細(xì)胞松弛素B對(duì)小鼠成熟卵母細(xì)胞玻璃化冷凍的影響

1、細(xì)胞松弛素B對(duì)小鼠成熟卵母細(xì)胞玻璃化冷凍的影響唐宇鈴，丘 彥，幸貴邦，孟江萍 （重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院輔助生殖中心,重慶 400016）【摘 要】目的：探討細(xì)胞松弛素B（cytochalasin B，CB）對(duì)小鼠成熟卵母細(xì)胞玻璃化冷凍、受精及胚胎發(fā)育的影響。方法：將小鼠成熟卵母細(xì)胞分別經(jīng)過細(xì)胞松弛素B濃度為0（對(duì)照）、5、10、20、40ug/ml預(yù)處理后玻璃化冷凍，解凍后進(jìn)行體外受精，觀察卵母細(xì)胞的復(fù)蘇率、受精率、6-8cell胚胎形成率。結(jié)果：20ug/ml組復(fù)蘇率高于各組（P0.05），但與5ug/ml組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（92.6% vs 88% ，P0.05）；20ug/ml組受精率

2、高于各組（P0.05），與對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（68.0% vs 55.9% ，P0.05）；40、20ug/ml組6-8cell胚胎形成率高于各組（P0.05），40ug/ml組與20ug/ml組無顯著差異（69.0% vs 64.7%，P0.05），20ug/ml組與對(duì)照組差異不顯著（64.7% vs 47.4%，P0.05）。結(jié)論：CB對(duì)小鼠成熟卵母細(xì)胞的復(fù)蘇率、受精率和胚胎形成率具有改善作用。【關(guān)鍵詞】細(xì)胞松弛素B；成熟卵母細(xì)胞；玻璃化冷凍【中國(guó)圖書分類法分類號(hào)】R321.1 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【收稿日期】2010-12-24Effects of Cytochalasin B on Vi

3、trification of Mice Mature OocytesTANG Yuling,et al (Assistant Reproductive Centre,the First Affiliated Hospital,Chongqing Medical University)【Abstract】Objective:To observe the effects of cytochalasin B on vitrification, fertilization and embryonic development of mice mature oocytes.Methods: Mice ma

4、ture oocytes had been cultured with cytochalasin B of different concentrations ,0 (control), 5,10,20,40ug/ml,respectively,and then vitrificated. After thawed, we observed the oocytes recovery rate,fertilization rate, embryo formation rate of 6-8cell.Results: The 20ug/ml concentration of CB group had

5、 higher recovery rate than other group(P0.05),but no significant differences with the 5ug/ml group（92.6% vs 88% ,P0.05）; The 20ug/ml concentration of CB group had higher fertilization rate than other group（P0.05）, but no significant differences with the controlded group（68.0% vs 55.9% ,P0.05）;The 40

6、,20ug/ml concentration of CB group had higher embryo formation rate of 6-8cell than other group（P0.05）,but the 40ug/ml concentration of CB group was no significant differences with the 20ug/ml group（69.0% vs 64.7%,P0.05）,the 20ug/ml concentration of CB group compared to the controlded group was sign

7、ificantly indifferent（64.7% vs 47.4%,P0.05）.Conclusion: The cytochalasin B can be used to improve the recovery rate,fertilization rate and embryos formation rate of mice mature oocytes.【Key words】Cytochalasin B;Mature oocytes; Vitrification 自1999年Kuleshova1等首先報(bào)道，應(yīng)用玻璃化冷凍人第二次減數(shù)分裂中期（M）卵母細(xì)胞獲得成功妊娠和分娩以來，卵

8、母細(xì)胞玻璃化冷凍已成為近年來研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。通過凍卵，可以在體外受精-胚胎移植中保存剩余的卵備用，提高輔助生殖技術(shù)的效率,為切除卵巢、放療或化療的婦女保存生育能力,建立卵子庫(kù)以簡(jiǎn)化供卵過程,避免胚胎冷凍引起的歸屬權(quán)的爭(zhēng)議。目前，冷凍損傷仍是卵母細(xì)胞冷凍保存的主要障礙。Fabbri等2研究發(fā)現(xiàn)冷凍常會(huì)使卵母細(xì)胞胞膜不完整，透明帶變硬，細(xì)胞骨架破壞，以及染色體異常等。如何減輕卵母細(xì)胞的冷凍損傷是提高凍卵技術(shù)的一個(gè)難題。CB是從真菌中分離得到的代謝產(chǎn)物，是一種細(xì)胞骨架的可逆性穩(wěn)定劑，通過中斷微絲之間的聯(lián)系降低微管在冷凍過程中的損傷3。CB作為冷凍保護(hù)劑，可增加細(xì)胞骨架彈性和紡錘體微管的穩(wěn)定性，減輕

9、卵母細(xì)胞凍融過程中引起骨架變形和損傷4。本課題以小鼠成熟卵母細(xì)胞為模型，研究不同濃度的CB對(duì)玻璃化冷凍卵母細(xì)胞的影響，探討CB是否能減少冷凍損傷，提高卵母細(xì)胞的復(fù)蘇率、受精率和后期發(fā)育潛能。作者介紹：唐宇鈴(1980- )，女，碩士，研究方向：生殖內(nèi)分泌與輔助生殖技術(shù)。通訊作者：丘 彥，女，教授，E-mail：1 材料與方法1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)昆明雌性小白鼠30只，68周，體重2535g,用于獲取成熟卵母細(xì)胞；清潔級(jí)昆明雄性小白鼠10只，812周，體重3545g，用于獲取精子，均購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。1.2 主要儀器和試劑 CO2培養(yǎng)箱（Li Shen，中國(guó)），解剖顯微鏡（Leica

10、，德國(guó)），倒置顯微鏡（XDS-1,中國(guó)），SAGE玻璃化冷凍和解凍試劑盒、體外受精（in vitro fertilization,IVF）液（深圳市金協(xié)和醫(yī)療器械有限公司），細(xì)胞松弛素B（美國(guó)Sigma公司）。成熟卵母細(xì)胞的獲取雌性小白鼠腹腔注射10IU尿促性素，48h后注射10IU絨促性素，注射絨促性素后1314h頸椎脫臼處死小鼠，剖腹取出輸卵管，在顯微鏡下，收集形態(tài)正常、有第一極體排出的卵母細(xì)胞移入IVF培養(yǎng)液，放入CO2培養(yǎng)箱備用。共收集到成熟卵母細(xì)胞536個(gè)。1.4 細(xì)胞松弛素B對(duì)小鼠成熟卵母細(xì)胞凍融效果的影響實(shí)驗(yàn)分為5組，1組為對(duì)照組，對(duì)卵母細(xì)胞直接進(jìn)行玻璃化冷凍；2、3、4、5組分

11、別經(jīng)過CB濃度為5、10、20、40ug/ml預(yù)處理20min后再進(jìn)行玻璃化冷凍。1.5 卵母細(xì)胞玻璃化冷凍和解凍將卵母細(xì)胞放入20l平衡液（Equilibration Solution,ES）進(jìn)行預(yù)平衡10分鐘，然后依次轉(zhuǎn)入玻璃化冷凍液 (Vitrification Solution,VS) VS1 5秒，VS2 5秒，VS3 10秒，最后轉(zhuǎn)入VS4液滴，并在90秒內(nèi)裝入麥管投入液氮。解凍時(shí)將麥管浸入1M解凍溶液（Warming Solution,WS），卵母細(xì)胞逸出后停留1分鐘，然后依次移入0.5M WS1、0.5M WS2、0.25M WS3液滴，各停留2分鐘,再將卵母細(xì)胞依次經(jīng)過緩沖溶

12、液（MOPS Solution,MS）MS1、MS2、MS3處理，各停留3分鐘,最后移入IVF培養(yǎng)液并放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2h后觀察卵母細(xì)胞存活情況。1.6 復(fù)蘇后卵母細(xì)胞存活的評(píng)定透明帶完整，質(zhì)膜無破裂，胞質(zhì)無外流，折光性好，第一極體完整且呈圓形，卵周間歇存在并且均勻。1.7 體外受精雄性小白鼠分離附睪尾和輸精管后，從輸精管中擠出精子，放入CO2培養(yǎng)箱中獲能1h。制作受精滴，密度約為2106個(gè)/ml，將受精培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱中靜置46h后觀察有無雙原核形成及第二極體釋放5。受精后2448h觀察24cell胚胎數(shù)量，4872h觀察68cell胚胎數(shù)量。1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0進(jìn)

13、行卡方（X2）檢驗(yàn)，P0.05表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2 結(jié) 果2.1 細(xì)胞松弛素B對(duì)解凍后卵母細(xì)胞復(fù)蘇率的影響 CB濃度為5、20、40ug/ml組復(fù)蘇率高于對(duì)照組，10ug/ml組低于對(duì)照組，且CB濃度為20ul/ml組差異有顯著性（P0.05）。CB各濃度組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)（P0.05），兩兩比較CB濃度為5ug/ml組復(fù)蘇率高于10ug/ml組（P0.05）、40ug/ml組（P0.05），低于20ug/ml組（P0.05）；20ug/ml組高于10、40ug/ml組（P0.05）；40ug/ml組高于10ug/ml組（P0.05）。（見圖1、表1）。存活卵母細(xì)胞（400倍）異常卵母細(xì)胞（4

14、00倍）受精卵母細(xì)胞（400倍）圖1 解凍后成熟及受精的卵母細(xì)胞形態(tài)2.2 細(xì)胞松弛素B對(duì)卵母細(xì)胞受精率的影響 CB濃度為20ug/ml組受精率高于對(duì)照組，CB濃度為5、10、40ug/ml組受精率低于對(duì)照組，但均無顯著性差異（P0.05）。CB各濃度組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)（P0.05），兩兩比較CB濃度為20ug/ml組受精率高于5、10、40ug/ml組（P0.05）；10、40ug/ml組高于5ug/ml組（P0.05）；10ug/ml組高于40ug/ml組（P0.05）。（見圖1、表1）。2.3 細(xì)胞松弛素B對(duì)卵母細(xì)胞6-8cell胚胎形成率的影響 CB濃度為20、40ug/ml組6-8cel

15、l胚胎形成率高于對(duì)照組，且CB濃度為40ul/ml組差異有顯著性（P0.05）。CB各濃度組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)（P0.05），兩兩比較CB濃度為20、40ug/ml組胚胎形成率高于5、10ug/ml組（P0.05），40ug/ml組高于20ug/ml組（P0.05）；10ug/ml組高于5ul/ml組（P0.05）。（見圖2、表1）。表1 細(xì)胞松弛素B對(duì)小鼠成熟卵母細(xì)胞凍融的影響組別：CB濃度（ug/ml）取卵數(shù)（M期）復(fù)蘇率（%）受精率（%）6-8cell胚率（%）08868（77.3）38（55.9）18（47.4）510088（88.0）36（40.9）d14（38.9）de1011276（6

16、7.9）bd36（47.4）d16（44.4）de20108100（92.6）a68（68.0）44（64.7）40128100（78.1）d42（42.0）d29（69.0）a注：a P0.05，與對(duì)照組比較；b P0.05，與5ug/ml組比較；c P0.05，與10ug/ml組比較；d P0.05，與20ug/ml組比較；e P0.05，與40ug/ml組比較2cell（400倍）4cell（400倍）8cell（400倍）圖2 體外受精后胚胎的2-8cell形態(tài)3 討 論1986年Chen6報(bào)道第一例凍融人卵母細(xì)胞成功以來，2008年國(guó)內(nèi)外僅有900多例凍卵胎兒出生的報(bào)道7 ，卵子冷凍

17、尚未常規(guī)運(yùn)用于臨床。Borini8等2004年報(bào)道慢速冷凍人772枚卵子，解凍737枚卵子中有273枚存活(37%)，經(jīng)ICSI受精124枚(45.4%)。2009年田秀朱9等報(bào)道采用不同蔗糖濃度(0.1、0.2、0.3mol/L)的冷凍保護(hù)劑程序化冷凍205枚人卵母細(xì)胞，復(fù)蘇后的存活率分別為23.1%、40.8%、59.4%。陳子江10等2006年報(bào)道玻璃化冷凍235個(gè)人卵母細(xì)胞，解凍后存活169個(gè)（71.9%），ICSI受精122個(gè)（72.2%）。有研究指出卵母細(xì)胞是人類最大的細(xì)胞，表面積與體積比值小11，妨礙了卵膜水與冷凍保護(hù)劑的交換，冷凍過程中細(xì)胞骨架的易受損傷性，解凍后的復(fù)蘇率不高。

18、細(xì)胞骨架是由微管、微絲和中間纖維組成，分布于整個(gè)細(xì)胞質(zhì)中。微管組成的紡錘體裝置是一個(gè)功能性組織，促進(jìn)染色體在分裂過程中分離及第一和第二極體的排出，確保正常的染色體分離避免非整倍體12。徐千花13等2009年通過激光共聚焦顯微鏡下觀察玻璃化凍溶后人成熟卵母細(xì)胞的紡錘體及染色體形態(tài)正常率與未冷凍組相比差異具有顯著性，冷凍組21個(gè)，正常5個(gè)（24%），未冷凍組26個(gè)，正常16個(gè)（62%）。成熟卵母細(xì)胞的染色體附著于第二次減數(shù)分裂紡錘體易變的微管上，紡錘體對(duì)低溫敏感，冷凍過程易導(dǎo)致微管解聚、染色體彌散，存活率、受精率和后期發(fā)育潛能降低14。因此，提高細(xì)胞骨架在玻璃化冷凍過程中的穩(wěn)定性，將有可能提高卵母

19、細(xì)胞冷凍的存活率、受精率以及發(fā)育潛能，減少冷凍損傷。已有研究指出細(xì)胞松弛素B可以減弱細(xì)胞骨架基礎(chǔ)的堅(jiān)固性，增加細(xì)胞柔韌性，減少冷凍對(duì)細(xì)胞骨架的損傷。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的顯微操作采用CB進(jìn)行預(yù)處理的研究雖多，有效性尚有爭(zhēng)議。2004年Fujihira15等發(fā)現(xiàn)在豬胚胎玻璃化冷凍中添加細(xì)胞松弛素B，可顯著提高囊胚的生存和發(fā)育。2004年朱德生16等報(bào)道在核移植過程中用CB處理小鼠卵母細(xì)胞能使細(xì)胞結(jié)構(gòu)變得松弛，減少去核操作時(shí)對(duì)受體胞質(zhì)的損傷，采用10ug/ml的CB預(yù)處理后去核率88.2%（270/306），無CB預(yù)處理組去核成功率29.7%（38/128）。2008年崔龍波17等在核移植過程中用CB濃度5

20、40ug/ml處理小鼠卵母細(xì)胞,通過激光共聚焦掃描顯微鏡觀察紡錘體結(jié)構(gòu)未見異常。Somfai等18 2006年報(bào)道CB提高了玻璃化冷凍豬成熟卵母細(xì)胞的存活率和發(fā)育率。但張波等19 2007年用5ug/mlCB預(yù)處理M期小鼠卵母細(xì)胞351枚后進(jìn)行玻璃化冷凍，解凍后觀察存活率、受精率、卵裂率及囊胚率，未證實(shí)其具有保護(hù)作用。2008年張家新等20采用2.5、5.0、7.5和10ug/mlCB預(yù)處理綿羊成熟卵母細(xì)胞597枚，經(jīng)過玻璃化凍融后存活率、卵裂率、囊胚率均顯著低于對(duì)照組。這些是否屬于物種間或方法學(xué)的差異尚需進(jìn)一步研究。 本實(shí)驗(yàn)以昆明小鼠為模型，采用成倍遞增方式設(shè)置了4個(gè)CB濃度處理組。通過解凍

21、后卵母細(xì)胞復(fù)蘇率及受精率顯示，CB濃度為20ul/ml組高于各組，且復(fù)蘇率與10、40ug/ml、對(duì)照組具有顯著差異（P0.05），受精率與5、10、40ug/ml組具有顯著差異（P0.05）；CB濃度為40、20ug/ml組6-8cell胚胎發(fā)生率高于各組，40ug/ml組與20ug/ml組無顯著差異（69.0% vs 64.7%，P0.05），20ug/ml組與對(duì)照組差異不顯著（64.7% vs 47.4%，P0.05）。由此可見CB在一定程度上能夠降低細(xì)胞骨架對(duì)冷凍損傷的敏感性，對(duì)骨架成分具有特定的可逆性作用，提高細(xì)胞中這些成分的柔韌性，特別是濃度為20ug/ml的CB減輕凍融對(duì)小鼠卵母

22、細(xì)胞的損傷，提高存活率及胚胎的后期發(fā)育潛能具有很好的促進(jìn)作用。本實(shí)驗(yàn)提示CB在小鼠成熟卵母細(xì)胞的玻璃化冷凍過程中具有一定的冷凍保護(hù)作用，但CB在人卵母細(xì)胞冷凍中的作用報(bào)道較少，最佳處理時(shí)間和濃度有待進(jìn)一步的研究和探索。 參考文獻(xiàn)1 Kuleshova K,Gianaroli L,Magli C,et al.Birth following vitrification of a small number of human oocytes:case reportJ.Hum Reprod,1999,14:3077-3079.2 Fabbri R,Porcu E,Marsella T,et al.Tec

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