細胞松弛素B對小鼠成熟卵母細胞玻璃化冷凍的影響

1、細胞松弛素B對小鼠成熟卵母細胞玻璃化冷凍的影響唐宇鈴，丘 彥，幸貴邦，孟江萍 （重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院輔助生殖中心,重慶 400016）【摘 要】目的：探討細胞松弛素B（cytochalasin B，CB）對小鼠成熟卵母細胞玻璃化冷凍、受精及胚胎發(fā)育的影響。方法：將小鼠成熟卵母細胞分別經過細胞松弛素B濃度為0（對照）、5、10、20、40ug/ml預處理后玻璃化冷凍，解凍后進行體外受精，觀察卵母細胞的復蘇率、受精率、6-8cell胚胎形成率。結果：20ug/ml組復蘇率高于各組（P0.05），但與5ug/ml組比較無統(tǒng)計學差異（92.6% vs 88% ，P0.05）；20ug/ml組受精率

2、高于各組（P0.05），與對照組無統(tǒng)計學差異（68.0% vs 55.9% ，P0.05）；40、20ug/ml組6-8cell胚胎形成率高于各組（P0.05），40ug/ml組與20ug/ml組無顯著差異（69.0% vs 64.7%，P0.05），20ug/ml組與對照組差異不顯著（64.7% vs 47.4%，P0.05）。結論：CB對小鼠成熟卵母細胞的復蘇率、受精率和胚胎形成率具有改善作用?！娟P鍵詞】細胞松弛素B；成熟卵母細胞；玻璃化冷凍【中國圖書分類法分類號】R321.1 【文獻標識碼】A 【收稿日期】2010-12-24Effects of Cytochalasin B on Vi

3、trification of Mice Mature OocytesTANG Yuling,et al (Assistant Reproductive Centre,the First Affiliated Hospital,Chongqing Medical University)【Abstract】Objective:To observe the effects of cytochalasin B on vitrification, fertilization and embryonic development of mice mature oocytes.Methods: Mice ma

4、ture oocytes had been cultured with cytochalasin B of different concentrations ,0 (control), 5,10,20,40ug/ml,respectively,and then vitrificated. After thawed, we observed the oocytes recovery rate,fertilization rate, embryo formation rate of 6-8cell.Results: The 20ug/ml concentration of CB group had

5、 higher recovery rate than other group(P0.05),but no significant differences with the 5ug/ml group（92.6% vs 88% ,P0.05）; The 20ug/ml concentration of CB group had higher fertilization rate than other group（P0.05）, but no significant differences with the controlded group（68.0% vs 55.9% ,P0.05）;The 40

6、,20ug/ml concentration of CB group had higher embryo formation rate of 6-8cell than other group（P0.05）,but the 40ug/ml concentration of CB group was no significant differences with the 20ug/ml group（69.0% vs 64.7%,P0.05）,the 20ug/ml concentration of CB group compared to the controlded group was sign

7、ificantly indifferent（64.7% vs 47.4%,P0.05）.Conclusion: The cytochalasin B can be used to improve the recovery rate,fertilization rate and embryos formation rate of mice mature oocytes.【Key words】Cytochalasin B;Mature oocytes; Vitrification 自1999年Kuleshova1等首先報道，應用玻璃化冷凍人第二次減數分裂中期（M）卵母細胞獲得成功妊娠和分娩以來，卵

8、母細胞玻璃化冷凍已成為近年來研究的熱點和難點。通過凍卵，可以在體外受精-胚胎移植中保存剩余的卵備用，提高輔助生殖技術的效率,為切除卵巢、放療或化療的婦女保存生育能力,建立卵子庫以簡化供卵過程,避免胚胎冷凍引起的歸屬權的爭議。目前，冷凍損傷仍是卵母細胞冷凍保存的主要障礙。Fabbri等2研究發(fā)現冷凍常會使卵母細胞胞膜不完整，透明帶變硬，細胞骨架破壞，以及染色體異常等。如何減輕卵母細胞的冷凍損傷是提高凍卵技術的一個難題。CB是從真菌中分離得到的代謝產物，是一種細胞骨架的可逆性穩(wěn)定劑，通過中斷微絲之間的聯系降低微管在冷凍過程中的損傷3。CB作為冷凍保護劑，可增加細胞骨架彈性和紡錘體微管的穩(wěn)定性，減輕

9、卵母細胞凍融過程中引起骨架變形和損傷4。本課題以小鼠成熟卵母細胞為模型，研究不同濃度的CB對玻璃化冷凍卵母細胞的影響，探討CB是否能減少冷凍損傷，提高卵母細胞的復蘇率、受精率和后期發(fā)育潛能。作者介紹：唐宇鈴(1980- )，女，碩士，研究方向：生殖內分泌與輔助生殖技術。通訊作者：丘 彥，女，教授，E-mail：1 材料與方法1.1 實驗動物清潔級昆明雌性小白鼠30只，68周，體重2535g,用于獲取成熟卵母細胞；清潔級昆明雄性小白鼠10只，812周，體重3545g，用于獲取精子，均購自重慶醫(yī)科大學實驗動物中心。1.2 主要儀器和試劑 CO2培養(yǎng)箱（Li Shen，中國），解剖顯微鏡（Leica

10、，德國），倒置顯微鏡（XDS-1,中國），SAGE玻璃化冷凍和解凍試劑盒、體外受精（in vitro fertilization,IVF）液（深圳市金協(xié)和醫(yī)療器械有限公司），細胞松弛素B（美國Sigma公司）。成熟卵母細胞的獲取雌性小白鼠腹腔注射10IU尿促性素，48h后注射10IU絨促性素，注射絨促性素后1314h頸椎脫臼處死小鼠，剖腹取出輸卵管，在顯微鏡下，收集形態(tài)正常、有第一極體排出的卵母細胞移入IVF培養(yǎng)液，放入CO2培養(yǎng)箱備用。共收集到成熟卵母細胞536個。1.4 細胞松弛素B對小鼠成熟卵母細胞凍融效果的影響實驗分為5組，1組為對照組，對卵母細胞直接進行玻璃化冷凍；2、3、4、5組分

11、別經過CB濃度為5、10、20、40ug/ml預處理20min后再進行玻璃化冷凍。1.5 卵母細胞玻璃化冷凍和解凍將卵母細胞放入20l平衡液（Equilibration Solution,ES）進行預平衡10分鐘，然后依次轉入玻璃化冷凍液 (Vitrification Solution,VS) VS1 5秒，VS2 5秒，VS3 10秒，最后轉入VS4液滴，并在90秒內裝入麥管投入液氮。解凍時將麥管浸入1M解凍溶液（Warming Solution,WS），卵母細胞逸出后停留1分鐘，然后依次移入0.5M WS1、0.5M WS2、0.25M WS3液滴，各停留2分鐘,再將卵母細胞依次經過緩沖溶

12、液（MOPS Solution,MS）MS1、MS2、MS3處理，各停留3分鐘,最后移入IVF培養(yǎng)液并放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2h后觀察卵母細胞存活情況。1.6 復蘇后卵母細胞存活的評定透明帶完整，質膜無破裂，胞質無外流，折光性好，第一極體完整且呈圓形，卵周間歇存在并且均勻。1.7 體外受精雄性小白鼠分離附睪尾和輸精管后，從輸精管中擠出精子，放入CO2培養(yǎng)箱中獲能1h。制作受精滴，密度約為2106個/ml，將受精培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱中靜置46h后觀察有無雙原核形成及第二極體釋放5。受精后2448h觀察24cell胚胎數量，4872h觀察68cell胚胎數量。1.8 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 17.0進

13、行卡方（X2）檢驗，P0.05表明差異有統(tǒng)計學意義。2 結 果2.1 細胞松弛素B對解凍后卵母細胞復蘇率的影響 CB濃度為5、20、40ug/ml組復蘇率高于對照組，10ug/ml組低于對照組，且CB濃度為20ul/ml組差異有顯著性（P0.05）。CB各濃度組間具有統(tǒng)計學（P0.05），兩兩比較CB濃度為5ug/ml組復蘇率高于10ug/ml組（P0.05）、40ug/ml組（P0.05），低于20ug/ml組（P0.05）；20ug/ml組高于10、40ug/ml組（P0.05）；40ug/ml組高于10ug/ml組（P0.05）。（見圖1、表1）。存活卵母細胞（400倍）異常卵母細胞（4

14、00倍）受精卵母細胞（400倍）圖1 解凍后成熟及受精的卵母細胞形態(tài)2.2 細胞松弛素B對卵母細胞受精率的影響 CB濃度為20ug/ml組受精率高于對照組，CB濃度為5、10、40ug/ml組受精率低于對照組，但均無顯著性差異（P0.05）。CB各濃度組間具有統(tǒng)計學（P0.05），兩兩比較CB濃度為20ug/ml組受精率高于5、10、40ug/ml組（P0.05）；10、40ug/ml組高于5ug/ml組（P0.05）；10ug/ml組高于40ug/ml組（P0.05）。（見圖1、表1）。2.3 細胞松弛素B對卵母細胞6-8cell胚胎形成率的影響 CB濃度為20、40ug/ml組6-8cel

15、l胚胎形成率高于對照組，且CB濃度為40ul/ml組差異有顯著性（P0.05）。CB各濃度組間具有統(tǒng)計學（P0.05），兩兩比較CB濃度為20、40ug/ml組胚胎形成率高于5、10ug/ml組（P0.05），40ug/ml組高于20ug/ml組（P0.05）；10ug/ml組高于5ul/ml組（P0.05）。（見圖2、表1）。表1 細胞松弛素B對小鼠成熟卵母細胞凍融的影響組別：CB濃度（ug/ml）取卵數（M期）復蘇率（%）受精率（%）6-8cell胚率（%）08868（77.3）38（55.9）18（47.4）510088（88.0）36（40.9）d14（38.9）de1011276（6

16、7.9）bd36（47.4）d16（44.4）de20108100（92.6）a68（68.0）44（64.7）40128100（78.1）d42（42.0）d29（69.0）a注：a P0.05，與對照組比較；b P0.05，與5ug/ml組比較；c P0.05，與10ug/ml組比較；d P0.05，與20ug/ml組比較；e P0.05，與40ug/ml組比較2cell（400倍）4cell（400倍）8cell（400倍）圖2 體外受精后胚胎的2-8cell形態(tài)3 討 論1986年Chen6報道第一例凍融人卵母細胞成功以來，2008年國內外僅有900多例凍卵胎兒出生的報道7 ，卵子冷凍

17、尚未常規(guī)運用于臨床。Borini8等2004年報道慢速冷凍人772枚卵子，解凍737枚卵子中有273枚存活(37%)，經ICSI受精124枚(45.4%)。2009年田秀朱9等報道采用不同蔗糖濃度(0.1、0.2、0.3mol/L)的冷凍保護劑程序化冷凍205枚人卵母細胞，復蘇后的存活率分別為23.1%、40.8%、59.4%。陳子江10等2006年報道玻璃化冷凍235個人卵母細胞，解凍后存活169個（71.9%），ICSI受精122個（72.2%）。有研究指出卵母細胞是人類最大的細胞，表面積與體積比值小11，妨礙了卵膜水與冷凍保護劑的交換，冷凍過程中細胞骨架的易受損傷性，解凍后的復蘇率不高。

18、細胞骨架是由微管、微絲和中間纖維組成，分布于整個細胞質中。微管組成的紡錘體裝置是一個功能性組織，促進染色體在分裂過程中分離及第一和第二極體的排出，確保正常的染色體分離避免非整倍體12。徐千花13等2009年通過激光共聚焦顯微鏡下觀察玻璃化凍溶后人成熟卵母細胞的紡錘體及染色體形態(tài)正常率與未冷凍組相比差異具有顯著性，冷凍組21個，正常5個（24%），未冷凍組26個，正常16個（62%）。成熟卵母細胞的染色體附著于第二次減數分裂紡錘體易變的微管上，紡錘體對低溫敏感，冷凍過程易導致微管解聚、染色體彌散，存活率、受精率和后期發(fā)育潛能降低14。因此，提高細胞骨架在玻璃化冷凍過程中的穩(wěn)定性，將有可能提高卵母

19、細胞冷凍的存活率、受精率以及發(fā)育潛能，減少冷凍損傷。已有研究指出細胞松弛素B可以減弱細胞骨架基礎的堅固性，增加細胞柔韌性，減少冷凍對細胞骨架的損傷。動物實驗中的顯微操作采用CB進行預處理的研究雖多，有效性尚有爭議。2004年Fujihira15等發(fā)現在豬胚胎玻璃化冷凍中添加細胞松弛素B，可顯著提高囊胚的生存和發(fā)育。2004年朱德生16等報道在核移植過程中用CB處理小鼠卵母細胞能使細胞結構變得松弛，減少去核操作時對受體胞質的損傷，采用10ug/ml的CB預處理后去核率88.2%（270/306），無CB預處理組去核成功率29.7%（38/128）。2008年崔龍波17等在核移植過程中用CB濃度5

20、40ug/ml處理小鼠卵母細胞,通過激光共聚焦掃描顯微鏡觀察紡錘體結構未見異常。Somfai等18 2006年報道CB提高了玻璃化冷凍豬成熟卵母細胞的存活率和發(fā)育率。但張波等19 2007年用5ug/mlCB預處理M期小鼠卵母細胞351枚后進行玻璃化冷凍，解凍后觀察存活率、受精率、卵裂率及囊胚率，未證實其具有保護作用。2008年張家新等20采用2.5、5.0、7.5和10ug/mlCB預處理綿羊成熟卵母細胞597枚，經過玻璃化凍融后存活率、卵裂率、囊胚率均顯著低于對照組。這些是否屬于物種間或方法學的差異尚需進一步研究。 本實驗以昆明小鼠為模型，采用成倍遞增方式設置了4個CB濃度處理組。通過解凍

21、后卵母細胞復蘇率及受精率顯示，CB濃度為20ul/ml組高于各組，且復蘇率與10、40ug/ml、對照組具有顯著差異（P0.05），受精率與5、10、40ug/ml組具有顯著差異（P0.05）；CB濃度為40、20ug/ml組6-8cell胚胎發(fā)生率高于各組，40ug/ml組與20ug/ml組無顯著差異（69.0% vs 64.7%，P0.05），20ug/ml組與對照組差異不顯著（64.7% vs 47.4%，P0.05）。由此可見CB在一定程度上能夠降低細胞骨架對冷凍損傷的敏感性，對骨架成分具有特定的可逆性作用，提高細胞中這些成分的柔韌性，特別是濃度為20ug/ml的CB減輕凍融對小鼠卵母

22、細胞的損傷，提高存活率及胚胎的后期發(fā)育潛能具有很好的促進作用。本實驗提示CB在小鼠成熟卵母細胞的玻璃化冷凍過程中具有一定的冷凍保護作用，但CB在人卵母細胞冷凍中的作用報道較少，最佳處理時間和濃度有待進一步的研究和探索。 參考文獻1 Kuleshova K,Gianaroli L,Magli C,et al.Birth following vitrification of a small number of human oocytes:case reportJ.Hum Reprod,1999,14:3077-3079.2 Fabbri R,Porcu E,Marsella T,et al.Tec

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