蛋白質(zhì)泛素化及人類疾病發(fā)生的關(guān)系及其研究報(bào)告進(jìn)展

1、. 泛素化修飾與人類疾病泛素-蛋白酶體途徑由泛素(ubiquitin，Ub)、泛素活化酶(ubiquitin-activating enzyme，E1)、泛素結(jié)合酶(ubiquitin-conjugating enzymes，E2s)、泛素-蛋白連接酶(ubiquitin-protein ligases，E3s)、26S蛋白酶體和泛素解離酶(deubiquitinating enzymes，DUBs)等組成，其對(duì)靶蛋白的降解是一種級(jí)聯(lián)反響過程。泛素首先在El催化下，其C末端甘氨酸殘基與El的半胱氨酸殘基間形成高能硫酯鍵而獲得活性。El-泛素結(jié)合的中間體再將泛素轉(zhuǎn)移給E2，形成E2-泛素中間體。

2、最后靶蛋白的泛素化還需要另一個(gè)特異的泛素蛋白連接酶E3s。E3s可以直接或間接與底物結(jié)合，促使泛素從與E2s形成的硫酯中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到靶蛋白賴氨酸殘基的氨基基團(tuán)上，形成異肽鍵(isopeptide bond)。當(dāng)?shù)谝粋€(gè)泛素分子連接到靶蛋白上后，另外一些泛素分子在E3s的催化下相繼與底物相連的泛素分子的第48位賴氨酸殘基相連，形成一條多聚泛素鏈，作為底物被蛋白酶體識(shí)別和降解的靶向性信號(hào)。完成泛素化的蛋白質(zhì)構(gòu)造被展平進(jìn)入26S蛋白酶體，在20S催化中心中被降解，泛素分子可被DUBs從底物上水解下來，重復(fù)利用。一、泛素(Ub)泛素是1975年由Goldstein首先發(fā)現(xiàn)的一種在真核生物細(xì)胞高度保守的多

3、肽，單個(gè)泛素分子由76個(gè)氨基酸組成，分子量約8.5kD。在不同生物體間組成泛素的氨基酸序列差異很小，如酵母和人的泛素僅有3個(gè)氨基酸序列的差異。泛素分子嚴(yán)密折疊成球形，5股混合的片層形成一個(gè)腔樣構(gòu)造，部對(duì)角線位置有1個(gè)螺旋，這個(gè)構(gòu)造稱為泛素折疊。這個(gè)小蛋白含有一個(gè)明顯的疏水核心和大量的氫鍵，表現(xiàn)出特殊的穩(wěn)定性，能夠防止在結(jié)合和靶向性降解循環(huán)中變性失活，從而保證泛素循環(huán)的運(yùn)行。從泛素折疊中突出來的是具有一定變形性的C末端延伸局部，這個(gè)末端第76位含有一個(gè)必須的甘氨酸。泛素與其它蛋白都是通過C-末端第76位甘氨酸來連接的。二、泛素活化酶(E1)El是泛素與底物蛋白結(jié)合所需要的第一個(gè)酶，但是對(duì)靶蛋白的

4、特異性卻幾乎沒有影響。El是一種廣泛表達(dá)的多肽，大約1100個(gè)氨基酸，含有位置固定的保守的半胱氨酸殘基。El有2個(gè)亞型，是由同一個(gè)mRNA在不同的起始位點(diǎn)翻譯而成的，存在于細(xì)胞漿和細(xì)胞核中。酵母的El基因失活后是致命的，說明這個(gè)蛋白對(duì)于細(xì)胞的生存是至關(guān)重要的(Stephen等1996)。El可以水解ATP，與泛素的羧基末端形成高能硫酯鍵而激活泛素。在真核生物這個(gè)激活反響由兩步構(gòu)成：起始形成泛素-腺苷酸中間物，接下來這個(gè)中間物與El半胱氨酸殘基發(fā)生反響形成E1-Ub硫酯鍵。通常一個(gè)泛素分子有一個(gè)單獨(dú)的E1。E1具有高度的催化效能，在低濃度的情況下就能夠激活泛素，滿足下游的級(jí)聯(lián)反響過程(Picka

5、rt2001)。三、泛素結(jié)合酶(E2s)級(jí)聯(lián)反響的第二步是泛素分子經(jīng)過轉(zhuǎn)硫醇反響從E1半胱氨酸殘基轉(zhuǎn)移給E2s活化的半胱氨酸位點(diǎn)。E2s在哺乳動(dòng)物中至少有25個(gè)基因，所有的E2s都含有一個(gè)保守的大約150個(gè)氨基酸的核心構(gòu)造域，在構(gòu)造域的中央是決定E2s活性的半胱氨酸殘基，位于蛋白外表淺的裂隙(Hamilton等2001)。E2s家族中的一小局部成員只含有這個(gè)核心構(gòu)造，但是其它的大局部成員還有N-或C-末端的延伸，這種構(gòu)造可能與E3s的識(shí)別、E2s自身的活性以及底物識(shí)別有關(guān)。E1和E3s通過一樣的基序與E2s連接，這說明在反響循環(huán)過程中，E2s必須在E1和E3s之間穿梭往返運(yùn)行。因此為了保證在激

6、活的泛素與數(shù)量巨大的E3s之間得到平衡的分布，需要多個(gè)E2s異構(gòu)體。E2sUb非共價(jià)結(jié)合的親和力非常低，說明其在轉(zhuǎn)移泛素分子到靶蛋白上起著重要的作用。四、泛素-蛋白連接酶(E3s)泛素化途徑最重要的特征就是底物的多樣性和選擇性，這一功能由E3s直接決定。目前主要有3種類型的E3s，即含有HECT(homologous to E6-associatedprotein carbo*yl terminus)構(gòu)造域的E3s、含有環(huán)指狀(RING finger)構(gòu)造域的E3s和含有U-bo*構(gòu)造域的E3s2。在高等生物E3的總數(shù)從幾百到一千以上，新的E3亞家族仍不斷被發(fā)現(xiàn)。正是由于這些復(fù)雜多變的E3s家

7、族成員可以對(duì)不同的底物進(jìn)展特異性的識(shí)別，才呈現(xiàn)出蛋白降解的高度選擇性。(一)含有HECT構(gòu)造域的E3s HECT E3s的命名是因?yàn)槠銫-末端含有一段大約350個(gè)氨基酸的區(qū)域與E6-AP(E6-associated protein)的C-末端同源。HECT E3s催化轉(zhuǎn)硫醇反響將E2s中的泛素轉(zhuǎn)移給HECT構(gòu)造域的保守的半胱氨酸殘基。E6AP-HECTUbcH7復(fù)合體的晶體構(gòu)造顯示HECT構(gòu)造域呈L形，活性位點(diǎn)位于L形的拐彎處(Huang等1999)。游離的HECT構(gòu)造域與E2s有較強(qiáng)的相互作用，E2s結(jié)合位點(diǎn)位于L形基底部的末端。HECT構(gòu)造域的缺失不影響底物的結(jié)合，高度可變的N末端構(gòu)造域負(fù)

8、責(zé)對(duì)特異底物的識(shí)別和結(jié)合。(二)含有環(huán)指狀構(gòu)造域的E3s 其特征是含有一個(gè)保守的組氨酸和半胱氨酸殘基復(fù)合體，在其中心有2個(gè)Zn+離子。RING E3s沒有直接催化蛋白泛素化的作用，其作為一個(gè)?？课稽c(diǎn)將靶蛋白和E2s聚集在一起，然后介導(dǎo)泛素的轉(zhuǎn)移而不是與泛素形成硫酯鍵。含有環(huán)指狀構(gòu)造域的E3s可被分成2種類型，一種是單個(gè)蛋白，其代表是作為P53的E3s的MDM2(mouse double minute 2)癌蛋白(Honda等2000)以及作為受體酪氨酸激酶如表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)和血小板衍生因子受體(platelet-de

9、rived growth factorreceptor)E3s的c-Cbl(Tsygankov等2001)。另一種是多蛋白組成的復(fù)合體，包括SCF(Skpl-CullinCdc53-F-bo*-Rb*1)、有絲分裂后期促進(jìn)復(fù)合物(aftaphasepromoting ple*，APC)和VBC-Cul2復(fù)合體(the von-Hippel-Lindau-elongins B and C-Cul2ple*)。SCF E3s是至少有4種多肽組成的復(fù)合體。被命名為SCF是因?yàn)槠渲械娜齻€(gè)核心亞基(Skpl、CullinCDC53和一個(gè)F-Bo*蛋白)。后來第四個(gè)亞基Rb*l(RING bo* 1 pr

10、otein)被發(fā)現(xiàn)，其含有一個(gè)RING H2-型構(gòu)造域。在SCF E3s中的Rb*l能夠集合E2，Cullins蛋白作為Rb*l與蛋白之間的支架參與底物的選擇性。底物的識(shí)別由底物特異性的F-bo*蛋白所介導(dǎo)，F(xiàn)-bo*本身被SCF E3s復(fù)合體中的Skpl接頭因子所識(shí)別和聚集。Skpl與Cullins結(jié)合，因此將底物和泛素并列排開。F-bo*蛋白的特征是含有一個(gè)大約4O個(gè)氨基酸的基序，最初在細(xì)胞周期蛋白F中鑒定出來。人類含有大量的F-bo*蛋白，可以分成不同的亞類，在多數(shù)情況下F-bo*蛋白結(jié)合磷酸化的蛋白質(zhì)。如SCF E3s通過引起p27和cdc25的快速降解來調(diào)節(jié)細(xì)胞周期3。APC的核心顆

11、粒至少含有13個(gè)亞基，最初發(fā)現(xiàn)在降解Cyclin的過程中起著重要作用。隨后研究發(fā)現(xiàn)，其具有控制在有絲分裂進(jìn)展和完畢過程中起著至關(guān)重要的一些因子的半衰期的功能4。APC中的2個(gè)亞基APC2和APC11分別與SCF E3s復(fù)合體中的Cullinl和Rb*l相關(guān)，推測APC2可能具有連接其它亞基的作用，而APC11則具有結(jié)合Ub-E2s中間體的作用。von-Hippel Lindau(VHL)腫瘤抑制因子蛋白E3復(fù)合體與SCF型復(fù)合體有所不同，其核心區(qū)有Rb*l和Cul2A構(gòu)造，然而Skp1被轉(zhuǎn)錄延伸因子B/C所代替。轉(zhuǎn)錄延伸因子B/C復(fù)合體能夠調(diào)節(jié)VHL與其它蛋白的相互作用，包括RNA聚合酶II延

12、長因子A和細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制分子(suppressors of cytokine signalling，SOCS)盒裝蛋白。這種復(fù)合體與靶蛋白特異結(jié)合的方式雖然簡單，但是效率卻很高(Kim等2003)。(三)含有U-bo*構(gòu)造域的E3s U-bo* E3s是一個(gè)相對(duì)較小的E3s家族，在構(gòu)造上與RING構(gòu)造域相似(Ohi等2003)，因此有的人將U-bo* E3s與環(huán)指狀構(gòu)造域的E3s歸為一類。在一些情況下多泛素鏈的形成還需要泛素鏈延長因子的輔助，人們將具有這類功能的酶命名為E4s。U-bo*家族成員具有E4s的特點(diǎn)。第一個(gè)被鑒定的E4s家族是泛素融合降解蛋白(ubiquitin fusion

13、 degradation 2，UFD2)，其特征是C末端含有一個(gè)大約70個(gè)氨基酸的保守的U-bo*，在構(gòu)造上與RING-finger E3s相關(guān)，能與含有13個(gè)泛素分子的底物結(jié)合，催化其它的泛素分子附加到底物上，形成含有多泛素鏈的底物。U-bo*家族的另一個(gè)成員是與熱休克蛋白70 C-末端相互作用蛋白(C terminus of Hsc70-interacting protein，CHIP)，在降解途徑中作為泛素鏈延長因子與另外的E3s協(xié)同作用，能夠結(jié)合伴侶分子識(shí)別的異常或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)，導(dǎo)致他們被26S蛋白酶體所降解，是另一個(gè)含有U-bo*的具有E4功能的蛋白質(zhì)。目前還不清楚是否含有U-b

14、o*構(gòu)造域的蛋白質(zhì)都具有E4s的活性。(四)E3s與靶蛋白多聚泛素鏈的形成靶蛋白的泛素鏈最少需要四個(gè)泛素分子的長度才能夠被蛋白酶體有效降解。關(guān)于靶蛋白的泛素鏈?zhǔn)侨绾涡纬傻倪€不清楚，推測可能存在以下4種模型6：(1)有序增加模型(sequential addition mode1)也稱為標(biāo)準(zhǔn)模型，即E3通過不同的構(gòu)造域(如RING E3s)與E2和底物結(jié)合，形成E2-E3-底物復(fù)合體，E3促使與E2連接的泛素分子直接轉(zhuǎn)移到底物的賴氨酸殘基，然后E2-E3-底物復(fù)合體中的E2再承受來自E1分子傳遞的新的泛素分子，在E3的作用下將泛素分子直接轉(zhuǎn)移到與底物相連的第一個(gè)泛素分子，接下來循環(huán)此過程，完成靶

15、蛋白泛素鏈的組裝；(2)指數(shù)模型(inde*ation mode1)是指在形成E2-E3-底物復(fù)合體后，E2上的第一個(gè)泛素分子首先與E3s的HECT構(gòu)造域的半胱氨酸活化位點(diǎn)結(jié)合，然后依次在此位置形成一條泛素鏈，最后泛素鏈從E3上轉(zhuǎn)移到底物的賴氨酸殘基；(3)秋千模型(seesaw mode1)是指E3與2個(gè)E2和底物形成復(fù)合體后，泛素鏈的組裝發(fā)生在2個(gè)E2的活化位點(diǎn)上，即一個(gè)E2上的泛素分子轉(zhuǎn)移到另一個(gè)E2上后，新轉(zhuǎn)移過來的泛素位于最底層直接與E2連接的位置，而原來與E2直接連接的泛素則與新轉(zhuǎn)移過來的泛素相連，依此從后向前的方式形成一條泛素鏈，最后泛素鏈直接從E2轉(zhuǎn)移到底物上；(4)雜和模型(

16、hybrid mode1)是指E2-E3-底物復(fù)合體形成后，E2上的泛素分子首先轉(zhuǎn)移到E3上，在E3上形成一條泛素鏈，然后泛素鏈按照E3 El E2底物的傳遞順序連接到靶蛋白上。不同的E3s可能通過不同的機(jī)制組裝靶蛋白的多泛素鏈。五、泛素解離酶(DUBs)雖然泛素與細(xì)胞快速降解的蛋白連接在一起，但是其本身卻是長壽命蛋白，這是由于泛素蛋白偶連物在水解之前DUBs將泛素從底物上解離下來。DUBs屬于蛋白酶超家族，根據(jù)其催化機(jī)制，可以分為5類(天門冬氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶、絲氨酸蛋白酶、氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶)，生物信息學(xué)研究顯示大約有79個(gè)有功能的DUBs7，其局部為半胱氨酸蛋白酶。DUBs能

17、夠識(shí)別最接近的泛素基序，特異性地在泛素和與其C末端最后一個(gè)殘基(Gly76)相連的分子之連續(xù)開(Amerik等2004)。半胱氨酸蛋白酶型DUBs根據(jù)泛素-蛋白酶構(gòu)造域又可分為4個(gè)亞類：泛素特異性蛋白酶(USP)、碳末端水解酶(UCH)、卵巢腫瘤蛋白酶(OTU)和MJD蛋白酶。金屬蛋白酶型DUBs的泛素一蛋白酶構(gòu)造域稱為JAMM(JAB1MPNMov34metalloenzyme)(Amerik等2004)。半胱氨酸蛋白酶的活性信賴于活性位點(diǎn)中的一個(gè)半胱氨酸的硫醇基團(tuán)。這個(gè)半胱氨酸在鄰近組蛋白的輔助下去質(zhì)子化，在一個(gè)天門冬氨酸殘基的作用下產(chǎn)生極性，這三個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成催化三聯(lián)體。在催化過程中，

18、半胱氨酸表現(xiàn)出親質(zhì)子作用，攻擊靶蛋白與泛素之間易斷裂肽鍵的羰基端，結(jié)果將靶蛋白釋放出來，泛素與UDBs形成一個(gè)共價(jià)連接的中間體。中間體與水分子反響釋放出游離的酶和泛素。六、26S蛋白酶體26S蛋白酶體是降解泛素化底物的一個(gè)ATP依賴型蛋白水解復(fù)合體，由20S核心蛋白酶(core protease，CP)和19S調(diào)節(jié)顆粒(regulatory particle，RP)構(gòu)成。CP是由4個(gè)七聚體蛋白組成的環(huán)層疊在一起形成的一個(gè)空心圓柱體樣構(gòu)造(l-71-7l-71-7)，是26S蛋白酶體的水解核心。活性位點(diǎn)位于20S圓柱體空心構(gòu)造中心的2個(gè)環(huán)上，含有胰蛋白酶、糜蛋白酶和谷氨酰樣肽水解活性，具有能夠使

19、大多數(shù)肽鍵斷裂的能力(Voges等 1999)。2個(gè)亞基的氨基末端封住蛋白水解腔隙的人口，對(duì)蛋白酶體CP的活性具有自身抑制作用，這樣只有進(jìn)入蛋白酶體圓柱體部的蛋白才能夠被水解。RP由基底(Base)和蓋子(Lid)兩個(gè)亞單位組成，分別與CP兩端的環(huán)相結(jié)合。基底亞單位是由6個(gè)相關(guān)的AAAATPases RPT1-6(regulatory particle triple-Aprotein)和3個(gè)non-ATPase RPN(regulatory particlenon-ATPase)1、2和10組成的環(huán)狀構(gòu)造，能夠活化20S核心顆粒(Glickman等1998)。蓋子亞單位含有其余的non-ATP

20、ase(RPN 3、5-9、11和12)，是泛素依賴性蛋白降解所必須的(Fu等2001)。靶蛋白進(jìn)入蛋白酶體需要底物傳送蛋白的輔助，這些蛋白含有UBL或UB*(ubiquitin-like protein)和UBA(ubiquitin-associated)構(gòu)造域，包括Rad23(radiation gene 23)、Dsk2(dominant suppressorof Kar2)、Ddil(DNA damage molecule-1)和Shp1p47。Rad23、Dsk2和Ddil的UBL構(gòu)造域能夠直接與26S蛋白酶體相互作用，然而Shplp47的UB*構(gòu)造域能夠與Cdc48p97相互作用，

21、通過Cdc48p97與蛋白酶體聯(lián)系在一起。目前多數(shù)的泛素化底物通過與RPN1S2結(jié)合進(jìn)入蛋白酶體。另外，泛素化的靶蛋白能夠直接與RPN10S5a和ATPase 5(RPT5)S6/S6a結(jié)合。RPT5S6 S6a ATPase也能夠與VHL E3s中的VHL結(jié)合，因此底物與蛋白酶體的結(jié)合有許多直接和間接的機(jī)制。這些不同的機(jī)制為多種蛋白在蛋白酶體中提供了選擇性降解過。綜上所述，RP輔助識(shí)別和伸展適當(dāng)?shù)牡孜?，裂解與UB連接的共價(jià)鍵，開放-環(huán)，然后伸展開的多肽直接進(jìn)入CP的腔被斷裂成6-10個(gè)氨基酸長度的片斷，最后在胞漿中被水解成單個(gè)氨基酸。七、結(jié)語泛素-蛋白酶體途徑是細(xì)胞ATP依賴的蛋白質(zhì)選擇性降

22、解的主要途徑，是真核細(xì)胞重要的蛋白質(zhì)質(zhì)控系統(tǒng)，參與細(xì)胞凋亡、MHC I類抗原的遞呈、細(xì)胞周期以及細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種生理過程，對(duì)維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)具有十分重要的意義9。該途徑在20世紀(jì)80年代初期首先被Avram Hershko、Aaron Ciechanover和Irwin Rose等幾位科學(xué)家所認(rèn)識(shí)，三人以此項(xiàng)成果共享2004年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。經(jīng)過30年的研究，人們對(duì)泛素-蛋白酶體途徑的組成和在生物體的功能有了深刻的認(rèn)識(shí)，但是這遠(yuǎn)遠(yuǎn)還不夠，還有許多問題未被說明，如E3s的組成及是如何被調(diào)節(jié)的多聚泛素鏈?zhǔn)侨绾尉奂募?xì)胞是如何操作讓不同長度的泛素鏈修飾不同的蛋白質(zhì)？26S蛋白酶體RP各個(gè)亞基的功能是什

23、么？泛素-蛋白酶體途徑功能失常已經(jīng)發(fā)現(xiàn)與多種疾病有重要的關(guān)系，已有研究顯示針對(duì)失常的關(guān)鍵環(huán)節(jié)設(shè)計(jì)藥物或基因的靶標(biāo)，對(duì)疾病的治療起到了良好的效果10。相信隨著技術(shù)手段的進(jìn)步，泛素蛋白酶體途徑會(huì)逐漸被提醒，從而豐富人們對(duì)人體生理狀態(tài)的了解和對(duì)疾病的認(rèn)識(shí)。參考文獻(xiàn)1 Smalle J，Vierstra RDThe ubiquitin 26S proteasome proteolytic pathwayAnnu Rev Plant Biol，2004，55 ：555 5902 Robinson PA，Ardley HCUbiquitinprotein ligasesJ CellSci，2004，117：519151943 Zheng N，Schulman BA，Song L，et a1Structure of theCullRb*lSkplF bo*Skp2 SCF ubiquitin ligase ple*Nature，2002，416：7037094 Passmore LA，Booth CR，VenienBrya