流式細(xì)胞儀原理及軟件介紹

1、流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀FLOW CYTOMETERFLOW CYTOMETERBeckman Coulter流式細(xì)胞儀發(fā)展史流式細(xì)胞儀發(fā)展史u1947年年Wallace Coulter發(fā)明了庫(kù)爾特原理，用于血細(xì)胞分析發(fā)明了庫(kù)爾特原理，用于血細(xì)胞分析u1953年推出了世界上第一臺(tái)流式細(xì)胞分析儀年推出了世界上第一臺(tái)流式細(xì)胞分析儀Coulter Counter Model Au1972年推出世界上第一臺(tái)激光流式細(xì)胞儀年推出世界上第一臺(tái)激光流式細(xì)胞儀EPICS II u1975年研制出世界上第一臺(tái)帶計(jì)算機(jī)的流式細(xì)胞儀年研制出世界上第一臺(tái)帶計(jì)算機(jī)的流式細(xì)胞儀 u1997年推出世界上第一臺(tái)單激光四色數(shù)字化流

2、式細(xì)胞儀年推出世界上第一臺(tái)單激光四色數(shù)字化流式細(xì)胞儀EPICS XL/MCL u2000年首先將高精度數(shù)字化顏色補(bǔ)償技術(shù)年首先將高精度數(shù)字化顏色補(bǔ)償技術(shù)ADC（Advanced Digital Compensation）應(yīng)用于流式平臺(tái)，引領(lǐng)流式進(jìn)入全新的全矩陣補(bǔ)償、全自動(dòng)）應(yīng)用于流式平臺(tái)，引領(lǐng)流式進(jìn)入全新的全矩陣補(bǔ)償、全自動(dòng)補(bǔ)償和脫機(jī)補(bǔ)償時(shí)代補(bǔ)償和脫機(jī)補(bǔ)償時(shí)代u2003年推出世界上第一臺(tái)單激光五色的流式細(xì)胞儀年推出世界上第一臺(tái)單激光五色的流式細(xì)胞儀FC500/MCL，2005年升級(jí)年升級(jí)為為FC500/MPLu2006年推出世界上第一臺(tái)具有年推出世界上第一臺(tái)具有EV參數(shù)同時(shí)進(jìn)行無成本絕對(duì)計(jì)數(shù)的

3、多功能細(xì)胞參數(shù)同時(shí)進(jìn)行無成本絕對(duì)計(jì)數(shù)的多功能細(xì)胞分析系統(tǒng)分析系統(tǒng)Quanta SC， 將流式細(xì)胞術(shù)與庫(kù)爾特原理完美結(jié)合將流式細(xì)胞術(shù)與庫(kù)爾特原理完美結(jié)合，2007年推出年推出MPL進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)u2007年收購(gòu)年收購(gòu)Dako公司的公司的Moflo和和Cyan，使，使Beckman公司成為高端流式市場(chǎng)的公司成為高端流式市場(chǎng)的領(lǐng)導(dǎo)者領(lǐng)導(dǎo)者u2009年，推出世界是第一臺(tái)三激光十色的分析型流式細(xì)胞儀年，推出世界是第一臺(tái)三激光十色的分析型流式細(xì)胞儀Gallios/NaviosEPICS XL-ADC QUANTA SCCytomics FC500Beckman Coulter Celllab Famil

4、yMoFlo XDPGallios/NaviosCyan ADPFC500硬件硬件What is flow cytometry?流式細(xì)胞術(shù)是單個(gè)細(xì)流式細(xì)胞術(shù)是單個(gè)細(xì)胞胞/顆粒流過檢測(cè)裝置顆粒流過檢測(cè)裝置過程中，檢測(cè)到的物過程中，檢測(cè)到的物理和理和/或化學(xué)的特性?；蚧瘜W(xué)的特性。Howard Shapiro, Practical Flow Cytometry, 3rd Edition分類分類u分析型：只能分析用，液流進(jìn)入廢液筒分析型：只能分析用，液流進(jìn)入廢液筒u分選型：回收目標(biāo)細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。要求管分選型：回收目標(biāo)細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。要求管道絕對(duì)無菌。道絕對(duì)無菌。 基本原理基本原理流路（液流系

5、統(tǒng)）流路（液流系統(tǒng)）n流動(dòng)室 n鞘液SHEATH n樣本流SAMPLE 單細(xì)胞懸液5*1051*106個(gè)/ml光路（光學(xué)系統(tǒng)）光路（光學(xué)系統(tǒng)）n光源n濾片n光電倍增管PMT HV電路（電路系統(tǒng)）電路（電路系統(tǒng)）n放大電路HV及GAIN 增益nA/D轉(zhuǎn)換分析系統(tǒng)：計(jì)算機(jī)分析系統(tǒng)：計(jì)算機(jī)流路構(gòu)造流路構(gòu)造 流流 路路u 單細(xì)胞懸液?jiǎn)渭?xì)胞懸液u 大多數(shù)儀器是在大多數(shù)儀器是在50-300 50-300 m m 大小的孔徑中大小的孔徑中, ,將細(xì)將細(xì)胞懸液注射進(jìn)入鞘液中胞懸液注射進(jìn)入鞘液中 u這一過程這一過程, ,成為流體動(dòng)力學(xué)聚焦成為流體動(dòng)力學(xué)聚焦FLOW CELLInjector TipFluores

6、cencesignalsFocused laserbeamSheath fluid光路構(gòu)造光路構(gòu)造光光 路路光源光源檢測(cè)信號(hào)檢測(cè)信號(hào) 散射光信號(hào)散射光信號(hào)FS: 前向角散射光前向角散射光SS: 側(cè)向角散射光側(cè)向角散射光(90度散射光度散射光) 熒光信號(hào)熒光信號(hào)熒光染料熒光染料光學(xué)濾片光學(xué)濾片 光光 路路u光源光源與通過的細(xì)胞聚焦在同一點(diǎn)上與通過的細(xì)胞聚焦在同一點(diǎn)上 u 激光激光 空冷空冷 488nm blue, 633nm red, 325nm UV, 514nm green,空冷空冷/水冷水冷Enterprise II水冷水冷Innova300系列系列Innova70系列系列常用激光器及其通

7、道分配表常用激光器及其通道分配表檢測(cè)信號(hào)檢測(cè)信號(hào) 散射光信號(hào)散射光信號(hào)前向散射光前向散射光(FS)uFS-Forward (Angel Light) Scatter在激光束正前方的檢測(cè)器在激光束正前方的檢測(cè)器, 為前向散射光檢測(cè)器為前向散射光檢測(cè)器 uFS的強(qiáng)度與細(xì)胞或其他顆粒的大小的強(qiáng)度與細(xì)胞或其他顆粒的大小, 形狀及形狀及 optical homogeneity 有關(guān)有關(guān)uFS用于檢測(cè)細(xì)胞或其他粒子的表面屬性用于檢測(cè)細(xì)胞或其他粒子的表面屬性如如:大小大小 FALS SensorLaser前向散射光前向散射光 前向散射光前向散射光 散射光信號(hào)散射光信號(hào) 側(cè)向散射光側(cè)向散射光uSS-Side

8、(Angel Light) Scatter 與激光束垂直方向的檢測(cè)器為側(cè)向檢測(cè)器與激光束垂直方向的檢測(cè)器為側(cè)向檢測(cè)器, 也稱也稱為為90度散射光檢測(cè)器度散射光檢測(cè)器uSS用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)如如:胞漿內(nèi)顆粒多少胞漿內(nèi)顆粒多少, 核質(zhì)比核質(zhì)比 FALS Sensor90LS SensorLaser側(cè)向散射光側(cè)向散射光側(cè)向散射光側(cè)向散射光90 Degree Scatter0 200 400 600 8001000Forward Scatter0 200 400 600 8001000 815203040501002001000LymphocytesMonocytesNeutro

9、philsSide Scatter ProjectionForward Scatter ProjectionLight Scatter GatingScale 光路光路-熒光信號(hào)熒光信號(hào)u每種熒光染料均有特定的激發(fā)波長(zhǎng)每種熒光染料均有特定的激發(fā)波長(zhǎng), 并激發(fā)后會(huì)并激發(fā)后會(huì)有發(fā)射波長(zhǎng)有發(fā)射波長(zhǎng),流式細(xì)胞儀檢測(cè)的即是它特定的發(fā)射流式細(xì)胞儀檢測(cè)的即是它特定的發(fā)射波長(zhǎng)波長(zhǎng). u 利用各種不同波長(zhǎng)的光學(xué)濾片來收集利用各種不同波長(zhǎng)的光學(xué)濾片來收集(檢測(cè)檢測(cè))這些這些光學(xué)信號(hào)光學(xué)信號(hào)熒光染料的特性激發(fā)波長(zhǎng)(EXCITING)發(fā)射波長(zhǎng)(EMISSION)常用熒光染料的特性熒光染料 激發(fā)波長(zhǎng) (nm) 發(fā)射波長(zhǎng)

10、(nm) 用途 顏色FITC 488 525 免疫熒光 綠色PE(RD1) 488 575 免疫熒光 橙色 ECD 488 620 免疫熒光 橙紅PeCy5 488 675 免疫熒光 紅PI 488 620 DNA染色 橙紅PECy7 488 755 免疫熒光 深紅PerCP 488 670APC 633 6705 Color Single Laser (488nm)FITC/PE/ECD/PC5/PC7熒光染料比較熒光染料比較(平均熒光強(qiáng)度平均熒光強(qiáng)度) Q-Prep / ImmunoPrep 試劑系統(tǒng)試劑系統(tǒng)PerCP APC FITC ECD PC5 PECD8-FITCCD8-PECD

11、8-ECDCD8-PC5CD8-PerCPCD8-APCFreqFluorescenceFALS SensorFluorescence detector( FL1,FL2,FL3,FL4,FL5,SS)光路光路 - 濾片特性濾片特性u(píng) 長(zhǎng)通濾片長(zhǎng)通濾片 允許長(zhǎng)于設(shè)定波長(zhǎng)的光通過允許長(zhǎng)于設(shè)定波長(zhǎng)的光通過u 短通濾片短通濾片 允許短于設(shè)定波長(zhǎng)的光通過允許短于設(shè)定波長(zhǎng)的光通過u 帶通濾片帶通濾片 允許一定帶寬的波長(zhǎng)通過允許一定帶寬的波長(zhǎng)通過 光路光路 - 濾片特性濾片特性u(píng) 當(dāng)以當(dāng)以 45o 角角放置濾片時(shí)放置濾片時(shí),該濾片可以通過一定波該濾片可以通過一定波長(zhǎng)的光長(zhǎng)的光,同時(shí)也可以阻斷并折射該波長(zhǎng)以

12、下的光同時(shí)也可以阻斷并折射該波長(zhǎng)以下的光 u這種方式的濾片稱為二向色性濾片這種方式的濾片稱為二向色性濾片( dichroic filter) 濾片濾片u帶通濾片帶通濾片 BAND PASS (BP)BAND PASS (BP)l只允許某些波長(zhǎng)的光通過只允許某些波長(zhǎng)的光通過u二向色性濾片二向色性濾片 DICHROIC FILTERDICHROIC FILTERl一定波長(zhǎng)以上通過，該波長(zhǎng)以下折射一定波長(zhǎng)以上通過，該波長(zhǎng)以下折射630 nm BandPass FilterTransmitted LightWhite Light Source620 -640 nm LightDichroic Filter/Mirror at 45 degReflected lightTransmitted LightLight SourceOptics - DetectorslPhotomultiplier tube (PMT)n 將光學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娒}沖(數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù))信號(hào) 不同的脈沖信號(hào)被轉(zhuǎn)換成數(shù)字通道不同的脈沖信號(hào)被轉(zhuǎn)換成數(shù)字通道(CHANNEL)的過程的