干擾素的工藝制備流程

1、基因工程藥物 -干擾素的制備 1 什么是干擾素u概念(interferon,IFN)：機(jī)體免疫細(xì)胞產(chǎn)生的一類細(xì)胞因子，是機(jī)體受到病毒感染時(shí)，免疫細(xì)胞通過抗病毒應(yīng)答反應(yīng)而產(chǎn)生的一組結(jié)構(gòu)類似、功能接近的生物調(diào)節(jié)蛋白。u根據(jù)分子結(jié)構(gòu)和抗原性的差異分為、等4個(gè)類型。1.1天然干擾素的分類天然干擾素的分類 1. 根據(jù)來源、基因序列和氨基酸組成分類 I 型干擾素：IFN、IFN、IFN 、IFN 來源：白細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、病毒感染的組織細(xì)胞等 功能 ：抗病毒感染、抗腫瘤生長(zhǎng) 、免疫調(diào)節(jié)(較弱） 其中IFN-為多基因產(chǎn)物，有23種以上的亞型。 II 型干擾素：干擾素（IFN) 來源：活化的T細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)

2、生 功能：免疫調(diào)節(jié) 提高單核巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞的抗原提呈能力 增強(qiáng)Tc細(xì)胞和NK細(xì)胞的殺傷活性 抑制TH2細(xì)胞形成，下調(diào)體液免疫應(yīng)答 趨化作用 抗病毒和抗腫瘤作用（次要） 2.2. 根據(jù)動(dòng)物來源確定分類 人干擾素（HuIFN），小鼠干擾素（MuIFN）。v不同來源的干擾素1.2 重組干擾素的臨床應(yīng)用重組干擾素的臨床應(yīng)用v廣譜抗病毒活性（rhuIFN） 慢性乙型、丙型、丁型肝炎；皰疹、病毒性角膜炎。v直接抗腫瘤活性（rhuIFN） 毛細(xì)胞和慢性髓樣白血病、 Kaposi肉瘤、非霍奇金淋巴瘤。v免疫調(diào)節(jié)活性治療慢性肉芽腫瘤（rhuIFN）v多發(fā)性硬化癥 rhuIFN2 基因工程大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)工

3、藝基因工程大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝干擾素生產(chǎn)工藝路線干擾素生產(chǎn)工藝路線上市產(chǎn)品：重組人干擾素rhuIFN 1986，rhuIFN-2a， rhuIFN-2b； 1990，rhuIFN-1b；1993，rhuIFN-1b； 20012002： PEG化IFN，PEG-Intron, Pegasys 表達(dá)產(chǎn)物：無(wú)糖基化，N-met，無(wú)活性包涵體工藝特點(diǎn)：發(fā)酵過程，隨后變性、復(fù)性過程?；蚬こ檀竽c桿菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝基因工程大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝:v目的基因的分離目的基因的分離克隆載體克隆載體目的基因與克隆目的基因與克隆載體的體外重組載體的體外重組重組體導(dǎo)入大腸桿菌重組體導(dǎo)入大腸桿菌K12K12受體菌的培養(yǎng)及

4、篩選受體菌的培養(yǎng)及篩選從受體菌中獲取目的基因從受體菌中獲取目的基因表達(dá)載體表達(dá)載體重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌導(dǎo)入大腸桿菌受體菌的篩選，表達(dá)性、穩(wěn)定性等檢測(cè)受體菌的篩選，表達(dá)性、穩(wěn)定性等檢測(cè)工工程菌程菌 基因工程菌的制備一、目的基因的分離與擴(kuò)增v1. 破碎細(xì)胞，用Trizol法提取總的RNAv2. 將生產(chǎn)干擾素的人白細(xì)胞的mRNA分級(jí)分離然后進(jìn)行凝膠電泳切取目的基因片段v3. 用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄，把總mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNAv4. 以cDNA為模板、干擾素引物為引物，PCR，得到完全的干擾素基因的PCR產(chǎn)物v5.人工加尾形成“粘性末端”二、構(gòu)建重組質(zhì)粒v1. 提取載體（質(zhì)粒、病毒等），雙酶切

5、，再把干擾素基因的PCR產(chǎn)物用相應(yīng)的酶酶切，用連接酶連接E EcocoR IR IB BamamH IH IE EcocoR IR IB BamamH IH I 2.連接完成后分離純化，測(cè)序，與原干擾素序列比對(duì)。 3.鑒定序列無(wú)誤后，導(dǎo)入受體細(xì)胞，篩選三、重組體引入宿主細(xì)胞 將cDNA克隆到含有四環(huán)素、氨芐青霉素抗性基因的質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌，重組的載體 DNA 分子在一定條件下轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，形成攜帶質(zhì)粒的菌株。四、受體菌的篩選 由于質(zhì)粒重組時(shí)有3種基本方式，即：目的基因與克隆載體重組，目的基因片段與目的基因片段重組，克隆載體與克隆載體重組；另外重組過程可能會(huì)發(fā)生基因突變情況 五、分析保存

6、 對(duì)基因工程大腸桿菌進(jìn)行評(píng)價(jià)分析，并保存菌種。干擾素的發(fā)酵工藝過程啟開種子啟開種子 制備種子液制備種子液 發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng) 粗提粗提 精提精提 半成品制備半成品制備 半成品檢定半成品檢定 分裝分裝 凍干凍干 成品檢定成品檢定 成品包裝成品包裝v1 1菌種培養(yǎng)菌種培養(yǎng) 取70下保存的甘油管菌種（工作種子批），于室溫下融化。然后，接入搖瓶，培養(yǎng)溫度30，pH7.0，250 r/min活化培養(yǎng)182小時(shí)后，進(jìn)行吸光值測(cè)定和發(fā)酵液雜菌檢查。v2 2種子罐培養(yǎng)種子罐培養(yǎng) 將已活化的菌種接入裝有30L培養(yǎng)基的種子罐中，接種量10%，培養(yǎng)溫度30，pH7.0，級(jí)聯(lián)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速，控制溶解氧為30%，培

7、養(yǎng)34小時(shí)，轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐中，同時(shí)取樣發(fā)酵液進(jìn)行顯微鏡檢查和LB培養(yǎng)基劃線檢查，控制雜菌 v3.3.發(fā)酵罐培養(yǎng)發(fā)酵罐培養(yǎng) 將種子液通入300L培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，接種量10%，培養(yǎng)溫度30，pH7.0。級(jí)聯(lián)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速，控制溶解氧30%，培養(yǎng)4小時(shí)。然后控制培養(yǎng)溫度20，pH6.0，溶解氧60%，繼續(xù)培養(yǎng)56.5小時(shí)。同時(shí)進(jìn)行發(fā)酵液雜菌檢查，當(dāng)OD值達(dá)9.01.0后，用5冷卻水快速降溫至15以下，以減緩細(xì)胞衰老。或者將發(fā)酵液轉(zhuǎn)入收集罐中，加入冰塊使溫度迅速降至10以下。v4. 4. 菌體收集菌體收集 將已降溫的發(fā)酵液轉(zhuǎn)入連續(xù)流離心機(jī)，16000 r/min離心收集。進(jìn)行干擾素含量、菌體蛋白含

8、量、菌體干燥失重、質(zhì)粒結(jié)構(gòu)一致性、質(zhì)粒穩(wěn)定性等項(xiàng)目的檢測(cè)。菌體于20冰柜中保存時(shí)，不得超過12個(gè)月。每保存3個(gè)月，檢查一次活性。3. 干擾素的分離純化工藝過程干擾素的分離純化工藝過程 3.1、干擾素分離工藝過程 3.2、干擾素的純化工藝過程3.1 干擾素分離工藝過程v菌體裂解v預(yù)處理v初級(jí)分離(1)菌體裂解菌體裂解v裂解緩沖液：純化水配制，210（pH7.5）v使用保護(hù)劑：EDTA，PMSF。v破碎菌體：2厘米以下的碎塊v攪拌：加裂解緩沖液，210，2hrv凍融: 細(xì)胞完全破裂，釋放干擾素。(2)預(yù)處理預(yù)處理-沉淀沉淀v加絮凝劑聚乙烯亞胺: 210，攪拌45min，對(duì)菌體碎片進(jìn)行絮凝。v加凝聚

9、劑醋酸鈣溶液: 210,攪拌15min，對(duì)菌體碎片、DNA等進(jìn)行沉淀。(3)離心離心v連續(xù)流離心機(jī)：210，16000 r/minv收集上清液：含有重組干擾素蛋白質(zhì)v雜質(zhì)沉淀：121、30min 蒸汽滅菌,焚燒處理。（4）初級(jí)分離）初級(jí)分離v鹽析: 硫酸銨，210，攪勻,靜置過夜。v離心：連續(xù)流離心機(jī)，16000 r/minv保存：收集沉淀，粗干擾素，4保存。3. 2、干擾素純化工藝過程v溶解粗干擾素v沉淀與疏水層析 陰離子交換層析與濃縮 陽(yáng)離子交換層析與濃縮 凝膠過濾層析v無(wú)菌過濾分裝(1) 溶解粗干擾素溶解粗干擾素v配制純化緩沖液： 超純水，pH7.5磷酸緩沖液，0.45 m濾器和10 k

10、u超濾系統(tǒng)，百級(jí)層流下收集。冷卻至210。v檢查: 緩沖液的pH值和電導(dǎo)值。v溶解：210，勻漿，完全溶解。(2) 沉淀與疏水層析沉淀與疏水層析v等電點(diǎn)沉淀（1）：磷酸調(diào)節(jié)至pH5.0，沉淀雜蛋白，離心收集上清液。v疏水層析：干擾素吸附在疏水層析柱中 除非疏水性蛋白 洗脫與收集：0.01M磷酸緩沖液（pH8.0）v等電點(diǎn)沉淀（2）：磷酸調(diào)節(jié)pH4.5，調(diào)節(jié)電導(dǎo)值40 ms/cm，210，靜置過夜v超濾：1000 ku超濾膜過濾，除去大蛋白。v透析除鹽：調(diào)整溶液pH 8.0，電導(dǎo)值，10 ku超濾膜，0.005 M緩沖液。(3)無(wú)菌過濾分裝無(wú)菌過濾分裝0.22 m濾膜過濾干擾素溶液v分裝v20以

11、下的冰箱中保存。(4)檢測(cè)項(xiàng)目檢測(cè)項(xiàng)目v干擾素鑒別試驗(yàn)v干擾素效價(jià)測(cè)定v蛋白質(zhì)含量，純度測(cè)定，分子量v宿主殘余蛋白、殘余DNAv干擾素結(jié)構(gòu)鑒定：紫外光譜，肽譜，N端序列v其他：熱原，內(nèi)毒素，殘留抗生素半成品檢定v（1）效價(jià)測(cè)定效價(jià)測(cè)定 用細(xì)胞病變抑制法，以Wish細(xì)胞、VSV病毒為基本檢測(cè)系統(tǒng)，測(cè)定中必須用國(guó)家或國(guó)際參考品校準(zhǔn)為國(guó)際單位。v（2）蛋白質(zhì)含量測(cè)定蛋白質(zhì)含量測(cè)定v 福林-酚法，以中國(guó)藥品生物制品檢定所提供的標(biāo)準(zhǔn)蛋白為標(biāo)準(zhǔn)。v（3）比活性比活性v 效價(jià)的國(guó)際單位與蛋白質(zhì)含量的毫克數(shù)之比。v（4）純度純度v 電泳純度用非還原型SDS-PAGE法，銀染顯色應(yīng)為單一區(qū)帶，經(jīng)掃描儀測(cè)定純度應(yīng)

12、在95%以上。v（5 5）相對(duì)分子量測(cè)定）相對(duì)分子量測(cè)定v 還原型SDS-PAGE，加樣量不地域微克，同時(shí)用已知相對(duì)分子量的蛋白標(biāo)準(zhǔn)系列做對(duì)照，以遷移率為橫坐標(biāo)，相對(duì)分子量的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)作圖，計(jì)算相對(duì)分子量。與理論值比較，誤差不得高于10%。v（6 6）殘余外源性）殘余外源性DNADNA含量測(cè)定含量測(cè)定v 用放射性核素或生物素探針法測(cè)定，每劑量中殘余外源性DNA應(yīng)低于100pg。v（7 7）殘余血清）殘余血清IgGIgG含量測(cè)定含量測(cè)定v 在應(yīng)用抗體親和層析法作為純化方法時(shí)必須進(jìn)行此項(xiàng)檢定。v（8 8）殘余抗生素活性測(cè)定）殘余抗生素活性測(cè)定v 半成品中不應(yīng)有抗生素活性存在。v（9）紫外光譜掃描

13、紫外光譜掃描v 檢查半成品的光譜吸收值，最大吸收值應(yīng)在2802納米。v（10）肽圖測(cè)定肽圖測(cè)定v 用CNBr裂解法，測(cè)定結(jié)果應(yīng)符合干擾素的結(jié)構(gòu)，且批與批之間應(yīng)一致。v（11）等電點(diǎn)測(cè)定等電點(diǎn)測(cè)定 等電聚焦電泳。v（12）除菌半成品應(yīng)做干擾素效價(jià)測(cè)定、無(wú)菌試驗(yàn)和熱源質(zhì)除菌半成品應(yīng)做干擾素效價(jià)測(cè)定、無(wú)菌試驗(yàn)和熱源質(zhì)試驗(yàn)。試驗(yàn)。成品檢定v（1）物理性狀物理性狀v 凍干品白色或微黃色疏松體，加入注射水后不得含有肉眼可見不溶物。v（2）鑒別試驗(yàn)鑒別試驗(yàn)v 應(yīng)用ELISA或中和試驗(yàn)檢定。v（3）水分測(cè)定水分測(cè)定v 用卡氏法，應(yīng)低于3%。v（4）無(wú)菌試驗(yàn)無(wú)菌試驗(yàn)v 同半成品。v（5）熱原質(zhì)試驗(yàn)熱原質(zhì)試驗(yàn)v 同半成品檢定。v v（6）干擾素效價(jià)測(cè)定干擾素效價(jià)測(cè)定v 同半成品檢定，效價(jià)不應(yīng)低于標(biāo)示量。v（7）安全試驗(yàn)安全試驗(yàn)v 取體重為350-400克豚鼠3只，每只腹側(cè)皮下注射量為成人每千克體重臨床使用最大量的3倍，觀察7天，若豚鼠局部無(wú)紅腫、壞死、總體重不下降，說明成品合格。 取體重18-20克小鼠5只，每只尾靜脈注射劑量按人每千克體重臨床使用最大量的3倍，觀察7天，若動(dòng)物