微生物學(xué)課程論文

1、土壤微生物主要類群的分離、記數(shù)及形態(tài)特征比較生 命 科 學(xué) 學(xué) 院 級(jí) 專業(yè)：生物工程 姓 名： 指 導(dǎo) 教 師 無(wú) 摘要：本實(shí)驗(yàn)是微生物學(xué)綜合性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，包含了微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中的微生物的分離和純化、微生物的選擇性培養(yǎng)、平板菌落計(jì)數(shù)（即活菌計(jì)數(shù)）、培養(yǎng)基的制備、高壓蒸汽滅菌、微生物主要類群的培養(yǎng)特征和形態(tài)特征、制片染色技術(shù)等。 1 本文記錄了對(duì)采自校園附近農(nóng)田的土樣中微生物主要類群的分離和純化等試驗(yàn)操作方法和結(jié)果。所采每克土樣中幾種不同類群微生物的含量分別為：細(xì)菌6.63*107個(gè)、放線菌7.38*105個(gè)、霉菌2.33*104個(gè)，說(shuō)明土壤中微生物種類的繁多和數(shù)量的龐大。培養(yǎng)基的種類和組分的不同

2、可用于分離或富集不同的微生物。關(guān)鍵詞：分離 純化 平板菌落計(jì)數(shù) 微生物的形態(tài)1.前言：（1）、微生物在自然界及其在土壤中的分布簡(jiǎn)況；微生物因其體積小、重量輕和數(shù)量多等原因，可以到處傳播以致達(dá)到“無(wú)孔不入”的地步，只要條件合適，它們就可“隨遇而安”。地球上除了火山的中心區(qū)域等少數(shù)地方外，從土壤圈、水圈、大氣圈至巖石圈，到處都有它們的蹤跡。 由于土壤具備了各種微生物生長(zhǎng)發(fā)育所需要的營(yíng)養(yǎng)、水分、空氣、酸堿度、滲透壓和溫度等條件，所以成了微生物生活的良好環(huán)境?？梢哉f(shuō)，土壤是微生物的“天然培養(yǎng)基”，也是它們的“大本營(yíng)”，對(duì)人類來(lái)說(shuō)，則是最豐富的菌種資源庫(kù)。盡管土壤的類型眾多，其中各種微生物的含量變化很大

3、，但一般來(lái)說(shuō)，在每克耕作層土壤中，各種微生物含量之比大體有一個(gè)10倍系列的遞減規(guī)律：細(xì)菌（108）>放線菌（107，孢子）>霉菌（106，孢子）>酵母菌（105）>藻類（104）>原生動(dòng)物（103）（2）、土壤中各種類群的微生物的含量的大致情況；土壤微生物包括細(xì)菌、放線菌、真菌、藻類和原生動(dòng)物 5大類群。是土壤生物中數(shù)量最多的一類。 細(xì)菌每克表層土壤中約含細(xì)菌幾百萬(wàn)至幾千萬(wàn)個(gè)，是土壤菌類中數(shù)量最多的一個(gè)類群;放線菌,每克表層土壤約含放線菌幾十萬(wàn)至幾千萬(wàn)個(gè)，是數(shù)量上僅次于細(xì)菌的一個(gè)類群;真菌,每克表層土壤只含真菌幾千至幾十萬(wàn)個(gè)，是土壤菌類中數(shù)量最少的一個(gè)類群，但其生

4、物量指每平方米面積中菌體的重量（克）高于細(xì)菌和放線菌;藻類,直徑350微米,喜濕，多棲居于土壤表面或表土層中，數(shù)量較菌類少。土壤中常見(jiàn)的有綠藻、藍(lán)藻和硅藻。藍(lán)藻中有的種類能固定空氣中的氮素。 （3）、土壤中的微生物的作用；土壤微生物在土壤中的作用是多方面的，土壤微生物的區(qū)系組成、生物量及其生命活動(dòng)對(duì)土壤的形成和發(fā)育有密切關(guān)系。同時(shí),土壤作為微生物的生態(tài)環(huán)境,也影響微生物在土壤中的消長(zhǎng)和活性。并參與土壤有機(jī)物質(zhì)的礦化和腐殖質(zhì)化過(guò)程；同時(shí)通過(guò)同化作用合成多糖類和其他復(fù)雜有機(jī)物質(zhì)，影響土壤的結(jié)構(gòu)和耕性。土壤微生物的代謝產(chǎn)物還能促進(jìn)土壤中難溶性物質(zhì)的溶解。微生物參與土壤中各種物質(zhì)的氧化還原反應(yīng)，對(duì)營(yíng)養(yǎng)

5、元素的有效化也有一定作用。參與土壤中營(yíng)養(yǎng)元素的循環(huán)，包括碳素循環(huán)、氮素循環(huán)和礦物元素循環(huán)，促進(jìn)植物營(yíng)養(yǎng)元素的有效性。某些微生物有固氮作用，可借助其體內(nèi)的固氮酶將空氣中的游離氮分子轉(zhuǎn)化為固定態(tài)氮化物。與植物根部營(yíng)養(yǎng)關(guān)系密切。植物根際微生物以及與植物共生的微生物如根瘤菌、菌根和真菌等能為植物直接提供氮素、磷素和其他礦質(zhì)元素的營(yíng)養(yǎng)以及各種有機(jī)營(yíng)養(yǎng)，如有機(jī)酸、氨基酸、維生素、生長(zhǎng)刺激素等。能為工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和醫(yī)藥衛(wèi)生事業(yè)提供有效菌種，培育高效菌系，如已在農(nóng)業(yè)上應(yīng)用的有根瘤菌劑、固氮菌劑和抗生菌劑等。某些抗生性微生物能防治土傳病原菌對(duì)作物的危害。降解土壤中殘留的有機(jī)農(nóng)藥、城市污物和工廠廢棄物等，降低殘毒為害

6、。某些微生物可用于沼氣發(fā)酵，提供生物能源、發(fā)酵液和殘?jiān)袡C(jī)肥料。 （4）、本實(shí)驗(yàn)的主要過(guò)程和實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的簡(jiǎn)單說(shuō)明和分析，通過(guò)實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)論等。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)采樣、選擇性培養(yǎng)、平板菌落計(jì)數(shù)(即活菌計(jì)數(shù))、培養(yǎng)基的制備、高壓蒸汽滅菌、等方法，對(duì)土壤中的微生物進(jìn)行分離計(jì)數(shù)，并通過(guò)革蘭氏染色等實(shí)驗(yàn)觀察方法對(duì)微生物個(gè)體形態(tài)等進(jìn)行培養(yǎng)與觀察，以及制片染色技術(shù)等。結(jié)果發(fā)現(xiàn)土壤中微生物的含量極為豐富，含有霉菌，細(xì)菌，放線菌菌種。通過(guò)比較對(duì)微生物形態(tài)等有所進(jìn)一步的了解與認(rèn)識(shí)。 2.材料與方法2.1材料2.1.1土樣：以無(wú)菌方式采于學(xué)校內(nèi)小園林，置于無(wú)菌容器中，待檢2.1.2培養(yǎng)基2.1.2.1營(yíng)養(yǎng)瓊脂（牛

7、肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基）1: 牛肉膏 3g/L 蛋白胨10g/L NaCI5g/L 瓊脂15-20g/L 水500ml pH 7.0-7.2 121滅菌20min 2.1.2.2高氏一號(hào)固體培養(yǎng)基11：可溶性淀粉20g/L 硝酸鉀1g/L氯化鈉0.5g/L磷酸氫二鉀0.5g/L硫酸鎂0.5g/L 硫酸亞鐵0.01g/L 瓊脂20g/L 水500ml pH 7.2-7.4 配置時(shí)，先用少量冷水，把淀粉調(diào)成糊狀，倒入煮沸的水中，在火上加熱，邊攪拌邊加入其他成分，溶化后，補(bǔ)足水分至500ml ，121滅菌20min,滅菌后，在100ml培養(yǎng)基中加入10%酚溶液5滴（作為抑制劑，以抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)），制備

8、平板備用。2.1.2.3查氏固體培養(yǎng)基1：硝酸鈉2g/L磷酸氫二鉀1g/L硫酸鎂(MgSO4·7H2O)0.5g氯化鉀0.5g/L硫酸亞鐵0.01g/L蔗糖30g/L瓊脂15-20g/L水500mL pH自然分裝后121滅菌20min 2.1.2.4馬丁氏培養(yǎng)基：1：KH2PO4 1g/L MgSO4·7H2O 05g/L 蛋白胨 5g/L 葡萄糖 10g/L 瓊脂 1520g/L 蒸餾水 500ml pH 自然1/3000孟加拉紅水溶液 33mg/L 121滅菌30min 臨用前加入0.03%鏈霉素稀釋液100ml,使每毫升培養(yǎng)基中含鏈霉素30ug 2.1.2.5無(wú)菌水：

9、裝有90ml蒸餾水和數(shù)拾粒玻璃珠的250ml錐形瓶一只，裝有9ml蒸餾水的18×180mm試管數(shù)支；121.3， 20分鐘滅菌，備用2.1.3染色液2.1.3.1革蘭氏染色液1 草酸銨結(jié)晶紫染液，盧戈氏碘液，95%乙醇，番紅復(fù)染液等2.1.3.2 0.1%美藍(lán)1 用于放線菌菌絲形態(tài)觀察2.1.3.3乳酸石炭酸棉藍(lán)液1 A液：堿性復(fù)紅(basic fuchsin) 03g 95%酒精 10ml B液：石炭酸 50g 蒸餾水 95ml 將堿性復(fù)紅在研缽中研磨后，逐漸加入95%酒精，繼續(xù)研磨使其溶解，配成A液。 將石炭酸溶解于水中，配成B液。 混合A液及B液即成。通?？蓪⒋嘶旌弦合♂?10

10、倍使用，稀釋液易變質(zhì)失效，一次不宜多配。用于霉菌形態(tài)觀察2.2方法2.2.1制備土壤稀釋液 稱取土樣10g，放入盛90mL無(wú)菌水并帶有玻璃珠的三角瓶中，振蕩，使土樣與水充分混合，將細(xì)胞分散。靜置，成為土壤懸液(10-1)。用1mL的無(wú)菌吸頭從中吸取1mL土壤懸液注入盛有9mL無(wú)菌水的試管中，吹吸3次，振蕩混勻(10-2)。然后再用同一支1mL吸頭，從此管中吸取1mL注入另一盛有9mL無(wú)菌水的試管中(10-3)，依此類推制成10-4，10-5，10-6，10-6各種稀釋度的土壤溶液。 2.2.2制備及涂布平板 用一支1mlL無(wú)菌吸管分別從稀釋度10-7、10-6和10-5的土壤稀釋液中各吸取0.

11、2mL菌液于已備好的2.1.2.1平板，用無(wú)菌玻璃涂棒在培養(yǎng)基表面輕輕地涂布均勻。涂布時(shí)從低濃度到高濃度分別在培養(yǎng)基表面輕輕地涂布，可轉(zhuǎn)動(dòng)皿底一定角度，繼續(xù)涂布，直至均勻。每個(gè)濃度做1個(gè)平板。 用一支1mlL無(wú)菌吸管分別從稀釋度10-6、10-5和10-4的土壤稀釋液中各吸取0.2mL菌液于已備好的2.1.2.2平板，用無(wú)菌玻璃涂棒在培養(yǎng)基表面輕輕地涂布均勻。涂布時(shí)從低濃度到高濃度分別在培養(yǎng)基表面輕輕地涂布，可轉(zhuǎn)動(dòng)皿底一定角度，繼續(xù)涂布，直至均勻。每個(gè)濃度做1個(gè)平板。 用一支1mlL無(wú)菌吸管分別從稀釋度10-5、10-4和10-3的土壤稀釋液中各吸取0.2mL菌液于已備好的2.1.2.3平板，

12、用無(wú)菌玻璃涂棒在培養(yǎng)基表面輕輕地涂布均勻。涂布時(shí)從低濃度到高濃度分別在培養(yǎng)基表面輕輕地涂布，可轉(zhuǎn)動(dòng)皿底一定角度，繼續(xù)涂布，直至均勻。每個(gè)濃度做1個(gè)平板。 用一支1mlL無(wú)菌吸管分別從稀釋度10-5、10-4和10-3的土壤稀釋液中各吸取0.2mL菌液于已備好的2.1.2.1平板，用無(wú)菌玻璃涂棒在培養(yǎng)基表面輕輕地涂布均勻。涂布時(shí)從低濃度到高濃度分別在培養(yǎng)基表面輕輕地涂布，可轉(zhuǎn)動(dòng)皿底一定角度，繼續(xù)涂布，直至均勻。每個(gè)濃度做1個(gè)平板。 2.2.3培養(yǎng)培養(yǎng)基2.1.2.1平板倒置于37培養(yǎng)箱，23天；培養(yǎng)基2.1.2.2平板倒置于28培養(yǎng)箱57天；培養(yǎng)基2.1.2.3和培養(yǎng)基2.1.2.4平板倒置于2

13、8培養(yǎng)箱35天； 2.2.4菌落計(jì)數(shù) 培養(yǎng)結(jié)束后，根據(jù)不同類群的微生物的菌落特征，分別在不同的培養(yǎng)基平板上統(tǒng)計(jì)相關(guān)類群的微生物菌落，即培養(yǎng)基2.1.2.1統(tǒng)計(jì)細(xì)菌的菌落；培養(yǎng)基2.1.2.2統(tǒng)計(jì)放線菌的菌落；培養(yǎng)基2.1.2.3和培養(yǎng)基2.1.2.4統(tǒng)計(jì)霉菌的菌落。由下式計(jì)算每克土壤中相關(guān)微生物的菌落形成單位（cfu）： 個(gè)/克=同一稀釋度三次重復(fù)的平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×52.2.5挑單菌落 從不同的培養(yǎng)基平板上，選取細(xì)菌、放線菌和霉菌各三個(gè)菌落分別轉(zhuǎn)接到營(yíng)養(yǎng)瓊脂、高氏一號(hào)、查氏培養(yǎng)基斜面中，每個(gè)菌落接兩支斜面試管，編號(hào)標(biāo)記，分別置培養(yǎng)箱培養(yǎng)，備用2.2.6細(xì)菌的革蘭氏染色

14、和形態(tài)觀察 對(duì)從2.2.5中選出的細(xì)菌分別做革蘭氏染色，觀察記錄三株細(xì)菌的革蘭氏染色結(jié)果和個(gè)體形態(tài)2.2.7放線菌的插片培養(yǎng)和形態(tài)觀察 對(duì)從2.2.5中選出的放線菌分別做平板劃線、插片培養(yǎng)，培養(yǎng)后觀察記錄三種放線菌的菌絲形態(tài)。每個(gè)平板中，以約45°角將1-2片無(wú)菌蓋玻片斜插入平板上第一次劃線的部位。2.2.8霉菌的點(diǎn)植培養(yǎng)和形態(tài)觀察 對(duì)從2.2.5中選出的霉菌分別做點(diǎn)植培養(yǎng)，每個(gè)平板上點(diǎn)植接種三個(gè)點(diǎn)，培養(yǎng)后制片，觀察、記錄三種霉菌的菌絲和產(chǎn)無(wú)性孢子的子實(shí)體的形態(tài)3.結(jié)果3.1土壤樣品中細(xì)菌、放線菌、霉菌的菌落形成單位（cfu）見(jiàn)表1、表2、表3： 表1 細(xì)菌稀釋度10-510-610

15、-7各重復(fù)的菌落數(shù)187472127633503986731cfu/克4.35*106 2.45*1071.70*108平均（cfu/克）6.63*107 放線菌稀釋度10-410-510-6各重復(fù)的菌落數(shù)142162259162348262cfu/克2.48*1059.67*1051.00*106平均（cfu/克）7.38*105表2 霉菌稀釋度10-310-410-5培養(yǎng)基2.1.2.32.1.2.42.1.2.32.1.2.42.1.2.32.1.2.4各重復(fù)的菌落數(shù)1080218012016532238301353003cfu/克06.33*1041.33*1041051.5*1052

16、*105表33.1.1細(xì)菌是，形成的菌落??；細(xì)菌個(gè)體之間充滿著水分，整個(gè)菌落顯得濕潤(rùn)，易被接種環(huán)挑起；球菌形成隆起的菌落；有鞭毛細(xì)菌常形成邊緣不規(guī)則的菌落；具有莢膜的菌落表面較透明，邊緣光滑整齊；有芽孢 的菌落表面干燥皺褶；有些能產(chǎn)生色素的細(xì)菌菌落還顯出鮮艷的顏色。3.1.2放線菌菌落特征：菌落干燥、不透明，表面呈致密的絲絨狀，其上有一層彩色，主要為粉紅色的“干粉”，菌落和培養(yǎng)基連接緊密，難以挑取，其正反面顏色不一致。正面為粉紅色，而反面為乳白色，在菌落邊緣的瓊脂平面有變形現(xiàn)象。3.1.3曲霉菌落特征：菌落較大，質(zhì)地疏松，外觀干燥而不透明，菌落與培養(yǎng)基連接緊密，不易挑取，其正反面顏色不同，邊緣

17、不整齊，其正面為淡黃色，反面為黃色。高度較高，隆起。3.1.4根霉菌落特征：菌落無(wú)定形，為絮狀，高度很高，覆蓋整個(gè)培養(yǎng)皿，質(zhì)地疏松，外觀干燥為褐色、不透明。菌落與培養(yǎng)基連接緊密，不易挑取。3.2分離的三株細(xì)菌的革蘭氏染色結(jié)果及形態(tài)見(jiàn)表4：3.3分離的放線菌的形態(tài)見(jiàn)圖1：3.4分離的霉菌的形態(tài)見(jiàn)圖2：表4菌株編號(hào)革蘭氏染色結(jié)果菌體形態(tài)1G- 球菌2G-桿菌3G+球菌C-4-f-02 放線菌的形態(tài)特征 圖1C-5-m-1 C-4-m-01圖24.討論4.1結(jié)果3.1說(shuō)明土壤中分布著種類繁多和數(shù)量巨大的微生物。沒(méi)有一種培養(yǎng)基或一種培養(yǎng)條件能夠滿足一切微生物生長(zhǎng)的需要，在一定程度上所有的培養(yǎng)基都是選擇

18、性的。如果某種微生物的生長(zhǎng)需要是已知的，也可以設(shè)計(jì)特定環(huán)境使之適合這種微生物的生長(zhǎng)，因而能夠從混雜的微生物群體中把這種微生物選擇培養(yǎng)出來(lái)，盡管在混雜的微生物群體中這種微生物可能只占少數(shù)。這種通過(guò)選擇培養(yǎng)進(jìn)行微生物純培養(yǎng)分離的技術(shù)稱為選擇培養(yǎng)分離，特別適用于從自然界中分離、尋找有用的微生物。要分離這種微生物，必須根據(jù)該微生物的特點(diǎn)，包括營(yíng)養(yǎng)、生理、生長(zhǎng)條件等，采用選擇培養(yǎng)分離的方法?；蛞种剖勾蠖鄶?shù)微生物不能生長(zhǎng)，或造成有利于該菌生長(zhǎng)的環(huán)境，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間培養(yǎng)后使該菌在群落中的數(shù)量上升，再通過(guò)平板稀釋等方法對(duì)它進(jìn)行純培養(yǎng)分離 4.2結(jié)果3.2培養(yǎng)基中的某些組分對(duì)富集、分離和純化特定的微生物有較重要的

19、作用4.3 實(shí)驗(yàn)的結(jié)論性的小結(jié) 微生物的稀釋平板計(jì)數(shù)是根據(jù)在固體培養(yǎng)基上所形成的一個(gè)菌落，即是由一個(gè)單細(xì)胞繁殖而成，且肉眼可見(jiàn)的子細(xì)胞群體這一生理及培養(yǎng)特征進(jìn)行的。也就是說(shuō)一個(gè)菌落即代表一個(gè)單細(xì)胞。計(jì)數(shù)時(shí)，首先將待測(cè)樣品制成均勻的一系列不同稀釋液，并盡量使樣品中的微生物細(xì)胞分散開來(lái)，使成單個(gè)細(xì)胞存在(否則一個(gè)菌落就不只是代表一個(gè)菌)，再取一定稀釋度、一定量的稀釋液接種到平板中，使其均勻分布于平板中的培養(yǎng)基內(nèi)。經(jīng)培養(yǎng)后，由單個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖形成菌落，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目，即可計(jì)算出樣品中的含菌數(shù)。從混雜的微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過(guò)程稱為微生物的分離與純化。進(jìn)行分離時(shí)常用的方法有：簡(jiǎn)易單細(xì)胞挑取法和平板分離法。本實(shí)驗(yàn)采用的是平板分離法，其是普