6 應(yīng)用生物技術(shù)(第六部分)3

1、第15章 人類基因組的克隆 從人類基因組方案（HGP）說(shuō)起(human genome project)160年代初，美國(guó)總統(tǒng)Kennedy提出兩個(gè)科學(xué)方案：登月方案攻克腫瘤方案 人類遺傳信息的復(fù)雜性人類基因組方案(HGP，Human Genome Project)目標(biāo)：整體上破解人類遺傳信息的奧秘為什么提出HGP？2 基因組(Genome)：包含細(xì)胞或生物體全套的遺傳信息的全部 遺傳物質(zhì)。原核生物(細(xì)菌、病毒等) 真核生物(真菌、植物、動(dòng)物等)人類基因組： 3.2109 bp3基因組 一個(gè)物種中所有基因的整體組成back4 人類基因組方案準(zhǔn)備用15年時(shí)間，投入30億美元，完成人類全部24條染色

2、體的3109脫氧核苷酸對(duì)(bp)的序列測(cè)定，主要任務(wù)包括作圖(遺傳圖譜、物理圖譜的建立及轉(zhuǎn)錄圖譜的繪制)、測(cè)序和基因識(shí)別。其中還包括模式生物(如大腸桿菌、酵母、線蟲、小鼠等)基因組的作圖和測(cè)序，以及信息系統(tǒng)的建立。作圖和測(cè)序是根本的任務(wù)，在此基礎(chǔ)上解讀和破譯生物體生老病死以及和疾病相關(guān)的遺傳信息5back6HGP的歷史回憶1984.12 猶他州阿爾塔組織會(huì)議，初步研討測(cè)定人類整個(gè)基 因組DNA序列的意義1985 Dulbecco在Science撰文 “腫瘤研究的轉(zhuǎn)折點(diǎn):人 類基因組的測(cè)序 美國(guó)能源部(DOE)提出“人類基因組方案草案1987 美國(guó)能源部和國(guó)家衛(wèi)生研究院（NIH）聯(lián)合為“人類 基

3、因組方案下?lián)軉?dòng)經(jīng)費(fèi)約550萬(wàn)美元1989 美國(guó)成立“國(guó)家人類基因組研究中心，Watson擔(dān)任 第一任主任1990.10 經(jīng)美國(guó)國(guó)會(huì)批準(zhǔn)，人類基因組方案正式啟動(dòng)James WatsonWalter Gilbert7第一個(gè)自由生物體流感嗜血菌(H. inf)的全基因組測(cè)序完成1996 完成人類基因組方案的遺傳作圖 啟動(dòng)模式生物基因組方案H.inf全基因組Saccharomyces cerevisiae釀酒酵母Caenorhabditis elegans秀麗線蟲81997 大腸桿菌(E.coli)全基因組測(cè)序完成1998 完成人類基因組方案的物理作圖 開始人類基因組的大規(guī)模測(cè)序 Celera公司參

4、加，與公共領(lǐng)域競(jìng)爭(zhēng) 啟動(dòng)水稻基因組方案1999.7 第5屆國(guó)際公共領(lǐng)域人類基因組測(cè)序會(huì)議，加快測(cè)序速度大腸桿菌及其全基因組水稻基因組方案92001年2月15日Nature封面2001年2月16日Science封面101999.7 第5屆國(guó)際公共領(lǐng)域人類基因組測(cè)序會(huì)議，加快測(cè)序速度2000 Celera公司宣布完成果蠅基因組測(cè)序 國(guó)際公共領(lǐng)域宣布完成第一個(gè)植物基因組擬南芥全基 因組的測(cè)序工作2000.6.26 公共領(lǐng)域和Celera公司同時(shí)宣布完成人類基因組工作草圖2001.2.15 Nature刊文發(fā)表國(guó)際公共領(lǐng)域結(jié)果2001.2.16 Science刊文發(fā)表Celera公司及其合作者結(jié)果Dr

5、osophila melanogaster果蠅Arabidopsis thaliana擬南芥11HGP的最初目標(biāo)通過(guò)國(guó)際合作，用15年時(shí)間(19902005)至少投入30億美元，構(gòu)建詳細(xì)的人類基因組遺傳圖和物理圖 ，確定人類DNA的全部核苷酸序列，定位約10萬(wàn)基因，并對(duì)其它生物進(jìn)行類似研究。4張圖： HGP的終極目標(biāo)說(shuō)明人類基因組全部DNA序列；識(shí)別基因；建立儲(chǔ)存這些信息的數(shù)據(jù)庫(kù)；開發(fā)數(shù)據(jù)分析工具；研究HGP實(shí)施所帶來(lái)的倫理、法律和社會(huì)問題。 遺傳圖物理圖序列圖轉(zhuǎn)錄圖12遺傳圖譜（genetic map）又稱連鎖圖譜(linkage map)，它是以具有遺傳多態(tài)性（在一個(gè)遺傳位點(diǎn)上具有一個(gè)以上

6、的等位基因，在群體中的出現(xiàn)頻率皆高于1%）的遺傳標(biāo)記為“路標(biāo)，以遺傳學(xué)距離（在減數(shù)分裂事件中兩個(gè)位點(diǎn)之間進(jìn)行交換、重組的百分率，1%的重組率稱為1cM）為圖距的基因組圖。遺傳圖譜的建立為基因識(shí)別和完成基因定位創(chuàng)造了條件。遺傳圖譜 13遺傳連鎖圖：通過(guò)計(jì)算連鎖的遺傳標(biāo)志之間的重組頻率，確定它們的相對(duì)距離，一般用厘摩（cM，即每次減數(shù)分裂的重組頻率為1%）表示。back14物理圖譜物理圖譜（physical map）是指有關(guān)構(gòu)成基因組的全部基因的排列和間距的信息，它是通過(guò)對(duì)構(gòu)成基因組的DNA分子進(jìn)行測(cè)定而繪制的。繪制物理圖譜的目的是把有關(guān)基因的遺傳信息及其在每條染色體上的相對(duì)位置線性而系統(tǒng)地排列出

7、來(lái)。15轉(zhuǎn)錄圖譜 轉(zhuǎn)錄圖譜是在識(shí)別基因組所包含的蛋白質(zhì)編碼序列的基礎(chǔ)上繪制的結(jié)合有關(guān)基因序列、位置及表達(dá)模式等信息的圖譜。 16通過(guò)定位克隆技術(shù)尋找疾病基因的過(guò)程 back17序列圖譜隨著遺傳圖譜和物理圖譜的完成，測(cè)序就成為重中之重的工作。DNA序列分析技術(shù)是一個(gè)包括制備DNA片段化及堿基分析、DNA信息翻譯的多階段的過(guò)程。通過(guò)測(cè)序得到基因組的序列圖譜 18大規(guī)?；蚪M測(cè)序19大規(guī)模測(cè)序根本策略逐個(gè)克隆法：對(duì)連續(xù)克隆系中排定的BAC克隆逐個(gè)進(jìn)行亞克隆測(cè)序并進(jìn)行組裝（公共領(lǐng)域測(cè)序方案）全基因組鳥槍法：在一定作圖信息基礎(chǔ)上，繞過(guò)大片段連續(xù)克隆系的構(gòu)建而直接將基因組分解成小片段隨機(jī)測(cè)序，利用超級(jí)計(jì)算

8、機(jī)進(jìn)行組裝（美國(guó)Celera公司）20運(yùn)用計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行序列拼接back21人類基因組人類基因組的組成線粒體基因組(16.6kb)細(xì)胞核基因組(3200Mb)基因外序列基因和基因有關(guān)序列約10%約90%專一或中等重復(fù)序列Non-coding DNA假基因內(nèi)含子基因片段90%專一的或低拷貝數(shù)序列中度至高度重復(fù)序列2030%7080%分散重復(fù)序列串聯(lián)重復(fù)序列/成簇重復(fù)序列約60%約40%蛋白編碼基因rRNA基因tRNA基因Coding DNA22人類基因組構(gòu)成24條染色體和線粒體23基因識(shí)別 基因識(shí)別（gene identification）是HGP的重要內(nèi)容之一，其目的是識(shí)別全部人類的基因?；?/p>

9、識(shí)別包括：識(shí)別基因組編碼區(qū)識(shí)別基因結(jié)構(gòu)基因識(shí)別目前常采用的有二種方法：從基因組序列中識(shí)別那些轉(zhuǎn)錄表達(dá)的DNA片段從cDNA文庫(kù)中挑取并克隆。 24人類基因組方案的實(shí)施意義 人類基因組方案為我們研究生物信息的組織、結(jié)構(gòu)、遺傳、表達(dá)帶來(lái)了極大的方便，使人類對(duì)自身有一個(gè)根本的了解。人類是最高級(jí)、最復(fù)雜、最重要的生物，如果搞清楚人類基因組，那么再研究其它的生物就容易得多。研究多種模式生物基因組將有助于研究地球生物的進(jìn)化史。25第一節(jié) 基因治療的回憶及現(xiàn)狀第二節(jié) 基因治療中的基因轉(zhuǎn)移載體第三節(jié) 基因治療中外源基因?qū)氲幕瘜W(xué)和物理方法第四節(jié) 基因治療的方式第五節(jié) 反義療法與RNA干預(yù)第六節(jié) 通過(guò)核酶進(jìn)行基

10、因治療第七節(jié) 癌癥的基因治療第八節(jié) 其他疾病的基因治療第九節(jié) 基因治療的前景第16章 人類疾病的基因治療26第一節(jié) 基因治療的回憶及現(xiàn)狀根據(jù)臨床統(tǒng)計(jì)：25%的生理缺陷、30%的兒童死亡、60%的成年人疾病都是由遺傳疾病引起的?；蛑委煟╣ene therapy）向靶細(xì)胞或組織中引入外源基因DNA或RNA片段，以糾正或補(bǔ)償基因的缺陷，關(guān)閉或抑制異常表達(dá)的基因，從而到達(dá)治療的目的。27基因治療的根本思想：（20世紀(jì)80年代提出）隨著對(duì)遺傳疾病致病機(jī)理的深入研究，人們自然就想到如果能夠使變異基因和異常表達(dá)的基因變?yōu)檎；蚝驼１磉_(dá)基因，那么就可從根本上治愈遺傳疾病。28最早在人體進(jìn)行的基因治療試驗(yàn)

11、是在1973年，由一名美國(guó)科學(xué)家和幾名醫(yī)生在德國(guó)進(jìn)行的，病人是倆姐妹，當(dāng)時(shí)分別為2歲、7歲，她們由于體內(nèi)缺少一種稀有酶，而呈明顯的精神癡呆，將肖普氏乳頭瘤病毒注入患者，因?yàn)樵摬《緮y帶一種酶基因有可能使病人本身的酶分泌恢復(fù)正常，結(jié)果是既無(wú)療效也無(wú)副作用。（未成功?。?9第二例基因治療是在1980年，美國(guó)的一名醫(yī)生對(duì)兩名地中海貧血患者進(jìn)行基因治療，結(jié)果也未成功。由于他的試驗(yàn)未得到NIH的批準(zhǔn)，受到社會(huì)廣泛抨擊。3020世紀(jì)80年代初期，安德森（Anderson）博士首先說(shuō)明了基因治療的前景及其開展方向。之后的幾年內(nèi)大批科學(xué)家在動(dòng)物身上進(jìn)行了大量的基因轉(zhuǎn)移（gene transfer）和基因標(biāo)記（g

12、ene marking）實(shí)驗(yàn)，為基因治療的臨床應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)，也積累了經(jīng)驗(yàn)。311990年9月14日，由美國(guó)NIH及其下屬重組DNA參謀委員會(huì)（recombinant DNA advisory committee，RAC）終于批準(zhǔn)了美國(guó)第一例臨床基因治療申請(qǐng)，患者是一個(gè)患SCID的年輕姑娘，治療取得成功。1991年，Rosenberg等人對(duì)50名黑色素瘤晚期患者進(jìn)行基因治療，也取得了一定效果。323334353637美國(guó)是世界上最早開展基因治療的國(guó)家，也是目前開展基因治療最多的國(guó)家。此外，英國(guó)、意大利、荷蘭、日本和中國(guó)也都是世界上較早開展基因治療的國(guó)家。據(jù)統(tǒng)計(jì)，1993年美國(guó)基因治療中癌癥

13、患者為12萬(wàn)人，自身免疫疾病患者為15萬(wàn)人，病毒性疾病為30萬(wàn)人，創(chuàng)傷治愈1.2萬(wàn)人，其他遺傳疾病2000人，按每人10000美元計(jì)算，醫(yī)藥費(fèi)高達(dá)58億美元。中國(guó)1991年7月開始了基因治療的臨床研究，由復(fù)旦大學(xué)進(jìn)行的“成纖維細(xì)胞基因治療血友病B工程，1993年5月5日衛(wèi)生部藥政司公布了管理依據(jù)。38存在的問題： 如何選定并獲得用來(lái)進(jìn)行基因治療的目的細(xì)胞； 如何將經(jīng)過(guò)修正的目的細(xì)胞重新引入患者體內(nèi)； 轉(zhuǎn)入的正常基因的過(guò)量表達(dá)是否會(huì)造成新的疾?。?轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞能否在體內(nèi)進(jìn)行增殖，等等。39基因治療的方法： 體外-原位（exvivo）基因治療； 體內(nèi)（in vivo）基因治療； 反義療法（anti

14、sense）； 核酶（ribozyme）基因治療。40第二節(jié) 基因治療中的基因轉(zhuǎn)移載體要將目的基因轉(zhuǎn)移進(jìn)受體細(xì)胞，首先必須選擇適宜的基因載體。常用的方法是將病毒作為基因轉(zhuǎn)移的載體。由病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移方法有兩種： 重組反轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移； 重組DNA病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移。41下面介紹基因治療中常用的病毒載體：一、反轉(zhuǎn)錄病毒載體（retrovirus vector）二、腺病毒載體（adenovirus vector，AV vector）三、腺病毒相關(guān)病毒載體（adeno associated virus，AAV）四、重組痘苗病毒載體（vaccinia virus，VV）五、單純皰疹病毒載體（

15、herpes simplex virus，HSV）六、染色體外自主復(fù)制載體42一、反轉(zhuǎn)錄病毒載體（retrovirus vector）為單鏈正鏈RNA病毒，包括：雙表達(dá)載體（dual expression vector，DE vector）內(nèi)部啟動(dòng)子載體（internal promoter vector，IP vector）自失活載體43反轉(zhuǎn)錄病毒載體作為基因轉(zhuǎn)移的載體具有以下優(yōu)點(diǎn)： 能穩(wěn)定地將DNA插到宿主基因組的隨機(jī)位點(diǎn)上，對(duì)宿主基因來(lái)說(shuō)，整合是隨機(jī)的，而對(duì)病毒基因組來(lái)說(shuō)，整合是精確的，也就是說(shuō)整合的病毒DNA結(jié)構(gòu)是的； 能高效地感染宿主細(xì)胞，可以將遺傳信息傳遞給大量受體細(xì)胞，細(xì)胞感染率可

16、達(dá)100%； 反轉(zhuǎn)錄病毒的侵染范圍非常廣泛，可以浸染不同的生物種和細(xì)胞類型； 整合的原病毒在宿主基因組中比較穩(wěn)定，而且拷貝數(shù)目較低； 用反轉(zhuǎn)錄病毒感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞，對(duì)宿主細(xì)胞沒有毒性作用； 反轉(zhuǎn)錄病毒中包裝的外源DNA序列可以到達(dá)10 kb。 44二、腺病毒載體（adenovirus vector，AV vector）為線狀雙鏈DNA病毒。45腺病毒載體作為基因治療載體的優(yōu)點(diǎn)： 比較平安，在美國(guó)已使用20年，無(wú)致病、致癌、致畸作用； 其宿主細(xì)胞范圍較廣，能感染復(fù)制分裂及不復(fù)制分裂的細(xì)胞，如神經(jīng)細(xì)胞； 其可以在呼吸道和腸道中繁殖，因而不僅可以通過(guò)靜脈注射的方式進(jìn)行基因治療，還可以通過(guò)口服、噴霧、

17、氣管內(nèi)滴注等方法； 腺病毒載體中插入的外源基因可達(dá)7.5 kb； 腺病毒容易制備、純化和濃縮，能夠滿足基因治療的臨床需要； 腺病毒的基因結(jié)構(gòu)與功能及其生活史目前了解較為清楚，用它作載體治療比較容易控制。46三、腺病毒相關(guān)病毒載體（adeno associated virus，AAV）為正鏈DNA或負(fù)鏈DNA形成雙鏈DNA。47優(yōu)越性： 腺病毒相關(guān)病毒的反向末端重復(fù)序列中沒有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件，這樣可以減少利用這種載體進(jìn)行基因治療時(shí)激活原癌基因的可能性； 其宿主細(xì)胞范圍較廣，且能夠形成慢性感染； 其整合入宿主細(xì)胞染色體中時(shí)發(fā)生位點(diǎn)特異性整合，從而可以為轉(zhuǎn)入的外源基因提供較為穩(wěn)定的染色體環(huán)境，有利于外源

18、基因的表達(dá)； 其熱穩(wěn)定性較好，而作為輔助病毒的腺病毒，則能在60被滅活； 其平安性較好，其本身不具有致病性。 4849四、重組痘苗病毒載體（vaccinia virus，VV）基因組大小為187 kb，為雙鏈DNA病毒。優(yōu)點(diǎn)： 宿主細(xì)胞廣泛； 既能感染分裂細(xì)胞，又能感染非分裂細(xì)胞。50五、單純皰疹病毒載體（herpes simplex virus，HSV）為雙鏈DNA病毒，基因組大小為152 kb。HSV的特點(diǎn)： 十分了解HSV的基因組序列； 可容納30 kb外源基因； 宿主細(xì)胞范圍廣泛； 重組HSV在體外培養(yǎng)能得到較高的滴度； 具有嗜神經(jīng)性，它可從外周神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，并且在神經(jīng)元中

19、潛伏下來(lái)，即病毒的局部基因保持轉(zhuǎn)錄活性，但卻不影響神經(jīng)元行使正常功能。5152 RV載體：反轉(zhuǎn)錄病毒載體； AV載體：腺病毒載體； HSV載體：?jiǎn)渭儼捳畈《据d體； AAV載體：腺病毒相關(guān)病毒載體。53六、染色體外自主復(fù)制載體前面提到的基因治療載體幾乎全部來(lái)源于動(dòng)物病毒，多數(shù)要整合入宿主細(xì)胞染色體之后才能發(fā)揮作用。隨機(jī)整合外源DNA插入的位置不同插入突變、基因失活、沉默基因激活（如原癌基因）嚴(yán)重后果。因此這些載體一般不能用于快速增殖細(xì)胞的基因治療。為克服這些缺陷，正在研究能在染色體外自主復(fù)制的載體。而很多情況下，基因治療的靶細(xì)胞正是那些快速增殖的細(xì)胞。545556 哺乳動(dòng)物人工染色體mammal

20、ian artificial chromosome，MAC，應(yīng)具備哺乳動(dòng)物染色體的全部特征，即有自主復(fù)制序列，端粒和著絲粒。迄今為止還沒有得到可用于克隆外源基因的含有哺乳動(dòng)物染色體的復(fù)制起始位點(diǎn)、端粒和著絲粒的人工染色體。 來(lái)源于EB病毒的載體EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）基因組172 kb，含有84個(gè)ORF和反向末端重復(fù)序列。EB病毒制成的載體可以在連續(xù)分裂的靶細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定存在，因而可以用于對(duì)快速增殖細(xì)胞的基因治療。57第三節(jié) 基因治療中外源基因?qū)氲幕瘜W(xué)和物理方法一、生物學(xué)方法二、化學(xué)方法三、物理方法58一、生物學(xué)方法利用病毒載體與細(xì)胞的外表受體的相互認(rèn)別把外源基因

21、轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞。以后各節(jié)中將詳細(xì)介紹。59二、化學(xué)方法 DNA介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移是指用磷酸鈣微量沉淀外源DNA，然后與靶細(xì)胞混合；靶細(xì)胞攝入沉淀物，外源基因就被結(jié)合進(jìn)核內(nèi)，與染色體發(fā)生整合。然后根據(jù)外源基因中選擇基因的特性對(duì)轉(zhuǎn)化細(xì)胞進(jìn)行篩選。 染色體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移就是先將供體細(xì)胞用秋水仙素處理使其染色體固縮、破碎，用差速離心別離法別離出染色體，然后將染色體與受體細(xì)胞混合，局部染色體被吞噬入細(xì)胞質(zhì)，斷裂成小片段后，一局部片段可以進(jìn)入核內(nèi)，與染色體發(fā)生整合?；瘜W(xué)方法轉(zhuǎn)移基因的效率很低。60三、物理方法 電穿透法是借助電流使DNA直接穿過(guò)細(xì)胞膜，從而轉(zhuǎn)入細(xì)胞中。（還未應(yīng)用到基因治療中） 顯微注射法是直接將

22、外源基因注射入細(xì)胞中，這種方法的操作難度大，只能用在易固定且個(gè)體較大的細(xì)胞上。應(yīng)用到生殖細(xì)胞涉及到倫理問題，故也不能臨床應(yīng)用到基因治療中。61第四節(jié) 基因治療的方式基因治療的靶細(xì)胞：體細(xì)胞；生殖細(xì)胞。體細(xì)胞基因療法（somatic cell gene therapy）將遺傳物質(zhì)引入人的體細(xì)胞進(jìn)行基因治療的方法為體細(xì)胞基因療法。生殖細(xì)胞基因療法（germ cell gene therapy）以生殖細(xì)胞為對(duì)象的基因治療稱為生殖細(xì)胞基因療法。美國(guó)政府在1985年已規(guī)定基因治療的研究只能限于體細(xì)胞。62目前有3種基因治療方式： 體外-原位基因治療； 體內(nèi)基因治療； 反義基因治療。63一、體外-原位基因

23、治療（ex vivo gene therapy） 從患者體內(nèi)取出帶有基因缺陷的細(xì)胞并培養(yǎng)； 通過(guò)基因轉(zhuǎn)移進(jìn)行遺傳修正； 將經(jīng)過(guò)遺傳修正的細(xì)胞進(jìn)行選擇和培養(yǎng)； 將修正后的細(xì)胞通過(guò)融合或移植的方法轉(zhuǎn)入患者體內(nèi)。64二、體內(nèi)基因治療體內(nèi)基因治療是指將具有治療功能的基因直接轉(zhuǎn)入病人的某一特定組織中。人們開始研究利用溫和病毒載體將修正基因直接運(yùn)送到人體細(xì)胞內(nèi)而進(jìn)行基因治療的方法。（注入到組織，特別是對(duì)局部治療的效果特別好。）65第五節(jié) 反義療法與RNA干預(yù)反義療法通過(guò)阻遏或降低目的基因的表達(dá)而到達(dá)治療的目的。反義療法通過(guò)引入目的基因的mRNA的反義序列而到達(dá)上述目的。當(dāng)引入的反義RNA與mRNA相配對(duì)后

24、，用于翻譯的mRNA的量就大大減少，因而合成的蛋白質(zhì)的量也相應(yīng)大大減少。引入的反義序列也可能與基因組DNA雜交，從而阻遏mRNA的產(chǎn)生，這兩種情況都會(huì)使細(xì)胞中靶基因編碼的蛋白合成大大減少。6667一、反義療法中亟待解決的問題：20世紀(jì)80年代初創(chuàng)造反義RNA技術(shù)。在原核細(xì)胞、體外培養(yǎng)細(xì)胞和植物中較成功，而在動(dòng)物上應(yīng)用基因治療的難度還存在非常大的困難。 平安性問題副作用，影響蛋白質(zhì)的正常功能。68硫代磷酸寡核昔酸是目前較為常用的一種反義藥物，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)有幾種硫代磷酸寡核昔酸在大劑量一次性給藥時(shí)可以造成受試動(dòng)物死亡。同時(shí)，注射寡核昔酸后，可引起受試動(dòng)物的白細(xì)胞總數(shù)暫時(shí)性下降，血壓、心率發(fā)生變化。此外

25、，引人的寡核昔酸可能會(huì)與蛋白質(zhì)具有親和性，從而影響蛋白質(zhì)的正常功能;另外反義藥物容易在受試動(dòng)物的肝、腎和骨髓中聚集、沉積，其長(zhǎng)期效應(yīng)目前尚不能確定。69 專一性問題要求在某些特定的器官、組織中表達(dá)，不能干擾正常的基因表達(dá)調(diào)控。 穩(wěn)定性問題反義藥物一般都是DNA或RNA。要考慮到人體內(nèi)RNA酶和DNA酶的降解作用。70二、 反義藥物的轉(zhuǎn)移方法： 直接注射法：注射到靶細(xì)胞。 載體導(dǎo)入法：附加體（episome）載體系統(tǒng)。 受體介導(dǎo)法：受體介導(dǎo)的胞吞作用，具特異性、專一性強(qiáng)、轉(zhuǎn)移效率高。71三、 干擾RNA分子加人雙鏈RNA可以降低相應(yīng)基因的表達(dá)水平，最多可使該基因表達(dá)水平降低90%，就是說(shuō)，可以使

26、目的基因“沉默;而且這種所謂的基因“沉默是可逆的，因?yàn)镈NA并沒有發(fā)生變化。人們把這種現(xiàn)象稱為RNA干預(yù)72導(dǎo)人雙鏈RNA分子后，雙鏈RNA分子被切成2123個(gè)核昔酸長(zhǎng)的單鏈RNA片段，這些短的RNA片段結(jié)合在目的mRNA分子上并導(dǎo)致其分子斷裂。73第六節(jié) 通過(guò)核酶進(jìn)行基因治療核酶（ribozyme）是指具有催化裂解活性的RNA分子。由20世紀(jì)80年代初由兩個(gè)獨(dú)立的group發(fā)現(xiàn)，Altman和Cech于1989年獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。74一、核酶的結(jié)構(gòu)與功能：催化功能： 催化RNA的裂解； 催化RNA分子間的轉(zhuǎn)核苷酰反應(yīng)（核苷酸轉(zhuǎn)移酶活性）； 催化RNA的水解反應(yīng)（RNA限制性內(nèi)切酶活性）； 催

27、化RNA的連接反應(yīng)（RNA聚合酶活性）； 催化淀粉的分枝反應(yīng)（分枝酶活性）； 具有肽轉(zhuǎn)移酶活性； 催化氨基酸與tRNA之間的酯鍵的水解。7576二、核酶在基因治療中的作用：隨著對(duì)核酶催化活性中心二級(jí)結(jié)構(gòu)的了解，科學(xué)家們自然地想到可以人工合成核酶并將其應(yīng)用于基因治療。由于錘頭結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單，設(shè)計(jì)出的分子較小，易于應(yīng)用，因而這一結(jié)構(gòu)是目前應(yīng)用最廣的核酶。7778三、核酶的運(yùn)載系統(tǒng)：由于核酶本身是一個(gè)RNA分子，非常容易被體內(nèi)的RNase所破壞，所以核酶不能直接作為藥物來(lái)使用，因而只能通過(guò)分子生物學(xué)的方法將其轉(zhuǎn)入細(xì)胞。79要求轉(zhuǎn)入特定細(xì)胞，如治療乙肝病毒侵染而設(shè)計(jì)的核酶必須特異性地導(dǎo)入肝細(xì)胞，要

28、求高效、特異地轉(zhuǎn)運(yùn)核酶的運(yùn)載系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)肝的類病毒中帶有一種核酶，類病毒常常伴隨肝炎病毒而存在，具有非常強(qiáng)的肝細(xì)胞親和性，有可望成為運(yùn)載工具。80從理論上講，利用核酶可以區(qū)別正?；蚝桶┗蛑g小到一個(gè)核苷酸的區(qū)別。體外實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，核酶能破壞突變的癌基因ras的轉(zhuǎn)錄，因此如果能找到適宜的載體，核酶應(yīng)用于癌癥的基因治療是大有希望的。另一方法是將核酶與反義療法聯(lián)合使用，效果更好。 81四、核酶的表達(dá)載體：核酶的本質(zhì)是RNA，其表達(dá)過(guò)程不涉及到翻譯過(guò)程，因此傳統(tǒng)的表達(dá)載體就不再適用了。在核酶的表達(dá)載體中常利用核內(nèi)小RNA（snRNA）的轉(zhuǎn)錄單位來(lái)啟動(dòng)核酶的轉(zhuǎn)錄。這種轉(zhuǎn)錄單位可以保證核酶大量連續(xù)轉(zhuǎn)錄，每個(gè)

29、細(xì)胞中可積累高達(dá)106拷貝的核酶。此外，利用其他snRNA啟動(dòng)子的載體也不斷出現(xiàn)，現(xiàn)在已有人開發(fā)出用U6 snRNA啟動(dòng)子的表達(dá)載體。82利用核酶進(jìn)行基因治療的策略83利用核酶進(jìn)行基因治療具有以下優(yōu)越性： 由于核酶的本質(zhì)是RNA，RNA引起有害的免疫排斥反應(yīng)的可能性更小，從而有效地解決了引入外源蛋白可能造成的免疫排斥問題； 核酶分子都較小，易于插入表達(dá)載體中，在基因治療過(guò)程中便于操作。84第七節(jié) 癌癥的基因治療國(guó)際上已批準(zhǔn)了130多種基因治療方案，其中70%是針對(duì)癌癥。目前基因治療中常用的治療性的基因主要有以下3類： 直接殺傷或抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的基因，包括抑癌基因、癌基因的反義序列、編程性細(xì)胞死

30、亡基因等； 可提高免疫系統(tǒng)能力的基因，如細(xì)胞因子的編碼基因等； 多種藥物的耐藥性基因，轉(zhuǎn)入這種基因的主要目的是提高造血細(xì)胞及其他細(xì)胞對(duì)放療、化療及其他抗癌藥物的耐受性。85一、導(dǎo)入抑癌基因的基因治療正常細(xì)胞的癌變過(guò)程可以歸納為一系列正?；虻耐蛔兓虍惓１磉_(dá)或異常失活。兩個(gè)抑癌基因的等位基因中只要有一個(gè)有功能就可以抑制正常細(xì)胞的癌變過(guò)程，而在癌癥患者中常常是兩個(gè)抑癌基因都缺失或突變。86二、針對(duì)癌基因的基因治療在正常細(xì)胞中都有原癌基因存在。正常嚴(yán)格的精細(xì)調(diào)控。但一旦兩個(gè)等位基因中的一個(gè)發(fā)生了突變，就有可能導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。在反義療法中，癌基因常被選作為靶基因，通過(guò)適當(dāng)?shù)姆椒▽?dǎo)入癌基因的反義DNA或RNA，使之與癌基因相結(jié)合，阻斷癌基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，使癌基因產(chǎn)物大大減少?gòu)亩种颇[瘤的生長(zhǎng)。87三、 “自殺基因?qū)ⅰ白詺⒒驅(qū)爰?xì)胞的基因治療的方法最初是由Moolten提出，其原理是將一種基因轉(zhuǎn)入癌細(xì)胞，這種基因編碼的蛋白能把無(wú)害的藥物前體（prodrug）轉(zhuǎn)變?yōu)橛卸疚镔|(zhì)，從而將癌變的細(xì)胞殺死。在某些病毒中就含有能將無(wú)害的藥物前體轉(zhuǎn)變?yōu)橛卸疚镔|(zhì)的酶，這些酶由