酶的分離純化和催化反應(yīng)

1、酶的分離純化和催化反應(yīng)Contents of chapter 31、酶的提取與分離純化技術(shù)路線2、細胞破碎3、酶的提取4、酶的分離方法5、酶的組合分離純化策略6、酶的濃縮、干燥與結(jié)晶3.1 酶的提取、分離純化技術(shù)路線細胞破碎酶提取酶分離純化酶濃縮酶貯存動物、植物或微生物細胞發(fā)酵液離心分離，過濾分離，沉淀分離，層析分離，電泳分離，萃取分離，結(jié)晶分離等。酶的純化過程，約可分為三個階段：(1) 粗蛋白質(zhì) (crude protein): 采樣 均質(zhì)打破細胞 抽出全蛋白，多使用 鹽析沉淀法；可以粗略去除蛋白質(zhì)以外的物質(zhì)。(2) 部分純化 (partially purified): 初步的純化，使用各鐘

2、 柱層析法。(3) 均質(zhì)酶 (homogeneous): 目標酶的進一步精制純化，可用制備式電泳 或 HPLC。酶分離純化不同階段3.2 細胞破碎許多酶存在于細胞內(nèi)。為了提取這些胞內(nèi)酶，首先需要對細胞進行破碎處理。1）機械破碎2）物理破碎3）化學(xué)破碎4）酶解破碎JY92-II D超聲波細胞粉碎機細胞破碎珠高壓細胞破碎機DY89-I型 電動玻璃勻漿機機械破碎搗碎法研磨法勻漿法 物理破碎溫度差破碎法壓力差破碎法超聲波破碎法 化學(xué)破碎有機溶劑：甲苯、丙酮丁醇、氯仿表面活性劑：Triton、Tween酶促破碎自溶法外加酶制劑法通過機械運動產(chǎn)生的剪切力，使組織、細胞破碎。通過各種物理因素的作用，使組織、

3、細胞的外層結(jié)構(gòu)破壞，而使細胞破碎。通過各種化學(xué)試劑對細胞膜的作用，而使細胞破碎通過細胞本身的酶系或外加酶制劑的催化作用，使細胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞，而達到細胞破碎細胞破碎方法及其原理酶的提取是指在一定的條件下，用適當?shù)娜軇┗蛉芤禾幚砗冈?，使酶充分溶解到溶劑或溶液中的過程。也稱為酶的抽提。酶提取時首先應(yīng)根據(jù)酶的結(jié)構(gòu)和溶解性質(zhì)，選擇適當?shù)娜軇?。一般說來，極性物質(zhì)易溶于極性溶劑中，非極性物質(zhì)易溶于非極性的有機溶劑中，酸性物質(zhì)易溶于堿性溶劑中，堿性物質(zhì)易溶于酸性溶劑中。酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀堿、稀鹽溶液等進行提取，有些酶與脂質(zhì)結(jié)合或含有較多的非極性基團，則可用有機溶劑提取。 3.3 酶的

4、提取提高溫度，降低溶液粘度、增加擴散面積、縮短擴散距離，增大濃度差等都有利于提高酶分子的擴散速度，從而增大提取效果。 為了提高酶的提取率并防止酶的變性失活，在提取過程中還要注意控制好溫度、pH值等提取條件。酶的主要提取方法提取方法使用的溶劑或溶液提取對象鹽溶液提取0.020.5mol/L的鹽溶液用于提取在低濃度鹽溶液中溶解度較大的酶酸溶液提取PH26的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且穩(wěn)定性較好的酶堿溶液提取PH812的水溶液用于提取在稀堿溶液中溶解度大且穩(wěn)定性較好的酶有機溶劑提取可與水混溶的有機溶劑用于提取那些與脂質(zhì)結(jié)合牢固或含有較多非極性基團的酶大多數(shù)蛋白類酶都溶于水，而且在低濃度的鹽

5、存在的條件下，酶的溶解度隨鹽濃度的升高而增加，這稱為鹽溶現(xiàn)象。 3.4 酶的分離方法1、沉淀分離2、離心分離3、過濾與膜分離4、層析分離5、電泳分離6、萃取分離1、沉淀分離沉淀分離是通過改變某些條件或添加某種物質(zhì)，使酶的溶解度降低，而從溶液中沉淀析出，與其它溶質(zhì)分離的技術(shù)過程。沉淀分離方法分離原理 鹽析沉淀法利用不同蛋白質(zhì)在不同的鹽濃度條件下溶解度不同的特性，通過在酶液中添加一定濃度的中性鹽，使酶或雜質(zhì)從溶液中析出沉淀，從而使酶與雜質(zhì)分離等電點沉淀法利用兩性電解質(zhì)在等電點時溶解度最低，以及不同的兩性電解質(zhì)有不同的等電點這一特性，通過調(diào)節(jié)溶液的pH值，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離有機溶

6、劑沉淀法利用酶與其它雜質(zhì)在有機溶劑中的溶解度不同，通過添加一定量的某種有機溶劑，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離復(fù)合沉淀法在酶液中加入某些物質(zhì)，使它與酶形成復(fù)合物而沉淀下來，從而使酶與雜質(zhì)分離選擇性變性沉淀法選擇一定的條件使酶液中存在的某些雜質(zhì)變性沉淀，而不影響所需的酶，從而使酶與雜質(zhì)分離在鹽濃度達到某一界限后，酶的溶解度隨鹽濃度升高而降低，這稱為鹽析現(xiàn)象。 在一定的溫度和pH值條件下（為常數(shù)），通過改變離子強度使不同的酶或蛋白質(zhì)分離的方法稱為Ks分段鹽析；而在一定的鹽和離子強度的條件下（KsI為常數(shù)），通過改變溫度和pH值，使不同的酶或蛋白質(zhì)分離的方法，稱為分段鹽析。 在蛋白質(zhì)的鹽析中

7、，通常采用的中性鹽有硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鉀、硫酸鎂、氯化鈉和磷酸鈉等。其中以硫酸銨最為常用。這是由于硫酸銨在水中的溶解度大而且溫度系數(shù)小，不影響酶的活性，分離效果好，而且價廉易得。然而用硫酸銨進行鹽析時，緩沖能力較差，而且銨離子的存在會干擾蛋白質(zhì)的測定，所以有時也用其它中性鹽進行鹽析。在鹽析時，溶液中硫酸銨的濃度通常以飽和度表示。 有機溶劑之所以能使酶沉淀析出。主要是由于有機溶劑的存在會使溶液的介電常數(shù)降低。例如，20時水的介電常數(shù)為80，而82乙醇水溶液的介電常數(shù)為40。溶液的介電常數(shù)降低，就使溶質(zhì)分子間的靜電引力增大，互相吸引而易于凝集，同時，對于具有水膜的分子來說，有機溶劑與水互相作用，

8、使溶質(zhì)分子表面的水膜破壞，也使其溶解度降低而沉淀析出。 常用于酶的沉淀分離的有機溶劑有乙醇、丙酮、異丙醇、甲醇等 2、離心分離 離心分離是借助于離心機旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，使不同大小、不同密度的物質(zhì)分離的技術(shù)過程。 在離心分離時，要根據(jù)欲分離物質(zhì)以及雜質(zhì)的顆粒大小、密度和特性的不同，選擇適當?shù)碾x心機、離心方法和離心條件。常速離心機又稱為低速離心機, 其最大轉(zhuǎn)速在8000 r/min以內(nèi)，相對離心力（RCF）在1104 g 以下，在酶的分離純化過程中，主要用于細胞、細胞碎片和培養(yǎng)基殘渣等固形物的分離。也用于酶的結(jié)晶等較大顆粒的分離。 高速離心機的最大轉(zhuǎn)速為（1）104 r/min ，相對離心力達到

9、 11041105 g ，在酶的分離中主要用于沉淀、細胞碎片和細胞器等的分離。為了防止高速離心過程中,溫度升高而造成酶的變性失活,有些高速離心機裝設(shè)有冷凍裝置,謂之高速冷凍離心機。超速離心機的最大轉(zhuǎn)速達 12)104 r/min，相對離心力可以高達 5105 g甚至更高。超速離心主要用于DNA、RNA、蛋白質(zhì)等生物大分子以及細胞器、病毒等的分離純化；樣品純度的檢測；沉降系數(shù)和相對分子質(zhì)量的測定等。超速離心機按照其用途可以分為制備用超速離心機、分析用超速離心機和分析-制備兩用超速離心機3種 蛋白質(zhì)分子在離心時，其 分子量、分子密度、組成、形狀 等，均會影響其沉降速率，沉降係系數(shù) 即用來描述此沉降

10、性質(zhì)； 其單位為 S (Svedberg unit)。每一種的沉降系數(shù)與其分子密度或分子量成正比。 不同沉降系數(shù)的蛋白質(zhì)，可利用超高速離心法，在密度梯度中作分離。3、過濾與膜分離過濾是借助于過濾介質(zhì)將不同大小、不同形狀的物質(zhì)分離的技術(shù)過程。過濾介質(zhì)多種多樣，常用的有濾紙、濾布、纖維、多孔陶瓷、燒結(jié)金屬和各種高分子膜等，可以根據(jù)需要選用。過濾非膜過濾：采用高分子膜以外的物質(zhì)作為過濾介質(zhì) 膜過濾：采用各種高分子膜為過濾介質(zhì) 過濾的分類及其特性(根據(jù)過濾介質(zhì)截留的物質(zhì)顆粒大小不同 ) 類別截留顆粒大小截留的主要物質(zhì)過濾介質(zhì)粗濾 2m酵母、霉菌、動物細胞、植物細胞、固形物等濾紙、濾布、纖維多孔陶瓷、燒

11、結(jié)金屬等微濾0.22m細菌、灰塵等微濾膜、微孔陶瓷超濾200.2m病毒、生物大分子等超濾膜反滲透20 (40,000) 壓力差，100kPa 篩分 超濾UF 120 (10,000-40,000) 壓力差，100kPa 篩分 納濾NF 1 (1001000) 壓力差，100) 壓力差，1000kPa 優(yōu)先吸附、溶解擴散 四種常用膜分離技術(shù)的基本特征 四種常用膜分離過程的截留特性4、層析分離層析技術(shù)，亦稱色譜技術(shù)，是一種物理的分離方法。它是利用混合物中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)的差別，使各組分以不同程度分布在兩個相中，其中一個相為固定的(稱為固定相)，另一個相則流過此固定相(稱為流動相)并使各組分以不

12、同速度移動，從而達到分離。層析分離方法 層析方法分離依據(jù)吸附層析利用吸附劑對不同物質(zhì)的吸附力不同而使混合物中各組分分離分配層析利用各組分在兩相中的分配系數(shù)不同，而使各組分分離離子交換層析利用離子交換劑上的可解離基團（活性基團）對各種離子的親和力不同而達到分離目的凝膠層析以各種多孔凝膠為固定相，利用流動相中所含各種組分的相對分子質(zhì)量不同而達到物質(zhì)分離親和層析利用生物分子與配基之間所具有的專一而又可逆的親和力，使生物分子分離純化層析聚焦將酶等兩性物質(zhì)的等電點特性與離子交換層析的特性結(jié)合在一起，實現(xiàn)組分分離吸附層析是利用吸附劑對不同物質(zhì)的吸附力不同而使混合物中各組分分離的方法。吸附層析是各種層析技術(shù)

13、中應(yīng)用最早的技術(shù)。吸附劑來源豐富、價格低廉、可再生，吸附設(shè)備簡單。吸附層析通常采用柱型裝置，將吸附劑裝在吸附柱中，裝置成吸附層析柱。層析時，欲分離的混合溶液自柱頂加入，當樣品液全部進入吸附層析柱后，再加入洗脫劑解吸洗脫。在洗脫時，層析柱內(nèi)不斷發(fā)生解吸、吸附、再解吸、再吸附的過程。 溶劑洗脫法置換洗脫法前緣洗脫法 分配層析分配層析是利用各組分在兩相中的分配系數(shù)不同，而使各組分分離的方法。分配系數(shù)是指一種溶質(zhì)在兩種互不相溶的溶劑中溶解達到平衡時，該溶質(zhì)在兩項溶劑中的濃度的比值。在層析條件確定后，層析系數(shù)是一常數(shù)。在分配層析中，通常采用一種多孔性固體支持物（如濾紙、硅藻土、纖維素等）吸著一種溶劑為固

14、定相，這種溶劑在層析過程中始終固定在多孔支持物上。另一種與固定相溶劑互不相溶的溶劑可沿著固定相流動，稱為流動相。當某溶質(zhì)在流動相的帶動流經(jīng)固定相時，該溶質(zhì)在兩相之間進行連續(xù)的動態(tài)分配。 紙上層析分配薄層層析分配氣相層析 離子交換層析是利用離子交換劑上的可解離基團（活性基團）對各種離子的親和力不同而達到分離目的的一種層析分離方法。離子交換劑是含有若干活性基團的不溶性高分子物質(zhì)。通過在不溶性高分子物質(zhì)（母體）上引入若干可解離基團（活性基團）而制成。按活性基團的性質(zhì)不同，離子交換劑可以分為陽離子交換劑和陰離子交換劑。由于酶分子具有兩性性質(zhì)，所以可用陽離子交換劑，也可用陰離子交換劑進行酶的分離純化。

15、凝膠層析又稱為凝膠過濾，分子排阻層析，分子篩層析等。是指以各種多孔凝膠為固定相，利用流動相中所含各種組分的相對分子質(zhì)量不同而達到物質(zhì)分離的一種層析技術(shù)。凝膠層析柱中裝有多孔凝膠，當含有各種組分的混合溶液流經(jīng)凝膠層析柱時，大分子物質(zhì)由于分子直徑大，不能進入凝膠的微孔，只能分布于凝膠顆粒的間隙中，以較快的速度流過凝膠柱。較小的分子能進入凝膠的微孔內(nèi)，不斷地進出于一個個顆粒的微孔內(nèi)外，這就使小分子物質(zhì)向下移動的速度比大分子的速度慢，從而使混合溶液中各組分按照相對分子質(zhì)量由大到小的順序先后流出層析柱，而達到分離的目的。常用的凝膠：葡聚糖凝膠瓊脂凝膠與瓊脂糖凝膠聚丙烯酰胺凝膠 親和層析是利用生物分子與配

16、基之間所具有的專一而又可逆的親和力，而使生物分子分離純化的技術(shù)。酶與底物,酶與競爭性抑制劑,酶與輔助因子,抗原與抗體，酶RNA與互補的RNA分子或片段,RNA與互補的DNA分子或片段等之間，都是具有專一而又可逆親和力的生物分子對。故此,親和層析在酶的分離純化中有重要應(yīng)用.親和層析的四個要素常用的親和介質(zhì)及專一性配體根據(jù)欲分離組分與配基的結(jié)合特性,親和層析可以分為：共價親和層析疏水層析金屬離子親和層析免疫親和層析染料親和層析凝集素親和層析 5、電泳分離帶電粒子在電場中向著與其本身所帶電荷相反的電極移動的過程稱為電泳。電泳方法按其使用的支持體的不同，可以分為： 紙電泳 薄層電泳 薄膜電泳 凝膠電泳

17、 自由電泳 等電聚焦電泳 顆粒在電場中的移動速度主要決定于其本身所帶的凈電荷量，同時受顆粒形狀和顆粒大小的影響。此外，還受到電場強度、溶液pH值、離子強度及支持體的特性等外界條件的影響。 6、萃取分離萃取分離是利用物質(zhì)在兩相中的溶解度不同而使其分離的技術(shù)。萃取分離中的兩相一般為互不相溶的兩個液相。有時也可采用其它流體。按照兩相的組成不同，萃取可以分為：有機溶劑萃取雙水相萃取超臨界萃取反膠束萃取 各種雙水相系統(tǒng)聚合物P 聚合物Q或鹽聚丙二醇甲基聚丙二醇，聚乙二醇，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，羥丙基葡聚糖，葡聚糖聚乙二醇聚乙烯醇，葡聚糖，聚蔗糖甲基纖維素羥甲基葡聚糖，葡聚糖乙基羥乙基纖維素葡聚糖羥丙

18、基葡聚糖葡聚糖聚蔗糖葡聚糖聚乙二醇硫酸鎂，硫酸銨，硫酸鈉，甲酸鈉，酒石酸鉀鈉某些超臨界流體的超臨界點和超臨界密度流體名稱臨界溫度()臨界壓力(Mpa)臨界密度（g/ml）乙烷C2H632.34.880.203丙烷C3H896.94.260.220丁烷C4H10152.03.800.228戊烷C5H12296.73.280.232乙烯C2H49.95.120.227氨NH3132.411.280.236二氧化碳 CO231.17.380.46二氧化硫 SO2157.67.880.525水H2O374.322.110.326笑氣N2O36.57.170.451氟里昂C28.83.900.578本節(jié)

19、目錄3.5 酶的組合分離純化策略Resolution（分辨率）Speed（速度）Capacity（容量）Recovery（回收率）設(shè)計分離純化工藝的基本要求3.6 酶的濃縮、干燥與結(jié)晶濃縮與干燥都是酶與溶劑（通常是水）分離的過程。在酶的分離純化過程中是一個重要的環(huán)節(jié)。離心分離、過濾與膜分離、沉淀分離、層析分離等都能起到濃縮作用。用各種吸水劑，如硅膠、聚乙二醇、干燥凝膠等吸去水分，也可以達到濃縮效果。蒸發(fā)濃縮是通過加熱或者減壓方法使溶液中的部分溶劑汽化蒸發(fā)，使溶液得以濃縮的過程。由于酶在高溫條件下不穩(wěn)定，容易變性失活，故酶液的濃縮通常采用真空濃縮。即在一定的真空條件下，使酶液在60以下進行濃縮。

20、在固體酶制劑的生產(chǎn)過程中，為了提高酶的穩(wěn)定性，便于保存、運輸和使用，一般都必須進行干燥。常用的干燥方法有：真空干燥冷凍干燥噴霧干燥氣流干燥吸附干燥結(jié)晶是溶質(zhì)以晶體形式從溶液中析出的過程。酶的結(jié)晶是酶分離純化的一種手段。它不僅為酶的結(jié)構(gòu)與功能等的研究提供了適宜的樣品，而且為較高純度的酶的獲得和應(yīng)用創(chuàng)造了條件。酶在結(jié)晶之前，酶液必須經(jīng)過純化達到一定的純度。如果酶液純度太低，不能進行結(jié)晶。通常酶的純度應(yīng)當在50%以上，方能進行結(jié)晶?？偟内厔菔敲傅募兌仍礁?，越容易進行結(jié)晶。要說明的是，不同的酶對結(jié)晶時的純度要求不同。 有些酶在純度達到50%時就可能結(jié)晶，而有些酶在純度很高的條件下也無法析出結(jié)晶。所以酶

21、的結(jié)晶并非達到絕對純化，只是達到相當?shù)募兌榷选?鹽析結(jié)晶有機溶劑結(jié)晶透析平衡結(jié)晶 等電點結(jié)晶 第四章 生物催化反應(yīng)類型生物催化反應(yīng)的選擇性1、化學(xué)選擇性 化學(xué)選擇性是指在一定的反應(yīng)條件下，優(yōu)先對底物分子中某一功能基團起化學(xué)反應(yīng)?；瘜W(xué)催化反應(yīng)中，硼氫化鈉（NaBH4）可將酮酯分子中的酮基還原胃仲醇，而對酯基中羰基則不起反應(yīng)，催化劑硼氫化鈉能實現(xiàn)化學(xué)選擇，還原產(chǎn)物仲醇是消旋體。生物催化發(fā)同樣可以實現(xiàn)化學(xué)選擇性反應(yīng)，且可具有一定程度得對映體選擇性。2、區(qū)域選擇性 區(qū)域選擇性是指在一定的反應(yīng)條件下，優(yōu)先選擇與分子內(nèi)不同位置的某一相同功能基團起化學(xué)反應(yīng)，生成某一中異構(gòu)體，而另一種異構(gòu)體則很少生成。酶反

22、應(yīng)幾乎具有完全的區(qū)域選擇性。酶可以選擇性水解底物分子中不同位置的酯基。不同的酶起選擇性不同。 3、立體選擇性 立體異構(gòu)體是指由分子中原子在空間上排列方式不同所產(chǎn)生的異構(gòu)體，它可分為順反異構(gòu)體，對映異構(gòu)體和構(gòu)象異構(gòu)體3種，也可分為對映異構(gòu)體和非對映異構(gòu)體兩大類。 對映選擇性是指反應(yīng)優(yōu)先生成一對對映異構(gòu)體中的某一種?；蛘呤欠磻?yīng)優(yōu)先消耗對映異構(gòu)體反應(yīng)物中的某一種對映體。 酶催化反應(yīng)具有顯著的立體選擇性。一、生物催化反應(yīng)與有機化學(xué)合成通常用于生物催化反應(yīng)的酶制劑可分為純酶、粗酶或含有某種酶的完整微生物細胞。酶分子的狀態(tài)可以是游離酶，也可是固定化狀態(tài)，為了提高酶制劑的穩(wěn)定性和催化活性，也可以對酶制劑本身

23、進行修飾和改進。酶幾乎能催化各種類型的化學(xué)反應(yīng)。生物催化劑的有機化學(xué)反應(yīng)二、生物催化的水解反應(yīng) 水解酶的種類。例如：酯酶，肪脂酶，蛋白酶，糖苷鏈水解酶（淀粉酶、纖維素酶和溶菌酶）等，此類酶對底物性不太嚴格，故對有機合成來說是一類特別有用的酶。 生物催化水解反應(yīng)可以廣泛用于手性化合物的拆分，水解酶的催化下，在低水活度的溶劑體系中可以進行酯或酰胺的合成反應(yīng)?？蓮V泛應(yīng)用于酯、內(nèi)酯、苷、酰胺和內(nèi)酰胺等化合物的水解，且水解作用具有對映體有選擇性。 生物催化的酯水解反應(yīng) 許多蛋白水解酶能選擇性的水解由L氨基酸形成的酯，對D氨基酸所形成的酯則不起催化作用，可以將消旋化的氨基酸酯進行酶法拆分。生物催化的肽鏈水

24、解反應(yīng) 多肽鏈的完全水解一般是應(yīng)用酸催化水解法。但為了從多肽鏈中得到某一個肽鏈片斷，可應(yīng)用肽鏈內(nèi)切酶選擇性水解多肽鏈，同時亦可用肽鏈外切酶選擇性的將多肽鏈C端氨基酸殘基酸或殘基水解下來。生物催化的糖苷鏈水解反應(yīng)淀粉的酶水解直鏈淀粉是由D葡萄糖分子通過（1、4）糖苷鏈連接而成的鏈狀化合物，支鏈淀粉是由多個（1，4）糖苷鏈直鏈通過（1，6）糖苷鏈連接而成的樹枝狀化合物。淀粉水解酶中重要的是直鏈淀粉水解酶，主要包括淀粉酶、淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和（1，6）糖苷酶4種。各種酶的水解位點如下圖。蔗糖的水解酶蔗糖是二糖的典型代表。應(yīng)用葡萄糖苷酶可以將蔗糖水解成葡萄糖和水果糖。纖維素的酶水解纖維素是由D葡萄糖通過（1，4）糖苷鏈連接而成的長鏈大分子。纖維素酶可特異性的水解（1，4）糖苷鏈，將纖維素水解成葡萄糖。生物催化的酰胺水解反應(yīng)生物催化酰胺水解在內(nèi)酰胺環(huán)類抗生素制藥工作中非常重要。例如：將青霉素和頭孢菌素水解獲得合成各種新青