熱應激對慢性粒細胞白血病細胞系K562中熱休克蛋白gp96表達的影響

1、熱應激對慢性粒細胞白血病細胞系K562中熱休克卵白gp96表達的影響王昕，史斌，王申五，董建強，崔建英，韓淑霞【摘要】本研究查明差異熱應激條件對慢性粒細胞白血病細胞系K562細胞中熱休克卵白gp96表達量的影響，為探求增長K562細胞中gp96的提取量的最正確熱應激條件提供實行根據(jù)。用免疫構造化學要領檢測經(jīng)38、40、42、44、46及48水浴熱休克處置懲罰30分鐘后的K562細胞中gp96表達量的變革；以均勻陽性細胞百分率寧靜均熒光強度為指標，用流式細胞術研究40、44、48及52各水浴熱休克處置懲罰30分鐘對K562細胞中gp96表達量的影響；利用免疫印記原理，用esternblt技能研究

2、K562細胞經(jīng)40、44、48與52水浴各休克處置懲罰30分鐘后gp96表達量的變革。效果表白：免疫構造化學要領表現(xiàn)gp96重要在胞漿內表達，在48水浴熱休克處置懲罰30分鐘時，強陽性的細胞數(shù)最多，積分也最高；流式細胞術表現(xiàn)均勻陽性細胞百分率寧靜均熒光強度均在48水浴熱休克處置懲罰30分鐘組達岑嶺，各溫度間gp96表達量的差異有統(tǒng)計學意義；esternblt表現(xiàn)48水浴熱休克處置懲罰30分鐘時gp96的表達量到達岑嶺，各溫度間gp96表達量的差異有統(tǒng)計學意義。結論：48水浴熱休克處置懲罰30分鐘，gp96在K562細胞中的表達量到達岑嶺，該條件可作為提取K562細胞gp96的一個有用預處置懲罰

3、條件?！娟P鍵詞】慢性粒細胞白血??；熱休克卵白；gp96；腫瘤免疫；熱應激EffetfHeatStressnExpressinfgp96inK562ellLinefthehrniyelidLeukeiaandItsSignifianeKeyrdsL;heatshkprtein;gp96;turiune;heatstress熱休克卵白heatshkprtein，HSP又稱應激卵白，具有高度守舊性，高溫及別的應激因素均能誘導其表達增長，它有多個家屬。比年來的研究表白，熱休克卵白gp96到場機體的固有免疫和特異性免疫也稱順應性免疫，能從兩大途徑引發(fā)機體的抗腫瘤免疫1，為慢性粒細胞白血病的生物治療提供了

4、新的思緒。為滿意進一步的底子和臨床研究需求，需有大量的gp96，而現(xiàn)有的提取要領服從很低，很難滿意研究必要。為此，本研究欲通過免疫構造化學、流式細胞術和esternblt技能，研究差異熱應激條件對K562細胞中gp96表達量的影響，探求出最正確熱應激條件，為下一步增長提取gp96的量探究預處置懲罰條件，這是進一步研究慢性粒細胞白血病生物治療的條件。質料和要領抗體及試劑gp96大鼠單克隆抗體大鼠抗人為美國Near-kers公司產(chǎn)物，辣根過氧化物酶HRP標識表記標幟的抗大鼠IgG二抗及FIT標識表記標幟的抗大鼠IgG二抗為美國KPL公司產(chǎn)物，均購自晶美公司。DAB試劑盒和關閉用的正常羊血清購自北京

5、中山生物技能，Ttitn-X100及Teen-20均為美國Siga公司產(chǎn)物，RPI1640造就液購自美國Gib公司。溶血素、破膜劑、BSA及流式細胞儀均為BetinDi-kinsn公司產(chǎn)物。BA卵白檢測試劑盒購自美國Piere公司，預染的卵白分子量尺度購自Ferentas公司，混淆發(fā)光試劑盒為Santaruz公司產(chǎn)物，TEED、SDS、PSF、甘氨酸等均購自美國Siga公司。細胞系及造就條件細胞系為慢性粒細胞白血病K562細胞系。K562細胞系由本實行室凍存，清醒后置于底面積為752的造就瓶內，參加RPI1640造就液及10%的胎牛血清，于37、5%2、飽和濕度條件下造就，24-48小時傳代1

6、次。gp96表達的免疫構造化學檢測檢測要領將K562細胞造就達對數(shù)生恒久后，制備成細胞懸液，調解濃度至1105/l，等量分裝后別離于38、40、42、44、46及48恒溫水浴箱熱休克處置懲罰30分鐘后，各溫度細胞用離心涂片機甩片，多聚甲醛室溫結實后-20備用。將標本各溫度切片置于濕盒內以下同，用3%的H2237孵育30分鐘，PBST漂洗3次；0.3%的Tritn-X10037孵育30分鐘，PBST漂洗3次；用關閉血清于37關閉30分鐘；棄血清后加1100的gp96大鼠單克隆抗體4留宿，PBST漂洗3次；加1150的HRP標識表記標幟的抗大鼠IgG37孵育30分鐘，PBST漂洗3次；DAB顯色。

7、標本末了用蘇木素染液復染2分鐘，泡洗約2分鐘、晾干，以中性樹膠封片，照相。光學顯微鏡400倍下計數(shù)5-10個視野的細胞、陽性細胞占所計數(shù)細胞的比值為百分率。標本設陰性比較，即不加一抗，用PBS取代一抗，別的步調同上。評分尺度差異熱應激條件下，按照K562細胞中棕黃色沉淀顏色深淺、所占胞漿面積的巨細分為3個品級：淺棕色、所占胞漿面積1/2以下為弱陽性+，積分為1；棕色、所占胞漿面積1/2-2/3為中陽性+，積分為2；深棕色、所占胞漿面積2/3以上為強陽性+，積分為3。盤算差異溫度下差異陽性品級的積分總和百分率均值乘以積分品級及全部陽性細胞的積分總和各品級積分相加。gp96表達的流式細胞術檢測檢測

8、要領勞績對數(shù)生恒久的K562細胞懸液，等量分裝為4管，別離于40、44、48及52恒溫水浴箱熱休克處置懲罰30分鐘，將每管的細胞懸液平分入A、B兩管流式上機管，使細胞濃度為5105/l；A管為比較管，B管為實行管，各管加溶血素結實10分鐘，離心后棄上清，再加破膜劑0.5l結實后離心棄上清，然后每B管參加1100的一抗37恒溫孵育30分鐘，各組A、B管再參加1100的FIT標識表記標幟的二抗37孵育30分鐘。然后取出各管，參加含1%BSA的PBS離心后棄上清，取0.5l的PBS重懸細胞，上流式細胞儀檢測。評價尺度陽性細胞的百分率指表達gp96的細胞占全部細胞的百分率，反響表達gp96的細胞數(shù)目的

9、幾多；陽性細胞的均勻熒光強度指單元細胞表達gp96的強度，反響每個細胞表達gp96的量。gp96表達的esternblt檢測檢測要領勞績對數(shù)生恒久的K562細胞懸液，PBS洗3次后別離于40、44、48與52熱休克處置懲罰30分鐘，離心后參加5倍細胞沉淀體積的預冷的RIPA裂解液，旋渦震蕩混淆器充實混淆后，冰上安排30分鐘，超聲粉碎機裂解后冰上再孵30分鐘，離心后留取上清，-80保存?zhèn)溆?。用BA卵白檢測試劑盒測定樣品濃度，制備SDS凝膠本實行利用12%的分散膠，然后等卵白總量上樣、電泳、轉膜、關閉留宿、雜交孵育抗體一抗gp96稀釋度1200，atin1400;二抗gp96稀釋度15000，at

10、in12500；一抗室溫孵育2小時，TBST洗3次，二抗室溫孵育1小時，TBST洗3次，末了暗室中用混淆發(fā)光試劑顯影在膠片上，按照發(fā)光強度調解曝光時間。評價尺度凝膠成像軟件闡發(fā)膠片上條帶的灰密度積分，用gp96條帶的灰度積分除以相應泳道的atin的灰度積分，二者的比值最高表現(xiàn)該組刺激條件下gp96的表達量最高。統(tǒng)計學處置懲罰數(shù)據(jù)用SPSS10.0醫(yī)用統(tǒng)計學軟件處置懲罰。全部數(shù)據(jù)舉行正態(tài)查驗和方差齊性查驗，復合正態(tài)、方差齊的舉行單因素方差闡發(fā)，差異成心義時組間差異兩兩比力接納Q查驗；方差不齊時，接納秩和查驗，差異成心義時舉行兩兩比力。數(shù)據(jù)以均數(shù)尺度差(XSD)、均勻秩次來表現(xiàn)。P0.05表現(xiàn)差異

11、有統(tǒng)計學意義，P0.01表現(xiàn)差異有非常明顯的統(tǒng)計學意義。效果K562中gp96表達的構造化學檢測效果在48水浴30分鐘這一熱應激條件下，gp96強陽性細胞+的百分率均值為35%，積分總和為105，全部陽性細胞+，+，+的積分總和為202，均在各組中最高。在38-48之間差異刺激條件下，K562中gp96的表達量有所變革，在48組表達量最高圖1，表1。Table1.eanperentageandintegralfpsitivegp96ellsunderdifferentheatstressinK562ellline(略)K562中gp96表達的流式細胞術檢測效果陽性細胞的百分率各組陽性細胞的百分

12、率資料方差不齊，實行效果經(jīng)秩和查驗法統(tǒng)計處置懲罰。百分率隨著溫度的變革而變革，在40-52之間漸漸增高，均勻秩次別離為6.00，18.80，30.08，26.40，總的來說各溫度之間的P=0.000，0.01，差異有非常明顯的統(tǒng)計學意義。組間兩兩比力，40與44P=0.001，40與48P=0.000，40與52之間P=0.000，P“均0.01，差異有非常明顯的統(tǒng)計學意義；44與48之間P=0.002，0.01，差異有非常明顯的統(tǒng)計學意義，但與52之間P=0.096，0.05，差異無統(tǒng)計學意義；48與52之間P=0.326，0.05，差異無統(tǒng)計學意義。由于48與52組間差異無統(tǒng)計學意義，可以

13、說48水浴30分鐘K562中表達gp96的陽性細胞百分率最高，該組刺激條件可以作為提取gp96的有用預處置懲罰條件圖2，表2。Table2.eanrankfpsitivegp96ellperentageinK562underdifferentheatstress略陽性細胞均勻熒光強度K562中gp96表達的esternblt檢測效果Gp96條帶的灰度積分除以相應Atin的灰度積分的比值資料切合正態(tài)漫衍，方差齊，接納單因素方差闡發(fā)。比值均數(shù)：40組為0.806，44組為0.830，48組為1.571，52組為2.064，總的來說各溫度之間的P=0.000，0.01，差異有非常明顯的統(tǒng)計學意義。組

14、間兩兩比力，40與44間P=0.938，0.05，差異無統(tǒng)計學意義，但與48間P=0.016，與52之間P=0.000，P均0.01，差異有非常明顯的統(tǒng)計學意義；44與48之間P=0.019，與52之間P=0.000，P均0.05，差異有明顯的統(tǒng)計學意義；48與52之間P=0.107，0.05，差異無統(tǒng)計學意義。由于48與52組間差異無統(tǒng)計學意義，可以說48水浴30分鐘K562中gp96的表達量最高，該組刺激條件下96的表達量最高，可以作為提取gp96的有用預處置懲罰條件圖3，表4。Table4.Ratifgp96tatininK562ellsunderdifferentheatstress(

15、略)討論熱休克蛋HSP是一個具有差異分子量和細胞內定位的各人族卵白質，在進化中高度守舊。熱休克卵白gp96是HSP-90家屬的一個成員，重要存在于細胞漿的內質網(wǎng)。如今，在免疫學中gp96介導的腫瘤排擠機制的研究表白：它以兩種方法到場機體的固有免疫和特異性免疫也稱順應性免疫，能從兩大途徑引發(fā)機體的抗腫瘤免疫。1，2，3。在許多動物腫瘤模子如肝癌、結腸癌、玄色素瘤、前線腺癌等中，均已證明HSP的防范和治療作用；比年來，從人類玄色素瘤和結腸癌中純化的gp96已被證明，它可以或許將抗原肽呈遞給D8+的T細胞，在體表里的實行中均能激該死T細胞，引發(fā)抗原特異的免疫應答4。基于以上底子和臨床研究，我們實行為

16、慢性粒細胞白血病的免疫治療探求一種新的要領，但是進一步的研究的條件是必要大量的gp96。要辦理這一題目，可以從兩方面入手：第一，在提取gp96前，對提取物舉行預處置懲罰，增長gp96的表達量；第二，革新現(xiàn)有的提取要領來增長提取量。對付提取要領，比年來，Arnld-Shild等5提出了一種新的提取要領，其底子是熱療。比年來，熱療的生物學希望使腫瘤熱療成為腫瘤綜合治療的本領之一，重要緣故原由在于熱療不但可以或許引起細胞質膜的團體損傷和布局粉碎6，并且熱療自己能加強T淋巴細胞、B淋巴細胞以及NK細胞的抗腫瘤活性，從而加強機體免疫監(jiān)視成效7，同時在熱療時產(chǎn)生的熱休克卵白可全面激活機體的免疫體系。HSP

17、-肽復合物在熱療中產(chǎn)生，經(jīng)H-I類分子及巨嗜細胞的加工能為TL細胞識別而產(chǎn)生特異性免疫8，9，從而對體內同時存在的腫瘤細胞起到猛烈的殺傷作用。現(xiàn)有的研究表白，熱休克卵白gp96在熱休克，糖饑餓及應激因子如腫瘤壞死因子TNF-、滋擾素和INF-和INF-、2-巰基乙醇等應激條件下表達均增長10?；谝陨涎芯啃Ч覀冞x擇了熱應激作為提取gp96的預處置懲罰條件。外洋aki等人用Nr-thernblt法曾在RNA程度上研究過熱應激對gp96表達量的影響，他們報道42，1小時熱休克處置懲罰后gp96的表達量比處置懲罰前增長，然而比力體系地研究熱應激對gp96表達量影響的事情，如今國表里尚未見報道。本實行選用免疫構造化學、免疫熒光和免疫印記3種要領研究熱應激對gp96表達量的影響。免疫構造化學要領從形態(tài)學上，直不雅地記載了差異熱應激條件下，gp96表達量的變革，創(chuàng)造從38-48之間，gp96的表達量有著顯著的變革，在48時強陽性細胞數(shù)最多，積分也最高，說明在這一熱應激范疇內，即gp96在48，30分鐘這一熱應激條件下表達最高。為了驗證這一趨勢，我們方案了第二種要領，通過流式細胞術，利用免疫熒光的原理，不雅察陽性細胞百分率寧靜均熒光強