嗅黏膜嗅鞘細胞的實驗研究概述

1、嗅黏膜嗅鞘細胞的實驗研究概述【關鍵詞】嗅鞘細胞嗅鞘細胞(lfatryensheathingells,Es)在功能上是介于施萬細胞和少突膠質細胞之間的一種特殊的膠質細胞,具有神經(jīng)營養(yǎng)、抑制膠質增生、瘢痕形成、成鞘作用等，為軸突生長提供了適宜的微環(huán)境及較強的遷移的特性，使其成為促進中樞神經(jīng)再生的理想候選細胞之一。嗅鞘細胞同膠質細胞、施萬細胞在表現(xiàn)型上有共同點，它們都能促進軸突的再生，主要區(qū)別在于嗅鞘細胞不但存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，也存在于外周神經(jīng)中。嗅黏膜中的神經(jīng)元是唯一的生后才生長并在成年時繼續(xù)分化的神經(jīng)元，壽為412周，隨著新細胞的生長，又建立了新的神經(jīng)支配關系。嗅鞘細胞存在于嗅神經(jīng)及嗅球的神經(jīng)層

2、上，沿嗅神經(jīng)的全長，從周圍神經(jīng)系統(tǒng)到中樞神經(jīng)分布。成年哺乳類嗅黏膜中的嗅覺神經(jīng)元具有終生更新的特點,由此說明嗅黏膜中存在神經(jīng)干細胞。嗅黏膜由源于外胚層的嗅板及位于其底部的間充質發(fā)育、分化而來,由上皮和固有層組成。上皮內的嗅細胞是初級嗅覺神經(jīng)元,成體嗅黏膜內的嗅細胞終生處于不斷凋亡、更新之中,新生嗅細胞的軸突進入固有層由嗅鞘細胞包繞形成嗅神經(jīng),經(jīng)篩孔進入嗅球與僧帽細胞形成突觸,在軸突的生長和突觸的重建過程中,嗅鞘細胞具有重要的誘導作用13。1嗅鞘細胞的研究現(xiàn)狀嗅鞘細胞從被發(fā)現(xiàn)到體外培養(yǎng)成功,再到可以用于動物實驗研究及應用于臨床研究,經(jīng)歷了漫長的時間。Devn和Duete4于1992年首次證實嗅鞘

3、細胞可在體外培養(yǎng)條件下形成髓鞘。嗅鞘細胞移植治療脊髓損傷是近10年開展起來的。Li等5報道嗅鞘細胞移植到受損的成年大鼠皮質脊髓束可以促進軸突再生,脊髓功能得以改善。2000年Barnet6首次報道用術中切除的嗅球在體外培養(yǎng)并擴增人類嗅鞘細胞,并證明這些細胞生理功能良好,植入嚙齒動物脫髓鞘區(qū)域能髓鞘化軸突,且無致瘤性。近年從嗅黏膜中提娶純化培養(yǎng)嗅鞘細胞，以其獨特優(yōu)勢和臨床應用價值，越來越受到重視。2嗅鞘細胞的實驗取材方法成年SD大鼠體重250300g,腹腔麻醉后,消毒面部皮膚。經(jīng)一側鼻孔沿鼻腔向上至內眥部剪開皮膚及鼻骨,暴露鼻中隔黏膜,用虹膜槍和眼科剪別離、剪取鼻中隔后三分之一嗅黏膜?？梢姳侵懈?/p>

4、最后上部的嗅區(qū),呈黃色與呼吸道黏膜有較明顯的區(qū)別。將此嗅區(qū)鼻中隔(嗅黏膜和骨質)完好取下,在顯微鏡下將兩側的嗅黏膜自骨片上完好刮下,立即放入冰的DE抗生素液中(青霉素和鏈霉素各100IU/L)。有學者從后鼻孔和直接開顱進入鼻中隔，別離嗅黏膜。3嗅黏膜細胞的體外培養(yǎng)嗅黏膜取出后用F12培養(yǎng)基漂洗3次去除血跡后移至0.25%胰酶中,用眼科剪充分剪碎并用吸管吹打,制成嗅黏膜混合細胞懸液,用培養(yǎng)基終止消化,離心、清洗去除胰酶，用含10%胎牛血清的F12培養(yǎng)基將細胞濃度調至1106/l,接種于無包被的玻璃培養(yǎng)皿,置2培養(yǎng)箱內(37,5%2)培養(yǎng)。每23天換液一次。當將離體嗅黏膜制成細胞懸液后,細胞之間的

5、平衡即被打破,接觸抑制及反響調節(jié)機制亦被解除。細胞懸液中的神經(jīng)干細胞在其他細胞分泌的細胞因子和細胞外基質的作用下,將進入細胞分裂、增殖周期。整個培養(yǎng)過程,更換培養(yǎng)液也非常關鍵。嗅黏膜Es貼壁生長時間較晚,一般在培養(yǎng)第56天才開場,不像嗅球Es24h后就大量貼壁生長。所以在這段時間內換液應非常小心,盡量不要晃動培養(yǎng)液,以保持細胞沉淀,根據(jù)情況最好行1/3量換液或根據(jù)培養(yǎng)液的顏色添加培養(yǎng)液,以免喪失細胞。純化：按改進Nash差速貼壁法在培養(yǎng)3648h后,將培養(yǎng)液吸出,重新種植于包被多聚右旋賴氨酸的24孔細胞培養(yǎng)板內,進展純化培養(yǎng)。純化培養(yǎng)液中可參加20l/L的Frsklin和20g/l的BPE(b

6、vinepituitaryextrat)以促進細胞的生長培養(yǎng)14天,其間觀察細胞生長情況,間或攝片。成纖維細胞的生長可機械刮除亦可用5l/LAra處理24h來控制。Ara對ES的生長也有抑制作用，故有學者也不主張使用。是否純化的觀點：有局部學者認為根據(jù)嗅黏膜細胞的社會學特性,即各種細胞之間存在著互相依存、互相誘導、互相制約的調節(jié)機制。嗅黏膜神經(jīng)干細胞和嗅鞘細胞體外培養(yǎng)時,不宜過早地純化細胞,混合細胞培養(yǎng)更有利于各細胞成分的分裂、增殖尤其是有利于神經(jīng)干細胞克隆球的形成。Shu等7將嗅上皮細胞與其基內幕胞共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),后者能促進神經(jīng)前體細胞的增生,其實驗結果從另一側面證明了上述觀點。4嗅黏膜細胞的免

7、疫細胞化學染色目前常用的染色方法主要有：Nestin染色、NSE染色、GFAP及p75NGFR染色等，體外培養(yǎng)的時間不同，免疫反響陽性細胞形態(tài)亦不一樣，成熟的嗅鞘細胞大多為梭形雙極細胞,突起細長,其走向具有明顯的方向性,細胞排列成束。5原代培養(yǎng)嗅黏膜細胞的生長特點嗅黏膜細胞接種于培養(yǎng)皿24h內除少數(shù)球形細胞懸浮外,大局部細胞已貼壁,貼壁細胞多呈扁平多邊形,單層片狀生長。此后可見散在的球形細胞粘附于扁平細胞外表并分裂增殖,逐漸形成克隆球。于培養(yǎng)早期可見少數(shù)克隆球首先懸浮生長,幾天后貼壁生長并逐漸分化?？寺∏蛴?周內生長較快,隨著球體增大其生長逐漸變慢,2周后直徑至1左右,球體不再生長,自克隆球周

8、邊有球形細胞向外遷移,遷移出的細胞大多最終分化成梭形的嗅鞘樣細胞,細胞排列方向性較為一致;少數(shù)分化成嗅細胞樣細胞,胞體為卵圓形具有兩根突起。突起一根細長,多貼附于梭形細胞上,另一根較粗短,頂端隱約可見嗅毛。形態(tài)多為雙極或三級。改進差速貼壁法細胞生長特點：一般細胞培養(yǎng)78天后,增殖最快,數(shù)量明顯增多,細胞成分以梭形(雙極)和多突起的大細胞為主,常呈成團生長,但聯(lián)絡松散,生長缺少方向性。據(jù)報道8這些梭形和雙極細胞主要是Es和嗅神經(jīng)元,有局部窩形細胞屬上皮細胞,大細胞可能是未分化的神經(jīng)膠質細胞。培養(yǎng)至14天以后的細胞,形態(tài)沒有大的變化,主要為雙極和梭形細胞,但數(shù)量往往開場減少，雜細胞占優(yōu)勢。Frsk

9、lin和BPE的應用可以大大促進細胞的生長。雜細胞主要是成纖維細胞,也有明顯生長,需應用Ara進展純化，或者采用機械刮除。改進差速貼壁法，培養(yǎng)至14天的Es免疫組化染色結果說明,大局部雙極或梭形細胞呈GFAP或p75NGFR免疫反響陽性。6同其他干細胞的比擬干細胞移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病已經(jīng)有了較大進展,但是目前還存在一些問題有待解決:1神經(jīng)干細胞的分化取決于神經(jīng)營養(yǎng)和生長因子、細胞因子、細胞外基質分子、細胞黏附分子、細胞-細胞接觸和神經(jīng)變性等的作用。干細胞有可能使受損的腦組織建立神經(jīng)連接,但原發(fā)和繼發(fā)的損傷事件如中性粒細胞和巨噬細胞侵入、神經(jīng)元和膠質細胞死亡將影響移植的干細胞的分化;2雖然干

10、細胞具有低免疫原性的特點,但仍存在異體移植排擠;3不管是在體外培養(yǎng)條件下還是體內環(huán)境下神經(jīng)干細胞都會有很大一局部分化成星形膠質細胞,形成星形膠質的瘢痕,使干細胞分裂、分化和遷移、并形成有功能的正常神經(jīng)元網(wǎng)絡是非常困難的。骨髓間質干細胞是具有多分化潛能的細胞,可分化為間質組織,在特定的條件下可分化為神經(jīng)細胞、肝細胞、心肌細胞等非來源組織的細胞,具有類似胚胎細胞的多能性911,且取材方便,因此作為組織工程“種子細胞有廣泛的應用前景1215，自體移植可以防止排擠反響，但誘導分化有一定困難。臍血干細胞也是一種具有多向分化潛能的原始干細胞，但存在異體移植的倫理道德，及誘導分化的技術困難問題。嗅黏膜嗅鞘細

11、胞移植具有以下的優(yōu)點：1移植物來源方便、損傷小，通過活檢方法即能獲得所需的移植物，且并不影響嗅覺，(2)防止了異體移植所帶來的技術與道德問題。但是其純化培養(yǎng)的方法尚不成熟，需要進一步研究。嗅黏膜嗅鞘細胞以其獨特的優(yōu)勢成為細胞移植領域研究的一個熱點，是一種具有臨床應用價值的、非常具有潛力的移植物。但其培養(yǎng)純化技術仍不非常成熟，需要相關研究人員共同努力，使之更加完善，以造福更多患者?！緟⒖嘉墨I】1NibuK.Intrdutintlfatryneurepitheliu.irsResTeh,2002，58:133-134.2ShbJE.Neuralregeneratinandtheperipheral

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