存在著脂肪酶。微生物可以利用各種蛋白質(zhì)和氨基酸作為氮源外,當(dāng)缺乏糖類物質(zhì)時(shí),亦可用它們作為碳源和能源.明膠是由膠原蛋白經(jīng)水解產(chǎn)生的蛋白質(zhì),在25以下可維持凝膠狀態(tài),以固體形式存在.而在25以上明膠就會(huì)液化.有些微生物可產(chǎn)生一種稱作明膠酶的胞

51、外酶,水解這種蛋白質(zhì),而使明膠液化,甚至在4仍能保持液化狀態(tài)。還有些微生物能水解牛奶中的蛋白質(zhì)酪素,酪素的水解可用石蕊牛奶來檢測(cè).石蕊培養(yǎng)基由脫脂牛奶和石蕊組成,是昏濁的藍(lán)色.酪素水解成氨基酸和肽后,培養(yǎng)基就會(huì)變得透明.石蕊牛奶也常被用來檢測(cè)乳糖發(fā)酵,因?yàn)樵谒岽嬖谙?石蕊會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)榉奂t色,而過量的酸可引起牛奶的固化(凝乳形成).氨基酸的分解會(huì)引起堿性反應(yīng),使石蕊變?yōu)樽仙?此外,某些細(xì)菌能還原石蕊,使試管底部變?yōu)榘咨?。尿素是由大多?shù)哺乳動(dòng)物消化蛋白質(zhì)后被分泌在尿中的廢物.尿素酶能分解尿素釋放出氨,這是一個(gè)分辨細(xì)菌很有用的診斷實(shí)驗(yàn).盡管許多微生物都可以產(chǎn)生尿素酶,但它們利用尿素的速度比變形桿菌屬(P

52、roteus)的細(xì)菌要慢,因此尿素酶試驗(yàn)被用來從其他非發(fā)酵乳糖的腸道微生物中快速區(qū)分這個(gè)屬的成員.尿素瓊脂含有蛋白胨,葡萄糖,尿素和酚紅.酚紅在pH6.8時(shí)為黃色,而在培養(yǎng)過程中,產(chǎn)生尿素酶的細(xì)菌將分解尿素產(chǎn)生氨,使培養(yǎng)基的pH升高,在pH升至8.4時(shí),指示劑就轉(zhuǎn)變?yōu)樯罘奂t色。(三)器材1.菌種 枯草芽胞桿菌,大腸桿菌,金黃色葡萄球菌,銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa),普通變形桿菌。2.培養(yǎng)基 固體油脂培養(yǎng)基,固體淀粉培養(yǎng)基,明膠培養(yǎng)基試管,石蕊牛奶試管,尿素瓊脂試管。3.溶液或試劑 革蘭氏染色用盧戈氏碘液(Lugol's iodine solution)。

53、4.儀器或其他用具 無(wú)菌平板,無(wú)菌試管,接種環(huán),接種針,試管架。(四)操作步驟l.淀粉水解試驗(yàn)(1)將固體淀粉培養(yǎng)基溶化后冷卻至50左右,無(wú)菌操作制成平板。(2)用記號(hào)筆在平板底部劃成四部分。(3)將枯草芽孢桿菌,大腸桿菌,金黃色葡萄球菌,銅綠假單胞菌分別在不同的部分劃線接種,在平板的反面分別在四部分寫上菌名。(4)將平板倒置在37溫箱中培養(yǎng)24h。(5)觀察各種細(xì)菌的生長(zhǎng)情況,將平板打開蓋子,滴入少量Lugol's碘液于平皿中,輕輕旋轉(zhuǎn)平板,使碘液均勻鋪滿整個(gè)平板。如菌苔周圍出現(xiàn)無(wú)色透明圈,說明淀粉己被水解,為陽(yáng)性.透明圈的大小可初步判斷該菌水解淀粉能力的強(qiáng)弱,即產(chǎn)生胞外淀粉酶活力的高低。2.油脂水解試驗(yàn)(1)將溶化的固體油脂培養(yǎng)基冷卻至50左右時(shí)