《 胚胎工程第二節(jié) 胚胎工程課件》高中生物浙科版選修3 現(xiàn)代生物科技專(zhuān)題1146

1、胚胎工程的主要技術(shù)與應(yīng)用胚胎工程胚胎工程指對(duì)動(dòng)物早期胚胎或配子所進(jìn)行的多種顯微操作和處理技術(shù)。研究對(duì)象：主要限定于高等脊椎動(dòng)物，特別是哺乳動(dòng)物。研究?jī)?nèi)容：體外受精、胚胎體外培養(yǎng)、胚胎移植、胚胎分割、胚胎干細(xì)胞等。理論基礎(chǔ)：哺乳動(dòng)物的受精卵和早期胚胎的發(fā)育規(guī)律一、體外受精技術(shù)超數(shù)排卵超數(shù)排卵：得到較正常情況下更多的成熟的卵母細(xì)胞活體取卵：一般要經(jīng)過(guò)體外成熟培養(yǎng)才能受精屠宰后母畜卵巢上取卵：需經(jīng)成熟培養(yǎng)（二）胚胎移植技術(shù)1.概念:將發(fā)育的早期胚胎分別移植到同期發(fā)情的代孕母的子宮內(nèi)，通過(guò)代孕母妊娠產(chǎn)仔的技術(shù)。供體：提供胚胎的個(gè)體。受體(代孕母）：接受胚胎的個(gè)體。由于無(wú)法進(jìn)行全體外胚胎培養(yǎng)，目前，胚胎

2、移植成為胚胎工程中獲得后代的唯一方法。選擇供體母牛受體母牛同期發(fā)情處理超數(shù)排卵供體公牛配種沖卵質(zhì)量檢查、培養(yǎng)胚胎移植妊娠檢查分娩（胚胎移植的犢牛）2.胚胎移植的基本程序3.胚胎移植成功與否要有兩個(gè)條件（1）胚胎移植一般在同種的供體和受體之間進(jìn)行。（2）進(jìn)行胚胎移植的供體和受體的生理狀態(tài)要相同。4.胚胎移植的生理學(xué)基礎(chǔ)1)供體和受體相同的生理環(huán)境2)早期胚胎處于游離狀態(tài),為胚胎的收集提供了可能3)受體對(duì)移入子宮的胚胎基本上不發(fā)生免疫排斥4)胚胎與受體建立正常的聯(lián)系,但遺傳物質(zhì)沒(méi)有改變.（三）胚胎分割技術(shù)（Embryo bisection）1.概念:借助顯微操作技術(shù)或徒手操作方法切割早期胚胎成二、

3、四等多等份再移植給受體母畜，從而獲得同卵雙胎或多胎的生物學(xué)新技術(shù)。來(lái)自同一胚胎的后代有相同的遺傳物質(zhì)，因此 胚胎分割可看成動(dòng)物無(wú)性繁殖或克隆的方法之一。2.特點(diǎn):后代具有相同的遺傳物質(zhì)，胚胎克隆.3.選擇的胚胎:發(fā)育良好的,形態(tài)正常的卵裂球、桑椹胚或囊胚。4.使用的主要儀器：實(shí)體顯微鏡和顯微操作儀注意：對(duì)囊胚階段的胚胎進(jìn)行分割時(shí)，要將內(nèi)細(xì)胞團(tuán)均等分割。原因：內(nèi)細(xì)胞團(tuán)一般到囊胚階段才出現(xiàn)，它是發(fā)育為胚胎本身的基礎(chǔ)細(xì)胞，其他細(xì)胞為滋養(yǎng)細(xì)胞，只為胚胎和胎兒發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)。若分割時(shí)不能將內(nèi)細(xì)胞團(tuán)均等分割，會(huì)出現(xiàn)含內(nèi)細(xì)胞團(tuán)多的部分正常發(fā)育的能力強(qiáng)，少的部分發(fā)育受阻或發(fā)育不良，甚至不能發(fā)育等問(wèn)題。胚胎分割技

4、術(shù)也是動(dòng)物克隆的方法之一 。胚胎分割的份數(shù)越多，操作的難度會(huì)越大，移植的成功率也越低。原因：早期胚胎的體積很小，只有在顯微鏡下才能看到；再者，細(xì)胞數(shù)目是有限的。分割的份數(shù)越多，不但難以做到均等分割，每一份的細(xì)胞數(shù)會(huì)越少，而且作為囊胚期的胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞所受的影響會(huì)更大。因此，分割的份數(shù)越多，技術(shù)的難度會(huì)越大，移植后的恢復(fù)和發(fā)育的難度會(huì)越大，移植成功率自然會(huì)降低。 胚胎分割移植的顯微操作（四）胚胎干細(xì)胞核移植技術(shù)核供體：干細(xì)胞核 胚胎細(xì)胞核 體細(xì)胞核核受體：去核的卵母細(xì)胞 受精卵 2-細(xì)胞胚胎胚胎干細(xì)胞核移植胚胎分割胚胎體外培養(yǎng)胚胎移植體外受精基因敲除（gene knock out）基因敲除是指

5、對(duì)一個(gè)結(jié)構(gòu)已知但功能未知的基因，從分子水平上設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，將該基因去除，或用其它順序相近基因取代，然后從整體觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，推測(cè)相應(yīng)基因的功能。這與早期生理學(xué)研究中常用的切除部分-觀察整體-推測(cè)功能的三部曲思想相似。 嵌合體具有來(lái)自?xún)蓚€(gè)或多個(gè)合子體細(xì)胞的個(gè)體將ES細(xì)胞通過(guò)顯微操作注射到囊胚期胚胎的囊胚腔內(nèi)，形成嵌合體。囊胚及原腸胚在結(jié)構(gòu)上的主要區(qū)別？用來(lái)進(jìn)行體外受精的精子和卵細(xì)胞必須滿(mǎn)足什么條件？體內(nèi)正常受精時(shí)，精子有獲能現(xiàn)象嗎？要獲得更多的卵細(xì)胞，一般采用什么方法？受精卵能直接進(jìn)行胚胎移植嗎？試管動(dòng)物是在試管里培育成功的嗎？試管動(dòng)物是有性生殖還是無(wú)性生殖的產(chǎn)物？超數(shù)排卵用什么激素？同期發(fā)情用什么激

6、素？什么時(shí)期的胚胎可進(jìn)行胚胎移植？移植到代孕母的什么部位？代孕母接受胚胎前要進(jìn)行什么處理？什么時(shí)期的胚胎可用于胚胎分割？通過(guò)胚胎分割培育后代屬于有性繁殖還是無(wú)性繁殖？對(duì)囊胚期胚胎進(jìn)行分割時(shí)要注意什么問(wèn)題？如果用酶處理法分割胚胎，一般用什么酶？?jī)?nèi)細(xì)胞團(tuán)的細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞，對(duì)嗎？只有內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞，對(duì)嗎？胚胎干細(xì)胞具有什么特點(diǎn)？為什么在進(jìn)行胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)要用到胚胎成纖維細(xì)胞？胚胎干細(xì)胞核移植技術(shù)的操作流程？胚胎干細(xì)胞核移植過(guò)程中哪些階段體現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)（分裂）、哪些階段體現(xiàn)細(xì)胞的分化？教材上在講體外受精、胚胎分割、胚胎干細(xì)胞核移植時(shí)都提到了什么技術(shù)？1.體外受精后形成的受精卵不需經(jīng)早期發(fā)

7、育培養(yǎng)，可直接完成植入或著床（）2.試管動(dòng)物與胚胎移植的最主要不同是：試管動(dòng)物從供體獲得精子和卵細(xì)胞經(jīng)過(guò)成熟培養(yǎng)，在體外人工條件下受精，并經(jīng)過(guò)一段早期發(fā)育，再將胚胎移植到受體子宮內(nèi)。（）3.胚胎分割是指借助顯微操作技術(shù)將早期胚胎切割成二等份，再移植到代孕母子宮中發(fā)育，產(chǎn)生同卵雙生后代的技術(shù)。（） 4下列關(guān)于胚胎工程的敘述，正確的是 A卵裂球中的細(xì)胞能直接用于胚胎移植 B精子在體外獲能與否主要取決于培養(yǎng)時(shí) 間的長(zhǎng)短 C分割后的胚胎不能在體外培養(yǎng)而應(yīng)立即 進(jìn)行移植 D供體中取出的早期胚胎可直接移植到不 同期發(fā)情的受體中1.下列有關(guān)動(dòng)物胚胎移植的敘述中，錯(cuò)誤的是（ ）A.受孕母畜體內(nèi)的受精卵或胚胎均

8、能移植B.受體母畜必須處于與供體母畜同步發(fā)情的狀態(tài)C.超數(shù)排卵技術(shù)要使用一定的激素D.試管嬰兒只是受精及早期胚胎發(fā)育過(guò)程在試管中進(jìn)行2.下列對(duì)于優(yōu)良種畜的胚胎移植的說(shuō)法不正確的是 （ ）A.供體母牛必須是同一物種的良種B.受體母牛必須是同一物種的良種C.供體公牛必須是同一物種的良種D.受體母?？梢允峭晃锓N的一般健康牛4.利用胚胎干細(xì)胞治療肝衰竭，實(shí)現(xiàn)此過(guò)程的重要原因是（ ）A.細(xì)胞分裂B.細(xì)胞特化C.細(xì)胞分化D.細(xì)胞增殖C三.胚胎干細(xì)胞1.概念:簡(jiǎn)稱(chēng)ES或EK細(xì)胞,是由早期胚胎或原始性腺中分離出來(lái)的一類(lèi)細(xì)胞.2.特點(diǎn):1)形態(tài):體積小.細(xì)胞核大,核仁明顯.2)功能:具有發(fā)育的全能性.可分化為

9、成年動(dòng)物體內(nèi)任何一種組織細(xì)胞.體外培養(yǎng)可增殖不分化.3）在體外培養(yǎng)的條件下，ES細(xì)胞可以增殖而不發(fā)生分化。對(duì)它可以進(jìn)行冷凍保存，也可以進(jìn)行遺傳改造。3.主要用途(1)治療人類(lèi)的某些頑癥(2)培育出人造組織器官，用于器官移植(3)是研究體外細(xì)胞分化的理想材料觀點(diǎn)理由1.不符合倫理道德(1)把試管嬰兒當(dāng)作人體零配件工廠,是對(duì)生命的不尊敬;(2)早期的生命也有活下去的權(quán)利,拋棄或殺死多余的胚胎,無(wú)異于”謀殺”;(3)有人會(huì)濫用設(shè)計(jì)試管嬰兒技術(shù),而設(shè)計(jì)嬰兒性別;2.符合倫理道德(1)設(shè)計(jì)試管嬰兒是為了救人,是救治患者的最好,最快捷的辦法之一;(2)提供骨髓中造血干細(xì)胞并不會(huì)對(duì)試管嬰兒造成損傷;(3)臍

10、帶血乃試管嬰兒的”身外之物”.3.中國(guó)政府的觀點(diǎn)中國(guó)衛(wèi)生部在體外受精-胚胎移植及其衍生技術(shù)規(guī)范中規(guī)定,”實(shí)施體外受精-胚胎移植及其衍生技術(shù)必須獲得衛(wèi)生部批準(zhǔn)證書(shū)”.7.2配子操作7.21精子 7.22卵母細(xì)胞 7.23體外受精精子的獲得精液的采取方法通常有：人工陰道法、電刺激法、陰道內(nèi)回收法等。 對(duì)于個(gè)體較大的動(dòng)物多采用人工陰道法，而對(duì)于小動(dòng)物而言多采用電刺激法采精。人工陰道法人工陰道法是由橡膠制造的雙層圓筒，兩層之間充以溫水（3840），后端有精液收集管以軟橡膠膜袋與人工陰道相連。對(duì)于公牛而言，一般多應(yīng)用臺(tái)畜使爬上，將假陰道自側(cè)面套在公牛陰莖上，使其射精。在公豬可以用豬用假陰道收集精液或用手

11、握法采精，但仍需要臺(tái)畜，使其爬上以便進(jìn)行操作。 另外，也可以用特制的電極，插到公畜的直腸內(nèi)，根據(jù)不同畜種給予不同的電流刺激，經(jīng)過(guò)不同的時(shí)間，即可射精而得到精液。精液的保存精液的保存可以分為常溫（1525）、低溫（05）和超低溫冷凍（79-196）三種，其目的是要降低精子的代謝活動(dòng)，延長(zhǎng)其存活時(shí)間，盡量保存其受精能力。 三種保存方法常溫保存主要通過(guò)降低pH值達(dá)到抑制精子的代謝活動(dòng)，一般可以保存2天以上。 低溫保存主要是抑制其正常的代謝活動(dòng)，除豬外，其它家畜的保存效果均較好。 如果應(yīng)用超低溫可以在液氮中長(zhǎng)期保存精液，用時(shí)可以即時(shí)解凍。 對(duì)于不同的動(dòng)物，各種保存液的配制方法都有所差異的。人為使得精子

12、獲能可以利用自然交配法，即在交配后，由雌性生殖道回收精子。 而雌性生殖道獲能沒(méi)有種屬特異性，因而可以由屠宰場(chǎng)取任何的動(dòng)物的子宮或在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)取小動(dòng)物的子宮給所需動(dòng)物的精子獲能。 另外，可以利用人工配制的培養(yǎng)液使得精子獲能卵母細(xì)胞人工采卵是得到卵母細(xì)胞的方法通常利用激素進(jìn)行誘導(dǎo)采卵或超數(shù)采卵?？梢岳么傩韵偌に鼗螯S體激素釋放激素（LHRH），對(duì)小鼠、大鼠和兔子等動(dòng)物進(jìn)行一次性投與誘發(fā)其排卵，排卵數(shù)目不變。 以小鼠為例，通常可用35IU PMSG或23IU hCG或100g FSH 或100gLH或0.020.05g LHRH皮下或腹腔內(nèi)注射，1214小時(shí)可以有70100正常排卵。超數(shù)排卵如果一次要

13、獲得多個(gè)卵，可以利用促性腺激素處理，使得卵巢中有更多的卵泡發(fā)育，更多的卵被排出，這個(gè)過(guò)程就稱(chēng)為超數(shù)排卵（superovulation） 如在小鼠期涂片相時(shí)注射510IU PMSG，4850小時(shí)后，再于皮下或腹腔注射510 IU hCG，這種方法可以獲得超數(shù)排卵。 人的人工采卵和超數(shù)排卵，要在月經(jīng)期59天，每天給予100150mg 克羅米酚，11天或12天用B型超聲檢測(cè)卵巢表面的卵泡直徑達(dá)到20mm時(shí)，再給予40009000 IU hCG，3240小時(shí)后取卵。采卵輸卵管內(nèi)采卵：以鼠為例，一般為了防止干燥可將屠殺后取出的輸卵管放在平皿內(nèi)，用石蠟油覆蓋，在實(shí)體顯微鏡下找到輸卵管膨大不，用磨尖的鐘表鑷

14、子，切開(kāi)輸卵管膨大部，使內(nèi)容物溢出而找到卵。 對(duì)于稍大一些的動(dòng)物可以用活體輸卵管采卵，例如將兔子的腹部正中線(xiàn)切開(kāi)，找出子宮角和輸卵管。然后利用逆向沖卵法，自子宮輸卵管連接處插入注射針，傘部以平皿接著沖洗；或在子宮輸卵管連接處下1cm處，剪成V形小口，插入塑料細(xì)管，自傘部輸卵管腹腔口插入，將液體推入，得到?jīng)_出的卵。采卵3. 對(duì)于屠宰場(chǎng)中的大中型動(dòng)物，可以用注射器插入卵泡中抽取，或在手術(shù)后暴露卵巢，以注射器自卵泡中取卵。 4. 對(duì)人而言通常在超數(shù)排卵步驟處理后，用B超檢測(cè)卵巢表面卵泡發(fā)育情況，然后，在腹腔后部體壁進(jìn)行局部麻醉，將腹腔鏡望遠(yuǎn)鏡插管插入，以觀察卵巢表面卵泡成熟情況，然后用套有聚四氟乙烯

15、套管的吸卵針將卵吸出，放平皿中檢查。卵母細(xì)胞一般檢測(cè)得到卵母細(xì)胞后，可根據(jù)卵泡發(fā)育的不同時(shí)期，在顯微鏡下檢查核和胞質(zhì)發(fā)育的狀況，如核的形態(tài)、位置和所處的時(shí)期。 排出的卵母細(xì)胞，有多層卵丘細(xì)胞包圍，除去卵丘細(xì)胞后，可以見(jiàn)到卵周隙增大，內(nèi)有第一極體，核處于第二次成熟分裂中期。 多數(shù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的卵母細(xì)胞胞質(zhì)呈透明狀，但由于胞質(zhì)中富含大量脂滴和空泡，所以在鏡下呈暗色。 各種不同的動(dòng)物，按照不同的分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)，卵的分類(lèi)可以分為優(yōu)秀、普通、不良和異常卵。 進(jìn)行體外受精的卵母細(xì)胞，一般以卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體外面完整地包有34層卵丘細(xì)胞，卵母細(xì)胞胞質(zhì)無(wú)斑塊者為佳。鏡檢卵母細(xì)胞如果新鮮或固定后要作整體觀察，可以取凡士林

16、石蠟（1：1）融化后滴于載片中部四角，在鏡下用微吸管自平皿中吸取卵母細(xì)胞，滴到4滴凡士林石蠟滴的中央，蓋上蓋片并輕壓之，即可置于相差顯微鏡下觀察。 如果要觀察細(xì)節(jié)，需要染色、切片后觀察。一般在卵固定后水洗染色，用瓊脂與石蠟進(jìn)行雙重包埋，最后進(jìn)行切片、脫臘和封固，進(jìn)行觀察。7.23體外受精體外受精（in vitro fertilization，IVF）就是將哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞從母體取出，在體外進(jìn)行精卵結(jié)合的過(guò)程。 主要包括：成熟或未成熟的卵母細(xì)胞獲得、體外培養(yǎng)系統(tǒng)的建立、處理附睪內(nèi)和射出精子、使精卵結(jié)合受精、受精卵的體內(nèi)或體外培養(yǎng)（in vitro culture，IVC）、移植妊娠和產(chǎn)仔 由于體

17、外受精在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，所以得到的動(dòng)物或人稱(chēng)為“試管動(dòng)物”或“試管嬰兒”。歷史1951年Chang和Austin發(fā)現(xiàn)了精子的獲能現(xiàn)象，為體外受精的實(shí)現(xiàn)打開(kāi)了通路。 1954年，Thibault等獲得第一只體外受精的兔子。隨著研究深入，試管老鼠、試管豬、試管牛等相繼產(chǎn)生。 1978年，Steptoe和Edwards制成了世界上的一例“試管嬰兒”，至此，體外受精技術(shù)逐漸成熟。過(guò)程獲得獲能的精子和成熟的卵母細(xì)胞后，應(yīng)在塑料平皿底部，用已經(jīng)處理獲能的精子浮游液5l精子浮游液，注入小滴中，將成熟培養(yǎng)后的卵母細(xì)胞，或自體內(nèi)手術(shù)沖出的卵母細(xì)胞，以BO液沖洗，用微吸管吸10個(gè)卵母細(xì)胞與少量BO液注入精子浮游液小滴

18、中。在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7小時(shí)后再經(jīng)微量吸管自小滴中用BO液多次沖洗以洗去多余的精子。然后移入發(fā)育培養(yǎng)液（TCM19910FCS）繼續(xù)培養(yǎng)。顯微操作協(xié)助受精在顯微操作儀下進(jìn)行顯微受精，即對(duì)哺乳動(dòng)物的精子和卵母細(xì)胞，進(jìn)行顯微操作，促使其相互結(jié)合技術(shù)，這可以解除透明帶和質(zhì)膜對(duì)精子的阻擋作用。 1976年，Uehara和Yanagimachi將倉(cāng)鼠或人的精子在顯微操作儀下，通過(guò)顯微工具，注射到倉(cāng)鼠卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，使精子核在卵胞質(zhì)中染色體解螺旋形成了原核。隨后，又深入研究了操作技術(shù)，分成了卵胞質(zhì)內(nèi)精子注射、透明帶下注射、透明帶鉆孔和透明帶部分切口等幾種。卵母細(xì)胞質(zhì)內(nèi)注射卵母細(xì)胞質(zhì)內(nèi)注射，是將整個(gè)精

19、子或精子頭部直接注射到卵母細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。要求注射針的尖端必須鋒利，注射吸管內(nèi)徑通常為510m，并盡量避免液體進(jìn)入卵胞質(zhì)。此方法可以使任何類(lèi)型的精子如精子頭形不正常、死精子或嚴(yán)重缺陷的精子等，可省去獲能和頂體反應(yīng)。 還可以將1個(gè)或多個(gè)精子注入透明帶下，可以一步直接將精子注射到卵周隙，也可以先將透明帶鉆孔或部分切口后，再進(jìn)行精子注射。使用的精子應(yīng)該是獲能和發(fā)生頂體反應(yīng)的。當(dāng)然，當(dāng)注射多個(gè)精子時(shí)可能發(fā)生多精受精現(xiàn)象。其它一些方法如果在透明帶上人為鉆孔后，可以為精子入卵提供機(jī)會(huì)，或者是易于精子入卵?？梢韵扔霉潭ㄎ芄潭ㄗ÷?，然后將吸滿(mǎn)酸性臺(tái)氏液（pH2.5）的微吸管沿卵外周切線(xiàn)方向往透明帶上射出穩(wěn)定的液流

20、。當(dāng)透明帶上溶出小孔后，即可撤走注射針。將卵洗滌后，再用適當(dāng)密度的精子進(jìn)行受精。 先用胰麋蛋白酶軟化透明帶，然后用纖細(xì)的針在透明帶上扎針孔，本法適用于精子運(yùn)動(dòng)乏力或少精癥不育患者的治療。通過(guò)該技術(shù)已經(jīng)使得小鼠獲得了超過(guò)30的妊娠或出生率，而且并沒(méi)有增加孤雌活化率和多精受精率。 另外，可以用微細(xì)玻璃針或金屬微刀片，在透明帶上切開(kāi)或挑開(kāi)或撕開(kāi)一個(gè)口，再經(jīng)適當(dāng)濃度精子受精。試管嬰兒的誕生按常規(guī)獲取精液，經(jīng)離心洗滌孵育使精子獲能，應(yīng)用PVP液限制精子活動(dòng)。 人的卵母細(xì)胞經(jīng)正常和超排取得，經(jīng)Ham F10或T6培養(yǎng)68小時(shí)，用透明質(zhì)酸酶除去卵丘細(xì)胞。 注射吸管外徑為2.5m，固定吸管外徑1520m，內(nèi)徑

21、為4.5m。在顯微操作儀下，用注射吸管自尾部將精子吸入16個(gè)。用固定吸管吸住卵，使極體在液滴“12”點(diǎn)鐘或“6”點(diǎn)鐘的位置。注射吸管自“3”點(diǎn)鐘位置刺入卵胞質(zhì)內(nèi)注入一或多個(gè)精子，其后輕微撤出注射吸管，將卵母細(xì)胞由固定吸管釋放下去。 注射完后，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)卵裂后，即可以移植。 一般只要卵子正常，精子的核正常而外形異常的都可以通過(guò)體外受精誕生試管嬰兒。體外受精的意義可以用來(lái)研究受精機(jī)理， 治療人類(lèi)男性和動(dòng)物的生殖不育， 可以利用體外受精卵的發(fā)育狀況或染色體核型檢測(cè)用來(lái)檢測(cè)形態(tài)不正常精子其染色體是否正常， 可以產(chǎn)生大量的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物， 還可以簡(jiǎn)化煩雜的凍精技術(shù)，或許只保存核物質(zhì)，就可以達(dá)到受精的目的，這對(duì)

22、保護(hù)珍貴的動(dòng)物資源，將起到重要的作用。 總之，體外受精技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于發(fā)育生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、畜產(chǎn)學(xué)、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域。7.3胚胎操作7.31胚胎培養(yǎng) 7.32胚胎移植 7.33胚胎保存 7.34胚胎分割 7.35胚胎嵌合胚胎收集胚胎培養(yǎng)之前，先從動(dòng)物子宮內(nèi)將胚胎收集 不同的動(dòng)物其收集方法是不一樣的。 以小鼠為例，一般用頸部脫臼法殺死小鼠，開(kāi)腹取出子宮和輸卵管并將其各部分離，分別放于37生理鹽水或M2BSA中，在實(shí)體顯微鏡下，用尖鐘表鑷子撕開(kāi)輸卵管，可以見(jiàn)到受精卵或卵裂胚胎，亦可以沖洗法將胚胎沖到平皿中。如沖洗囊胚，可用注射器針頭自子宮角的輸卵管端插入，推入0.20.5ml M2BSA液，將胚

23、胎沖到平皿中。 對(duì)于像牛等大型動(dòng)物而言，如果要取受精卵或早期卵裂胚，應(yīng)用手術(shù)方法沖洗輸卵管或?qū)⑴⑺廊〕鲚斅压軟_洗之。但6天后的胚胎，已經(jīng)移行到子宮角前部，可以用非手術(shù)的方法取之。7.31胚胎培養(yǎng)培養(yǎng)開(kāi)始之前，對(duì)實(shí)驗(yàn)室和所用的培養(yǎng)器具進(jìn)行徹底清洗、滅菌、清除可能的殘存的細(xì)胞毒性物質(zhì)。 培養(yǎng)液的組成，包括水、無(wú)機(jī)離子、有機(jī)成分、能源物質(zhì)、pH值、滲透壓等對(duì)胚胎發(fā)育均有很大影響。 現(xiàn)代培養(yǎng)液分為如Whitten氏液、Brinster液、BMOC3和CZB液等簡(jiǎn)單培養(yǎng)液和TCM199、CMRL 1066、Ham氏液和DMEM液等復(fù)雜培養(yǎng)液兩類(lèi)。培養(yǎng)方法即微滴培養(yǎng)法、輸卵管培養(yǎng)法和中間受體培養(yǎng)法。 微

24、滴培養(yǎng)法是利用塑料平皿制成50l培養(yǎng)液小滴數(shù)個(gè)，每滴加入一定數(shù)量胚胎，在上面覆以滅菌且平衡好的液體石蠟?；蛳葘⒁后w石蠟倒入平皿中，用注射器吸培養(yǎng)液和胚胎，垂直伸到平皿底部制成小滴。然后將培養(yǎng)皿放到5CO2、95空氣飽和濕度的37.5CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)所需要的時(shí)間。如果更換培養(yǎng)液，應(yīng)在實(shí)體顯微鏡下，用注射器或口控微吸管將培養(yǎng)液吸出，并加入新培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。 輸卵管培養(yǎng)法取發(fā)情動(dòng)物的輸卵管洗滌后，置于培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)液面超過(guò)輸卵管，將同種或異種動(dòng)物的胚胎自傘口注入輸卵管，進(jìn)行培養(yǎng)。 中間受體培養(yǎng)法是指，操作后的胚胎可將受精卵或早期胚胎移入同種或異種動(dòng)物的胚胎，該方法沒(méi)有種屬特異性，但為了在培養(yǎng)后容

25、易找到胚胎和對(duì)胚胎的保護(hù)，一般先用瓊脂包埋后再培養(yǎng)。 胚胎細(xì)胞計(jì)數(shù)法即空氣干燥法和熒光染色法。 空氣干燥法是將胚胎放入1檸檬酸鈉溶液中低滲1020分鐘，盡量少帶液體，將胚胎吸到潔凈載片上，再用固定液固定?？諝飧稍锖?，經(jīng)Giemsa染色、計(jì)數(shù)。 熒光染色法可以廣泛應(yīng)用于牛、羊、倉(cāng)鼠、小鼠、兔子、豬等胚胎計(jì)數(shù)，常用的染料有Hoechest 33342，復(fù)染液為用2.3檸檬酸鈉配制的0.1或0.01的臺(tái)盼藍(lán)（TB）液。7.32胚胎移植胚胎移植（embryo transfer，ET）一般是針對(duì)早期胚胎而言，它是指附植前的早期胚胎很容易由子宮中取出，經(jīng)過(guò)人為處理，可以再送入子宮的過(guò)程，這胚胎生物工程的基

26、本技術(shù)。同期發(fā)情胚胎移植時(shí)，供體胚胎必須與受體子宮內(nèi)膜發(fā)育狀態(tài)高度同步化，才能獲得好效果，這個(gè)過(guò)程稱(chēng)為同期發(fā)情（oestrus ynchronization），包括自然同期發(fā)情和人工同期發(fā)情。 自然同期發(fā)情即不經(jīng)任何藥物處理，依靠動(dòng)物自身的性周期規(guī)律，選擇處于適當(dāng)時(shí)期的母畜作為受體。 實(shí)際操作中，多用性激素進(jìn)行人工同期發(fā)情。 以小鼠為例，將自然排卵或人工超排的小鼠與結(jié)扎輸精管的公鼠交配，造成假孕。子宮移植時(shí)，一般選用假孕2.5天的母鼠。胚胎的活力 的檢測(cè)形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢測(cè) ：首先看胚胎的外形，要求形態(tài)正常，卵裂球均一，透明帶完整。其次要鑒別采卵時(shí)間是否與胚胎發(fā)育時(shí)期相吻合。如果發(fā)育時(shí)間落后于采

27、卵時(shí)間，則胚胎本身可能有問(wèn)題。 也可以用0.5的臺(tái)盼藍(lán)對(duì)胚胎做染色處理，活細(xì)胞是不被著色。一般有一半以上卵裂球著色的胚胎發(fā)育能力較差。胚胎移植移植分為手術(shù)移植和非手術(shù)移植，在無(wú)菌條件下，向輸卵管或子宮內(nèi)用微吸管將吸入的胚胎注入，在小鼠、大鼠和倉(cāng)鼠都應(yīng)在動(dòng)物背部開(kāi)口，找出輸卵管將胚胎移入 向子宮內(nèi)移植多在囊胚期，成功率較高，在小鼠和大鼠，可達(dá)到7080。 羊和豬一般是開(kāi)腹進(jìn)行手術(shù)移植，在牛，目前多進(jìn)行非手術(shù)移植。手術(shù)法移植手術(shù)法是指將動(dòng)物保定、全身麻醉或局部麻醉后，清理手術(shù)部位。 在背部或腹中線(xiàn)開(kāi)口，將輸卵管或子宮拉出體外。 如果進(jìn)行輸卵管移植，把吸好胚胎的移植管由輸卵管傘口插入管內(nèi)，盡量插得深

28、一些。然后把胚胎吹入輸卵管內(nèi)。移植時(shí)，應(yīng)盡量少帶入液體。 如果進(jìn)行子宮移植，在離子宮角與輸卵管接合部約5cm處，先用鈍頭針扎一小孔，隨即抽出，把移植管順此孔插入子宮腔，吹入胚胎。復(fù)位、縫合。 手術(shù)法一般是移植卵裂早期的胚胎。牛胚胎移植用人工受精管，通過(guò)子宮頸進(jìn)入子宮體，然后注入胚胎7.33胚胎保存保存的方法可以分為非冷凍保存和冷凍保存。 非冷凍保存是1948年，由M.C.Chang 等開(kāi)創(chuàng)的，他們將兔2細(xì)胞胚胎，在同種血清中37保存48小時(shí)，移植后產(chǎn)仔。 非冷凍保存主要有三種方法，即異種動(dòng)物體內(nèi)保存法、卵和胚胎的37保存法和冷藏保存法又稱(chēng)為中間受體培養(yǎng)法，是指把一種動(dòng)物的胚胎，移入另一種動(dòng)物的

29、輸卵管或子宮內(nèi)，短期保存后再取出的方法，但并不是所有的動(dòng)物都能在另一種動(dòng)物的輸卵管或子宮內(nèi)存活的。 瓊脂包埋移植法是指將胚胎移植到1的瓊脂液中，用口徑適宜的微吸管把胚胎連同少量瓊脂液一起吸入。當(dāng)瓊脂凝結(jié)后再將其壓出，胚胎就被封入圓柱形瓊脂小柱中，每個(gè)瓊脂小柱放35枚胚胎，再把這個(gè)瓊脂小柱封入較大的1.2瓊脂圓柱內(nèi)。然后，通過(guò)胚胎移植技術(shù)，將瓊脂柱移入中間受體輸卵管中。移植前，預(yù)先結(jié)扎輸卵管與子宮的接合部。 直接移植法是不經(jīng)瓊脂處理，直接移入預(yù)先結(jié)扎過(guò)的受體輸卵管中。經(jīng)過(guò)短期培養(yǎng)后，將胚胎從輸卵管內(nèi)沖出 ，觀察發(fā)育情況。對(duì)發(fā)育良好者，移植入同期發(fā)情的同種動(dòng)物受體內(nèi)，使其產(chǎn)仔。異種動(dòng)物體內(nèi)保存法3

30、7保存法是指在37下，短時(shí)間保存卵和胚胎。 由于是在胚胎培養(yǎng)的條件下進(jìn)行，因而應(yīng)當(dāng)考慮到保存時(shí)間和胚胎發(fā)育、卵老化等問(wèn)題。 例如，兔和小鼠的46細(xì)胞胚胎，經(jīng)過(guò)96小時(shí)在37保存，已經(jīng)發(fā)育到胚泡階段。一般而言，經(jīng)過(guò)48小時(shí)體外保存，再移向受體，胎兒的發(fā)育率要下降50，保存時(shí)間越長(zhǎng)發(fā)育率越下降。 就卵母細(xì)胞而言，排卵或由卵泡取出后，受精能力有一定限度，所以保存時(shí)間長(zhǎng)，即或能受精，也可能出現(xiàn)胚胎發(fā)育異常。冷藏保存法 低于室溫，但還達(dá)不到冷凍階段的溫度對(duì)胚胎進(jìn)行保存即為冷藏保存法，一般在010左右保存。 由于低溫，可以抑制物質(zhì)代謝的速度和細(xì)胞分裂的速度，因之可以延長(zhǎng)保存時(shí)間 。冷凍法冷凍法是指196保

31、存胚胎，在進(jìn)行超低溫冷凍前，必須進(jìn)行冷凍保護(hù)劑處理。一般說(shuō)來(lái)，在80以上時(shí)，細(xì)胞則逐漸失去活力，到130以下，細(xì)胞內(nèi)的水分呈微細(xì)冰晶樣或玻璃樣結(jié)構(gòu)，細(xì)胞內(nèi)所有需要能量的反應(yīng)停止，細(xì)胞的活動(dòng)也幾乎停止。 最早，小鼠中獲得成功。冷凍過(guò)程中細(xì)胞受到的損害在冷凍過(guò)程中，細(xì)胞會(huì)受到兩方面的損害。 快速冷凍時(shí)，細(xì)胞內(nèi)形成的冰晶，對(duì)細(xì)胞膜和內(nèi)部結(jié)構(gòu)產(chǎn)生機(jī)械性損害，這是指冷凍的物理?yè)p傷。 當(dāng)緩慢降溫時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的水，有足夠的時(shí)間完全滲到外面，從冰點(diǎn)緩慢降到細(xì)胞完全脫水，往往需要幾個(gè)小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間，細(xì)胞一直處于高濃度溶質(zhì)中。如不加抗冷凍劑，細(xì)胞也會(huì)受到損害，這是冷凍的化學(xué)損傷。防止冷凍損傷在冷凍液中，可以加入冷凍

32、保護(hù)劑，如DMSO、丙二醇、乙二醇、丙三醇、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮等。 冷凍保護(hù)劑的加入，可保護(hù)細(xì)胞抵抗低溫對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的損害。在胚胎冷凍過(guò)程中，還需要在稍低于溶液冰點(diǎn)時(shí)，強(qiáng)行致冷，防止溶液過(guò)冷現(xiàn)象的發(fā)生，這種促使溶液結(jié)冰的方法稱(chēng)為誘發(fā)結(jié)晶或植冰（seeding）。一般，在37之間誘發(fā)結(jié)晶。 現(xiàn)在，人們已經(jīng)使用玻璃化法冷凍胚胎獲得成功，在冷凍保存液中加入高濃度的冷凍保護(hù)劑，使溶液粘性增強(qiáng)，當(dāng)處于超低溫時(shí)，形成玻璃樣液體。動(dòng)物胚胎的一般保存程序動(dòng)物胚胎的一般保存程序是將胚胎吸入含M2液的安瓿瓶中，冷卻到0，逐漸加入冷凍保護(hù)劑，封閉安瓿。然后，把封閉好的安瓿從0冰室，轉(zhuǎn)移到5-6的恒冷室中，用預(yù)先在液

33、氮凹面冷卻的眼科鑷子尖部，接觸安瓿，玻璃上一出現(xiàn)霜，就立即移開(kāi)鑷子，完成植冰過(guò)程，之后，慢速冷至40或70，再直接投入液氮中保存超低溫冷凍保存方法慢速冷凍、慢速解凍法是最早建立起來(lái)的哺乳動(dòng)物胚胎冷凍方法。 以低于1/分鐘的速度降低到40或70（小鼠）、60120(牛)、80（卵母細(xì)胞），再投入液氮。解凍速度也不超過(guò)25/分鐘。其優(yōu)點(diǎn)是脫水完全，細(xì)胞內(nèi)不易形成冰，但比較費(fèi)時(shí)，冷凍保護(hù)劑對(duì)胚胎作用時(shí)間長(zhǎng)。 快速冷凍、快速解凍法是指把胚胎慢速降溫到3035，投入液氮。解凍可以在室溫或37水浴中進(jìn)行。該方法能較好地克服胚胎脫水少細(xì)胞內(nèi)冰晶形成之間的矛盾，獲得較高的存活率。解凍后，用蔗糖洗脫。超低溫冷凍

34、保存方法一步冷凍法省去了洗脫冷凍保護(hù)劑，其主要特點(diǎn)是冷凍細(xì)管里的冷凍液和稀釋液是分開(kāi)的。細(xì)管里裝有培養(yǎng)液、含胚胎的冷凍液、稀釋液。該法適用于冷凍胚胎運(yùn)輸使用。 快速冷凍法將胚胎或卵母細(xì)胞在適當(dāng)?shù)睦鋬霰Ｗo(hù)劑混合液中作短暫處理后，直接投入液氮。 玻璃化法簡(jiǎn)單、快速而有效，不需要冷凍儀，主要依靠溶液的玻璃化特性，將卵母細(xì)胞或胚胎同玻璃化液處理，然后直接投入液氮，解凍時(shí)快速進(jìn)行。牛胚胎冷凍家畜胚胎冷凍以牛胚胎最為成功，添加牛血清或牛血清白蛋白的杜氏PBS，一直被廣泛用于胚胎保存的基礎(chǔ)液 。采用慢速冷凍、快速冷凍、一步法冷凍、玻璃化法，均可成功。 甘油比DMSO更有利于牛胚胎冷凍。 牛胚胎冷凍已經(jīng)廣泛應(yīng)

35、用于商業(yè)性胚胎移植工作。7.34胚胎分割 同卵雙生胚胎分割的原理根據(jù)卵裂球具有發(fā)育成為一個(gè)個(gè)體的全能性的特點(diǎn)，人們就考慮用這種實(shí)驗(yàn)技術(shù)，生產(chǎn)同卵雙胎或多胎，以加速優(yōu)良種群的繁殖。 胚胎的分割在不同時(shí)期有不同的分離培養(yǎng)方法，如卵裂球分離培養(yǎng)法、致密化前各期胚胎分割法、桑椹胚至囊胚期胚胎分割法等。卵裂球分離培養(yǎng)卵裂球分離培養(yǎng)是將桑椹胚以前的卵裂胚去掉透明帶，分離每個(gè)卵裂球，將其包埋于瓊脂中，將包有卵裂球的瓊脂柱，移到中間受體小鼠或兔的輸卵管中，經(jīng)數(shù)日活體內(nèi)培養(yǎng)后，再取出已經(jīng)發(fā)育到多細(xì)胞的胚胎，移于受體子宮。 這種方法已經(jīng)在牛、羊、馬生出同卵多胎。 對(duì)研究卵裂球位置與分化方向以及研究嵌合胚、不同卵裂

36、球遺傳性等，都是一種很有用的技術(shù)。致密化以前各期的胚胎分割對(duì)于致密化以前各期的胚胎，由于卵裂球之間彼此尚未建立起緊密聯(lián)系，分割時(shí)較容易進(jìn)行。根據(jù)胚胎的直徑，制作適宜口徑的固定吸管和吸取卵裂球用的微吸管。在顯微操作儀上，用固定吸管固定住胚胎，然后用微玻璃針自上而下切開(kāi)透明帶，使其成為一個(gè)切口。將微吸管自切口處伸入，吸住半數(shù)卵裂球，慢慢取出，這樣即可以把胚胎一分為二。把吸出的半胚或卵裂球，納入空透明帶中?？胀该鲙菍U棄的卵母細(xì)胞或不合適的胚胎，去除其內(nèi)容物即可。然后將分割后的胚胎包入瓊脂柱，通過(guò)中間受體培養(yǎng)。依照同樣的方法，可以將胚胎分割成為四或八分胚桑椹期的胚胎分割用微玻璃針或微刀進(jìn)行分割，無(wú)

37、需固定吸管，由于透明帶韌性較強(qiáng)。 切割之前需要對(duì)其進(jìn)行軟化處理，處理標(biāo)準(zhǔn)是：48細(xì)胞胚胎用0.5酶液處理12分鐘；桑椹胚用0.20.3酶液處理30秒鐘；囊胚則用0.20.3酶液處理30秒以下。過(guò)程把經(jīng)過(guò)軟化處理的胚胎，與少量培養(yǎng)液一起置于載片上，把針或微刀的刃部調(diào)節(jié)到胚胎的正上方。然后自胚胎的等分線(xiàn)向下移動(dòng)，把胚胎輕輕壓住，繼續(xù)下切，胚胎就被壓扁，繼而被切開(kāi)。再把切割的胚胎納入空透明帶。 囊胚切割時(shí)，需將內(nèi)細(xì)胞團(tuán)一分為二，早期的囊胚的二分胚發(fā)育率，比桑椹胚的二分胚發(fā)育率要低，可能是因?yàn)槟遗哒幱谶M(jìn)一步的細(xì)胞分化狀態(tài)，操作后胚胎的調(diào)整能力比桑椹胚差。相對(duì)而言，二分胚、四分胚比較容易培養(yǎng)，而八分胚

38、的存活率很低。過(guò)程 胚胎分割7.35胚胎嵌合嵌合體（chimera）是指在同一個(gè)體中，由于基因型不同的細(xì)胞或組織互相接觸，且各自獨(dú)自并存的狀態(tài) 發(fā)育早期，如卵裂球甚至受精卵所形成的嵌合體稱(chēng)為原發(fā)性嵌合體，而把在發(fā)育的較晚期，如胚層已經(jīng)分化，或器官開(kāi)始形成后，通過(guò)組織移植或嫁接等方法所形成的部分組織或器官的嵌合，稱(chēng)為次生性嵌合體1901年，Spemann最早開(kāi)始進(jìn)行動(dòng)物嵌合體的研究，他進(jìn)行了蛙嵌合個(gè)體的培育，其目的是為了研究?jī)蓷?lèi)動(dòng)物的發(fā)育機(jī)制。 1960年，Mintz開(kāi)始研究嵌合體制作技術(shù)，到1965年第一次獲得活至成體的正常小鼠嵌合體。植入前胚胎嵌合體的制作方法聚合法 第一種可以利用胚胎與胚

39、胎聚合，即使用發(fā)生致密化后的胚胎，用酸性臺(tái)氏液（pH2.5）或0.5鏈霉蛋白酶除去透明帶，充分洗滌后，放入含有5g/ml植物凝集素A（PHA）的聚合液滴中。讓一個(gè)胚胎垂直位于另一胚胎之上，借機(jī)械壓力和PHA的作用，更易聚合。若放到37時(shí)，效果更佳，聚合完畢后，洗除PHA，繼續(xù)培養(yǎng)，或進(jìn)行胚胎移植。 第二種是利用卵裂球或細(xì)胞與胚胎聚合，將胚胎卵裂球解離或用其他游離的細(xì)胞，與胚胎聚合。當(dāng)用一個(gè)已經(jīng)除去透明帶的胚胎時(shí)，將卵裂球或細(xì)胞在胚胎的正上方慢慢釋放，使兩者直接接觸，借助PHA的作用使之聚合。當(dāng)用兩個(gè)無(wú)透明帶胚胎時(shí)，以類(lèi)似“三明治”的方式，把細(xì)胞放到兩個(gè)胚胎之間，使之聚合。 第三種利用兩種細(xì)胞間聚合。聚合時(shí)，各取數(shù)個(gè)細(xì)胞或卵裂球，放入空透明帶內(nèi)，用PHA使之聚合在一起，并用瓊脂包埋。通過(guò)中間受體培養(yǎng)一段時(shí)間后，觀察其發(fā)育的情況。囊胚注射法囊胚注射法是把某些種類(lèi)細(xì)胞注射入囊胚的囊胚腔中，注射的細(xì)胞可以是卵裂球、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞，甚至是已