1、病原性真菌檢驗(yàn) 臨床微生物學(xué) (第三軍醫(yī)大學(xué))ppt課件

1、弧菌和彎曲菌醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系臨床微生物及免疫學(xué)教研室井申榮.第一部分 弧 菌.概 述弧菌科Vibrionaseae包括一群氧化酶陽性、具有端極鞭毛、動(dòng)力陽性的細(xì)菌，有4個(gè)菌屬，其中，弧菌屬是一群氧化酶陽性，發(fā)酵葡萄糖，對弧菌抑制劑O/129二氨基二異丙基喋啶敏感的細(xì)菌?；【鷮?Vibrio)廣泛分布于自然界，尤以水中為多，有100多種。主要致病菌為霍亂弧菌和副溶血弧菌致病性嗜鹽菌。前者引起霍亂；后者引起食物中毒。.霍 亂 弧 菌霍亂弧菌V.cholera是人類霍亂的病原體，霍亂是一種古老且流行廣泛的烈性傳染病之一。曾在世界上引起多次大流行，主要表現(xiàn)為猛烈的嘔吐、腹瀉、失水，死亡率甚高。屬于國際檢疫的

2、烈性傳染病。.霍亂弧菌包括兩個(gè)生物型：古典生物型Classical biotype和埃爾托生物型EL-Tor bio-type。這兩種型別除個(gè)別生物學(xué)性狀稍有不同外，形狀和免疫學(xué)性根本一樣，在臨床病理及流行病學(xué)特征上沒有本質(zhì)的差別。自1817年以來，全球共發(fā)生了七次世界性大流行，前六次病原是古典型霍亂弧菌，第七次病原是埃爾托型所致。.1992年10月在印度東南部又發(fā)現(xiàn)了一個(gè)引起霍亂流行的新血清型菌株0，它引起的霍亂在臨床表現(xiàn)及傳播方式上與古典型霍亂完全一樣，但不能被01群霍亂弧菌診斷血清所凝集。該菌株在水中的存活時(shí)間較01群霍亂弧菌長，因此有能夠成為引起世界性霍亂流行的新菌株。.一、生物學(xué)性狀

3、一形狀染色霍亂弧菌呈弧形或逗點(diǎn)形狀，大小為1.42.60.50.8m。革蘭氏陰性菌，菌體一端有單根鞭毛和菌毛，無莢膜與芽胞。取霍亂病人米泔水樣糞便作活菌懸滴察看，可見細(xì)菌運(yùn)動(dòng)極為活潑，呈流星穿越運(yùn)動(dòng)。 .圖注：霍亂弧菌的鞭毛和它可溶解的鞘膜 負(fù)染，3 100 圖注：分裂中的霍亂弧菌 冰凍蝕刻，70 000 .二培育特性霍亂弧菌為需氧或兼性厭氧菌;營養(yǎng)要求不高，耐堿不耐酸，在pH8.89.0的堿性蛋白胨水或平板中生長良好。因其他細(xì)菌在這一pH不易生長，故堿性蛋白胨水可作為選擇性增殖霍亂弧菌的培育基;在堿性平板上菌落直徑為2mm，圓形，光滑，透明。 .常用的選擇培育基為硫代硫酸鹽-枸櫞酸鹽-膽鹽-

4、蔗糖瓊脂平板TCBS，霍亂弧菌在其中可構(gòu)成較大的菌落，因發(fā)酵蔗糖產(chǎn)酸而使菌落呈黃色。.三生化反響兩個(gè)生物型的霍亂弧菌都能分解甘露醇、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。緩慢發(fā)酵乳糖，不分解阿拉伯糖。氧化酶、明膠酶實(shí)驗(yàn)均陽性。能產(chǎn)生靛基質(zhì)，霍亂紅反響陽性.El Tor型霍亂弧菌與古典型霍亂弧菌生化反響有所不同El Tor型VP實(shí)驗(yàn)為陽性，能產(chǎn)生劇烈的溶血素，溶解羊紅細(xì)胞，在血平板上生長的菌落周圍出現(xiàn)明顯的透明溶血環(huán)，古典型實(shí)驗(yàn)VP實(shí)驗(yàn)為陰性，不溶解羊紅細(xì)胞。個(gè)別EL Tor型霍亂弧菌株亦不溶血。 .霍亂弧菌的抗原構(gòu)造特性O(shè)抗原H抗原屬共同抗原群特異性型特異性耐熱性100 2h四抗原性 1抗原構(gòu)造：

5、.2分群和分型：根據(jù)O抗原的特異性，可將霍亂弧菌分成個(gè)血清群。根據(jù)能否與O1抗血清凝集分兩大群， 凡能與O1群抗血清發(fā)生凝集的稱為O1群霍亂弧菌； 凡不被O1群抗血清凝集的其它血清群統(tǒng)稱為非O1群霍亂弧菌。.O1群霍亂弧菌的血清分型型別別名O抗原成份原型稻葉型InabaA、C異型小川型OgawaA、B中間型彥島型HikojimaA、B、C血清型：O1群霍亂弧菌的菌體抗原由A、B、C三個(gè)抗原成份組成.生物型：O1群霍亂弧菌有古典生物型和E1 Tor 生物型之分，兩個(gè)生物型具有一樣的血清型。我國流行以El Tor、小川型霍亂弧菌為主。噬菌體分型： 對噬菌體的敏感性進(jìn)展分型，其中較為適用的是第組和第

6、組噬菌體。.霍亂弧菌兩個(gè)生物型的鑒別性 狀古 典 型E1 Tor 型溶血1%綿羊紅細(xì)胞d血凝2.5%雞紅細(xì)胞V-P實(shí)驗(yàn)多粘菌素B敏感實(shí)驗(yàn)50U/片噬菌體組裂解106/ml噬菌體組裂解106/ml以上為陽性；以上為陰性；陽性.霍亂弧菌的變異性形態(tài)變異弧型直桿狀 多形 菌落變異S RL 溶血性變異（ El Tor型）溶血性 非溶血性 傳代 毒力變異強(qiáng)毒株 弱毒株 無毒株 血清型別變異小川型 稻葉型 五變異性：.六抵抗力霍亂弧菌古典生物型對外環(huán)境抵抗力較弱，EL-Tor生物型抵抗力較強(qiáng)?；魜y弧菌對熱、枯燥、日光、化學(xué)消毒劑和酸均很敏感，耐低溫，耐堿而不耐酸?；魜y弧菌對鏈霉素、氯霉素和四環(huán)素敏感，但E

7、l Tor生物型對一定濃度的多粘菌素B及慶大霉素有耐藥性。.二、致病性和免疫性1致病物質(zhì)1 鞭毛、菌毛、粘液素酶2 霍亂腸毒素cholera enterotoxin 霍亂腸毒素本質(zhì)是蛋白質(zhì)，不耐熱。對蛋白酶敏感而對胰蛋白酶抵抗。 該毒素屬外毒素，具有很強(qiáng)的抗原性。.霍亂腸毒素1個(gè)A亞單位毒性單位A1肽鏈具有激活腺苷酸環(huán)化酶的酶活性A2肽鏈結(jié)合B亞單位；參與轉(zhuǎn)位5個(gè)B亞單位（46）結(jié)合單位特異地識別腸上皮細(xì)胞膜上的神經(jīng)節(jié)苷脂受體.致病機(jī)理霍亂弧菌胃對酸敏感，很快被殺死腸胃酸降低或缺乏，菌體增多鞭毛、菌毛、粘液素酶絨毛上大量繁衍CT的B亞單位結(jié)合神經(jīng)節(jié)苷脂受體構(gòu)成膜通道A1肽鏈進(jìn)入細(xì)胞.ATP c

8、AMP 腸粘膜上皮細(xì)胞分泌亢進(jìn)腸液大量分泌大量體液和電解質(zhì)進(jìn)入腸腔而發(fā)生猛烈吐瀉大量脫水和失鹽發(fā)生代謝性酸中毒，血循環(huán)衰竭，甚至休克或死亡激活腺苷酸環(huán)化酶系統(tǒng).2所致疾病引起烈性腸道傳染病的霍亂，為我國的法定傳染病甲類，表現(xiàn)為猛烈的上吐下瀉，導(dǎo)致嚴(yán)重的脫水、酸中毒、痙攣、尿閉、休克和死亡。人類在自然情況下是霍亂弧菌的獨(dú)一易感者，主要經(jīng)過污染的水源或飲食物經(jīng)口傳染糞口途徑?；颊叱霈F(xiàn)上吐下瀉，瀉出物呈“米泔水樣，并含大量弧菌，此為本病典型的特征。 .3免疫性患過霍亂的人可獲得結(jié)實(shí)的免疫力，再感染者少見。病后小腸內(nèi)可出現(xiàn)分泌型lgA。.三、微生物學(xué)診斷由于霍亂流行迅速，且在流行期間發(fā)病率及死亡率均高

9、，危害極大，因此早期迅速和正確的診斷，對治療和預(yù)防本病的蔓延有艱苦意義。一標(biāo)本采集： 標(biāo)本以糞便為主，普通米泔水樣便采取13ml，成形便采取蠶豆大小。在某些情況下，亦可采取嘔吐物和尸體腸內(nèi)容物作檢材。 .檢驗(yàn)程序.三檢驗(yàn)方法及鑒定1直接鏡檢：1動(dòng)力察看：采取病人“米泔水樣大便或嘔吐物制成懸滴片，察看細(xì)菌動(dòng)力，可見流星或穿越狀動(dòng)力的細(xì)菌。2制動(dòng)實(shí)驗(yàn)： 標(biāo)本， 霍亂多價(jià)診斷血清效價(jià)1：64，用暗視野鏡察看，3分鐘內(nèi)運(yùn)動(dòng)被抑制的即為陽性， 此法優(yōu)點(diǎn)是快速而特異操作簡便，但必需有數(shù)量較多的弧菌才檢出。.3涂片染色：革蘭氏染色陰性并成魚群狀陳列的弧菌。.2快速診斷：1 免疫熒光菌球法：將標(biāo)本接種于含有霍

10、亂弧菌熒光抗體的堿性蛋白胨水中，經(jīng)3746h，如有霍亂弧菌，在熒光顯微鏡下可見發(fā)熒光的菌球。本法適用于做大量標(biāo)本的初篩。2 SPA協(xié)同凝集實(shí)驗(yàn)：以霍亂弧菌IgG型抗體與SPA陽性葡萄球菌結(jié)協(xié)作為試劑，與米泔水樣便或增菌液作玻片凝集，立刻出現(xiàn)明顯凝集者為陽性。.3細(xì)菌分別培育1 直接分別培育：分別用的培育基有強(qiáng)、弱2種選擇培育基。弱選擇培育基：堿性瓊脂和堿性膽鹽瓊脂。強(qiáng)選擇培育基：常用的有慶大霉素瓊脂、4號瓊脂和TCBS瓊脂等。現(xiàn)多采用堿性蛋白胨水增菌，再用強(qiáng)選擇培育基進(jìn)展分別。 .4 鑒定： 根據(jù)霍亂弧菌在各種選擇培育基上的特點(diǎn)，挑選可疑菌落進(jìn)展鑒定。鑒定以血清學(xué)玻片凝集為主，結(jié)合形狀學(xué)、生化

11、反響作出判別。1 玻片凝集實(shí)驗(yàn)：從分別培育基上挑取可疑菌落于霍亂弧菌多價(jià)診斷血清作玻片凝集實(shí)驗(yàn)。診斷血清應(yīng)稀釋成1:32-1:64的效價(jià)運(yùn)用，立刻出現(xiàn)凝集者為陽性，同時(shí)設(shè)生理鹽水和陽性細(xì)菌株對照。 .2 形狀學(xué)檢查：取純培育物涂片革蘭氏染色，察看菌體形狀及染色性。用懸滴法或半固體穿刺法檢測動(dòng)力。3 生化反響：霍亂弧菌氧化酶實(shí)驗(yàn)、靛基質(zhì)實(shí)驗(yàn)、粘絲實(shí)驗(yàn)和霍亂紅實(shí)驗(yàn)均陽性。 粘絲實(shí)驗(yàn)：用于測定霍亂弧菌構(gòu)成粘絲的特性。將0.5去氧膽酸鈉水溶液于霍亂弧菌混勻制成濃重菌液，1min內(nèi)懸液由混變清，并變得粘稠，以接種環(huán)挑取時(shí)可以拉出絲來?；魜y弧菌古典生物型和El Tor生物型均呈陽性。 . 霍亂紅實(shí)驗(yàn)：出現(xiàn)

12、薔薇色，為霍亂紅實(shí)驗(yàn)陽性。由于霍亂弧菌和其他弧菌均有此種反響，故無特異性?；魜y弧菌含有色氨酸酶，能分解色氨酸產(chǎn)生吲哚，霍亂弧菌液能復(fù)原硝酸鹽為亞硝酸鹽，因此當(dāng)霍亂弧菌培育在含有硝酸鹽成分的蛋白胨水中，所產(chǎn)生的亞硝酸鹽可與吲哚結(jié)合成亞硝酸吲哚，滴加濃硫酸即可出現(xiàn)薔薇色，稱為霍亂紅實(shí)驗(yàn)陽性 O/129敏感實(shí)驗(yàn)：將O/1292，4二氨基6，7二異丙基喋啶藥敏紙片10150g貼在接種有待測菌的瓊脂平板上作紙片分散實(shí)驗(yàn)，凡藥物紙片周圍出現(xiàn)抑菌環(huán)者為敏感。.4 霍亂弧菌的分型鑒別實(shí)驗(yàn)：血清分型：用小川型和稻葉型單價(jià)診斷血清作玻片凝集。與小川型血清凝集而與稻葉型血清不凝集者為小川型，反之為稻葉型。在兩個(gè)單價(jià)

13、血清中均有明顯凝集者為彥島型。生物型別的鑒定：目前，兩型主要依托第組霍亂噬菌體裂解實(shí)驗(yàn)進(jìn)展鑒別，并輔以多粘菌素敏感實(shí)驗(yàn)、雞紅細(xì)胞凝集實(shí)驗(yàn)、VP實(shí)驗(yàn)和溶血實(shí)驗(yàn)。 . 第組霍亂噬菌體裂解實(shí)驗(yàn)： 第組霍亂噬菌體常規(guī)稀釋液106/ml普通僅裂 解古典型，而不裂解El Tor型。 多粘菌素B敏感實(shí)驗(yàn)： 取被檢菌2-3h肉湯培育物點(diǎn)種到含藥營養(yǎng)瓊脂平板上多粘菌素B50Uml,37培育24h，El Tor生物型生長，而古典型敏感。. 雞紅細(xì)胞凝集實(shí)驗(yàn)：在玻片上滴加生理鹽水一滴，取被檢菌18-24h培育物少許在鹽水中制成濃重菌懸液，然后加一滴2.5雞紅細(xì)胞懸液，充分混勻，1min內(nèi)出現(xiàn)凝集者為陽性，紅細(xì)胞呈均

14、勻分散者為陰性。El Tor生物型為陽性，古典型為陰性。.鑒定要點(diǎn)：確診O1群霍亂弧菌必需具備的條件：1、涂片為革蘭氏陰性弧菌或桿菌；2、TCBS等選擇培育基上典型的菌落特征；3、動(dòng)力陽性；4、O1群霍亂弧菌診斷血清凝集實(shí)驗(yàn)陽性。.四、防治原那么必需貫徹預(yù)防為主。人群的菌苗預(yù)防接種，可獲良好效果，治療主要為及時(shí)補(bǔ)充液體和電解質(zhì)及運(yùn)用抗菌藥物如四環(huán)素、鏈霉素、氯霉素、強(qiáng)力霉素及氟哌酸類抗生素藥物。 .第二部分 彎曲菌屬.彎曲菌屬(Campylobacter)細(xì)菌是一類微需氧、不分解糖類、氧化酶陽性、菌體彎曲呈逗點(diǎn)狀、S型或螺旋狀、有動(dòng)力的革蘭氏陰性菌。對人類致病的主要是空腸彎曲菌和胎兒彎曲菌胎兒

15、亞種，前者是人類腹瀉最常見的病原菌之一，后者在免疫功能低下時(shí)可引起敗血癥、腦膜炎等。本節(jié)主要以空腸彎曲菌引見本屬的生物學(xué)特性和檢驗(yàn)方法.一、生物學(xué)性狀一形狀與染色 空腸彎曲菌 C.jejuni菌體輕度彎曲似逗點(diǎn)狀，長1.55 m，寬0.20.8 m。菌體一端或兩端有鞭毛，運(yùn)動(dòng)活潑，在暗視野鏡下察看似飛蠅。有莢膜，不構(gòu)成芽胞。革蘭氏陰性。圖注：空腸彎曲菌的兩端單鞭毛 負(fù)染，21 000 .二培育特性為微需氧菌，在含2.55%氧和10%CO2的環(huán)境中生長最好。最適溫度為3742。在正常大氣或無氧環(huán)境中均不能生長。本菌營養(yǎng)要求高，需參與血液、血清才干生長。在凝固血清和血瓊脂培育基上培育36小時(shí)可見無

16、色半透明毛玻璃樣小菌落，單個(gè)菌落呈中心凸起，周邊不規(guī)那么，無溶血景象。.三生化反響空腸彎曲生化反響不活潑，不發(fā)酵糖類，不分解尿素，不液化明膠，靛基質(zhì)陰性?？蓮?fù)原硝酸鹽，氧化酶和過氧化氫酶為陽性。甲基紅和VP實(shí)驗(yàn)陰性；枸椽酸鹽培育基中不生長。 .四抵抗力抵抗力不強(qiáng)，易被枯燥、直射日光及弱消毒劑所殺滅，565分鐘可被殺死。對紅霉素、新霉素、慶大霉素、四環(huán)素、氯霉素、卡那霉素等抗生素敏感。但近年發(fā)現(xiàn)了不少耐藥菌株。 .五抗原構(gòu)造本菌抗原構(gòu)造與腸道桿菌一樣具有O、H和K抗原。根據(jù)O抗原，可把空腸彎曲菌分成45個(gè)以上血清型。 .二、致病性與免疫性空腸彎曲菌是多種動(dòng)物如牛、羊、狗及禽類的正常寄居菌。污染食物和飲水，可引起人類急性腸炎和食物中毒，其致病要素與腸毒素、內(nèi)毒素、細(xì)胞毒素、侵襲力有關(guān)。感染后能產(chǎn)生特異性血清抗體，.三、微生物學(xué)診斷一標(biāo)本采集： 取腹瀉病人新穎糞便或肛拭子立刻送檢。如不能及時(shí)送檢，應(yīng)將標(biāo)本接種于卡布運(yùn)送培育基。二檢驗(yàn)程序：.三檢驗(yàn)方法及鑒定1直接涂片 1懸滴標(biāo)本檢查： 顯微鏡下察看有無投鏢式或螺旋狀運(yùn)動(dòng)的細(xì)菌。腦脊液制成涂片作懸滴檢查。 2革蘭氏染色檢查： 為革蘭氏陰性，逗點(diǎn)狀、S形或螺旋狀小桿菌。.2分別培育：選擇培育基分別 接種于具有高度選擇性的平板培育布氏菌血瓊脂抗性分別培育基，然后放玻璃缸內(nèi)內(nèi)含85%N2，10%CO2，5%O2，置42孵箱