基因組關(guān)聯(lián)分析地衣芽孢桿菌LCDD6對核桃苗的促生作用

1、應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報 Chin J Appl Environ Biol Doi: 10.19675/ki.1006-687x.2020.12010收稿日期 Received: 2020-12-05 接受日期 Accepted: 2021-04-01山東省農(nóng)業(yè)科技資金（2019LY009）、國家重點研發(fā)計劃（2017YFD0200804）和山東省雙一流建設(shè)項目（SYL2017XTTD03）資助 Supported by Agricultural science and technology fund of Shandong, China (2019LY009), National Key R&D

2、Program of China (2017YFD0200804), and Funds of Shandong “Double Tops” Program , China (SYL2017XTTD03)*通訊作者 Corresponding author (E-mail: HYPERLINK mailto:dyq dyq)基因組關(guān)聯(lián)分析地衣芽孢桿菌LCDD6對核桃苗的促生作用邴 輝1 王仲康1 杜秉海1, 3 馬海林2 汪城墻1 陳安鏡1 劉方春2 丁延芹1, 3*1山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 泰安 2710182山東省林業(yè)科學(xué)研究院 濟南 2500143山東省鹽堿地植物-微生物聯(lián)合修復(fù)工程技

3、術(shù)中心 泰安 271018摘 要 為了挖掘地衣芽孢桿菌LCDD6的應(yīng)用價值，我們將LCDD6基因組測序并進行了初步分析；通過鑒定培養(yǎng)基檢測菌株的促生功能；將LCDD6發(fā)酵液灌根處理核桃苗，60 d后測定核桃苗長勢、核桃葉片的光合作用和植株系統(tǒng)抗性；利用Illumina Miseq高通量測序分析了根際土壤的微生物菌群結(jié)構(gòu)。結(jié)果預(yù)測到與促生、生防相關(guān)的功能基因/基因簇10個；LCDD6具有產(chǎn)IAA、鐵載體、降解蛋白和解磷的能力；與LB對照組相比，處理組核桃苗株高、莖粗、分枝數(shù)分別增加了24.68%、7.03%和28.35%，植株鮮重和干重分別提高了12.96%和21.55%；葉片葉綠素含量提高了4

4、7.50%，達(dá)到極顯著性差異（P 0.01），在暗適應(yīng)下光系統(tǒng)的最大光化學(xué)效率提高了9.43%，達(dá)到顯著性差異（P 0.05）；葉片SOD、 POD和CAT酶活分別增強了20.58%、26.10%和16.67%；根際土壤微生物菌群的豐富度提高，有益菌的相對含量增加。研究表明， LCDD6對核桃幼苗具有穩(wěn)定的促生生防作用和豐富的基因資源，在綠色農(nóng)業(yè)發(fā)展中具有重要的研究和應(yīng)用價值。關(guān)鍵詞 地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）LCDD6；基因組；核桃苗；促生；生防Genome association analysis of the growth-promoting effec

5、t of Bacillus licheniformis LCDD6 on Walnut seedlingsBING Hui1, WANG Zhong-kang1, DU Bing-hai1, 3, MA Hai-lin2, WANG Cheng-qiang1, CHEN An-jing1, LIU Fang-chun2 & DING Yan-qin1,31 College of Life Science, Shandong Agricultural University, Taian 271018, China2 Shandong Academy of Forestry, Jinan 2500

6、14, China3 Shandong Engineering Research Center of Plant-Microbial Restoration for Saline-Alkali Land, Taian 271018, ChinaAbstract To explore the value of Bacillus licheniformis LCDD6 in agricultural application, we presented and analyzed the genome sequence of strain LCDD6. Meanwhile, the growth-pr

7、omoting function of strain LCDD6 was revealed using identification medium. Walnut seedlings were treated with the fermentation broth of strain LCDD6 and grew for 60 days. The growth condition, photosynthetic capacity, and system resistance of walnut seedlings were determined. The microbial community

8、 structure of the rhizosphere soil of strain LCDD6 was analyzed by Illumina Miseq. A total of 10 genes or gene clusters according to growth promotion and biocontrol capacity were predicted out. Strain LCDD6 could produce IAA, siderophore, and protease, and solubilize phosphate. Compared with the con

9、trol, the plant height, stem diameter, branch number, plant fresh weight and dry weight of walnut seedlings treated by strain LCDD6 were increased by 24.68%, 7.03%, 28.35%, 12.96%, and 21.55%, respectively. Under dark adaptation, the maximal efficiency of PSII photochemistry of walnut seedlings trea

10、ted by strain LCDD6 was increased by 9.43% （P 0.05）. The SOD, POD, and CAT activities of walnut seedlings treated by strain LCDD6 were increased by 20.58%, 26.10%, and 16.67%, respectively. The abundance of microbial community in the rhizosphere soil of walnut seedlings treated by strain LCDD6 was i

11、ncreased, furthermore, the relative content of beneficial bacteria and fungi were increased. Our results showed strain LCDD6 has a stable growth-promoting and biocontrol effect on walnut seedlings and rich gene resources, which could have important research and application value in the green agricul

12、ture development.Keywords Bacillus licheniformis LCDD6; genome; walnut seedling; growth promotion; biocontrol地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）是一種短桿狀的革蘭氏陽性、兼性厭氧細(xì)菌，1901年首次發(fā)現(xiàn)，至今已經(jīng)在NCBI上登記了188株（截止到2020年11月20日），其中30株上傳了完整的基因組（/genome/browse/#!/prokaryotes/412/）。研究發(fā)現(xiàn)地衣芽孢桿菌對于非生物脅迫如高溫、酸堿等耐受程度極高，而且還具有酶系豐富、產(chǎn)酶量高等

13、優(yōu)點，是具有較好的應(yīng)用潛能的菌種1-5。據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部微生物肥料和食用菌菌種質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心記載，地衣芽孢桿菌屬于微生物肥料的重要菌種資源。微生物肥料生產(chǎn)用菌種分為四級管理，根據(jù)其安全分級目錄，地衣芽孢桿菌屬于第一級（A.1）免做毒理學(xué)試驗的菌種，具有安全性（中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY 11092016）。地衣芽孢桿菌也被納入了中國飼料添加劑品種目錄（2013）中，飼料中添加地衣芽孢桿菌有助于飼料成分分解，幫助宿主更好地吸收利用，提高動物飼料的利用率6。地衣芽孢桿菌在豬、家禽及水產(chǎn)動物的養(yǎng)殖上已廣泛應(yīng)用，地衣芽孢桿菌BCR43能夠增加對蝦的免疫力和存活率7。地衣芽孢桿菌制劑對于人腸

14、道健康具有積極作用，能改善潰瘍性結(jié)腸炎患者的炎癥水平8。且從地衣芽孢桿菌中不斷有新的醫(yī)用活性物質(zhì)被發(fā)現(xiàn)，它在醫(yī)學(xué)上也具有重要的研究和應(yīng)用價值9。地衣芽孢桿菌已經(jīng)成為在農(nóng)業(yè)、工業(yè)、畜牧業(yè)、醫(yī)藥等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的重要微生物資源，也是研究較熱門的菌種10。由地衣芽孢桿菌制成的微生物菌劑在大田作物和經(jīng)濟蔬果上取得了顯著促生、生防效果。但是不同的菌株應(yīng)用效果存在較大差異，地衣芽孢桿菌FMCH001在干旱脅迫條件下促進玉米根莖的發(fā)育11；地衣芽孢桿菌HSW-16能夠緩解小麥的鹽脅迫，并在小麥的根長，枝長，鮮重和干重方面提高了6%-38%12；地衣芽孢桿菌A2使花生植株的鮮生物量、植株總長和根長分別提高了43

15、%、31%和39%13；地衣芽孢桿菌W10對桃樹褐腐病的致病菌有較強的抑制作用，能明顯推遲病害發(fā)生14。隨著基因組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們現(xiàn)在開始從獲得地衣芽孢桿菌完整的基因組核苷酸序列著手，啟動功能和比較基因組學(xué)的研究。Paul等研究了地衣芽孢桿菌GL174潛在生物防治作用，并通過基因組序列分析，評估了涉及生物防治和植物-細(xì)菌相互作用的基因功能15；Rey等在地衣芽孢桿菌ATCC 14580基因組中發(fā)現(xiàn)了與地衣素合成相關(guān)的基因16?；蚪M學(xué)的研究將為研究微生物代謝產(chǎn)物的合成調(diào)控機制，菌株之間不同表型差異的原因提供理論支撐，最終可能會改善菌株在生產(chǎn)應(yīng)用中的策略。關(guān)于地衣芽孢桿菌的促生作用研究多集中在

16、生理水平上，并沒有深入解析菌株的促生效應(yīng)，限制了菌株的應(yīng)用。本文所使用的菌株LCDD6是實驗室從玉米芯和雞糞發(fā)酵堆中分離得到的，通過基因組分析，同時挖掘其促生和生防相關(guān)基因資源，并將菌株的促生基因、促生能力和對核桃幼苗的促生作用進行關(guān)聯(lián)分析，研究結(jié)果闡釋了LCDD6的重要應(yīng)用價值，為綠色農(nóng)業(yè)發(fā)展奠定理論和應(yīng)用基礎(chǔ)。1材料和方法1.1材料菌種： 地衣芽孢桿菌LCDD6；核桃：香玲核桃實生苗。1.2培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基：酵母粉，5 g；蛋白胨，10 g；氯化鈉，10 g；水，1000 mL；固體培養(yǎng)基添加瓊脂粉16 g；121 滅菌20 min；pH 7.0。豆芽汁培養(yǎng)基：豆芽，100 g；水煮30

17、min，取濾液；蔗糖，20 g；定容至1000 mL，121 滅菌20 min。有機磷培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，硫酸銨0.5 g，氯化鈉0.3 g，酵母浸粉0.5 g，氯化鉀0.3 g，硫酸鎂0.3 g，硫酸亞鐵0.03 g，硫酸錳0.03 g，卵磷脂0.2 g，碳酸鈣1.0 g，瓊脂15 g，pH 7.0-7.5；水，1000 mL；121 滅菌15 min。鐵載體產(chǎn)生菌的鑒定用CAS培養(yǎng)基17。脫脂奶粉培養(yǎng)基：脫脂奶粉15 g，水 1000 mL，瓊脂15 g。108 高壓滅菌15 min。1.3菌株促生功能鑒定1.3.1液體培養(yǎng) 在LB固體平板上活化菌種，單菌落接種于液體培養(yǎng)基，37 ，1

18、80 r/min，過夜培養(yǎng)。1.3.2分泌吲哚乙酸（Indole-3-acetic acid, IAA）定性測定 按1%接種量向含有L-色氨酸（200 mg/L）的LB液體培養(yǎng)基中接菌，28 ，180 r/min，搖床培養(yǎng)4 d。取50 L菌懸液滴于白色陶瓷板上，加50 L Salkowski比色液。同時用50 mg/L IAA加入比色液作為陽性對照，將白色陶瓷板暗光保存30 min，如果顏色變紅，表明細(xì)菌有產(chǎn)IAA的能力。1.3.3產(chǎn)鐵載體的鑒定 LB平板上活化菌株，再用滅菌的牙簽挑取單菌落接到CAS固體檢測平板上，37 倒置培養(yǎng)2-3 d，菌落周圍顯示橙色圈，表明產(chǎn)生鐵載體。1.3.4解有

19、機磷能力鑒定 用無菌牙簽將活化菌種接種到有機磷培養(yǎng)基平板上，28 培養(yǎng)2-5 d后，菌落周圍有透明圈出現(xiàn)，表明具有解磷功能。1.3.5降解蛋白能力鑒定 用無菌牙簽將活化菌種接種到脫脂奶粉培養(yǎng)基平板上，37 恒溫培養(yǎng)16-26 h后，菌落周圍有透明圈出現(xiàn)，表明具有降解蛋白的能力。1.4盆栽實驗1.4.1盆栽試驗設(shè)計 盆栽試驗在試驗田進行。實驗用40 cm 60 cm盆，每盆裝8.5 kg土，每個處理5個重復(fù)。育苗后移栽，緩苗7 d后，處理組取10 mL發(fā)酵液（2108 cfu/mL）用清水稀釋至1000 mL灌根，對照組取10 mL滅菌液體LB培養(yǎng)基并用清水稀釋至1000 mL灌根。每隔3 d澆

20、1次水，培養(yǎng)60 d后測量核桃苗各項指標(biāo)。1.4.2測定方法 （1）農(nóng)藝性狀。用米尺測量標(biāo)記幼苗地上莖的高度，用游標(biāo)卡尺測量離地2 cm部位的莖圍，計數(shù)主桿上的分枝數(shù)，進行記錄。計算株高增長值，莖粗增長值和分枝增長數(shù)。（2）核桃苗重。盆倒扣倒出核桃苗，盡可能保持植株的完整性，洗凈核桃根際土，迅速用濾紙吸干水分，短時間內(nèi)完成稱量核桃苗鮮重并記錄；將核桃苗放入烘箱，105 殺青，85 烘干至恒重，稱量干重并記錄。（3）葉綠素和光合作用。測定葉綠素含量，參照文獻(xiàn)18；使用封閉式熒光儀（Photon Systems Instruments FluorCam 800MF，易科泰生態(tài)技術(shù)）測量植株同一位置

21、葉片的暗適應(yīng)下光系統(tǒng)最大光化學(xué)效率。（4）葉片酶活。核桃苗葉片的超氧化物岐化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）活性測定參考文獻(xiàn)18。（5）土壤微生物群落結(jié)構(gòu)分析。施菌60 d后，盆倒扣倒出核桃苗，盡可能保持植株的完整性，抖掉根上的松散土壤，小心收集根際土，采集對照組（標(biāo)記為CK）和處理組（標(biāo)記為LCDD6）的土樣各三份，樣品采集后立即放4 保存，盡快轉(zhuǎn)移到-80 冰箱保存?zhèn)溆?。土壤樣品由上海派森諾生物科技有限公司用Illumina Miseq平臺進行高通量測序。土壤微生物總DNA的提取使用E.Z.N.A.Soil DNA Kit試劑盒（美國OMEGA公司），之后通過16S

22、 rDNA（27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG/1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT）和ITS（ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG/ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC）引物進行測序分析。1.5基因組測序分析1.5.1試驗流程 將LCDD6于液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)16 h至對數(shù)生長期后期離心收集菌體，使用康為試劑的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取總DNA，檢測合格后進行測序，分別進行組分、通用功能和特殊功能鑒定。1.5.2數(shù)據(jù)分析 采用Illumina Hiseq結(jié)合第三代測序技術(shù)完成菌株LCDD6的基因組完成圖測序，使用ABySS拼接軟件對

23、Illumina測序數(shù)據(jù)進行初步組裝，使用CANU軟件進行后續(xù)組裝，最終獲得基因組最優(yōu)組裝結(jié)果。利用Genemark分析工具進行基因預(yù)測，之后將預(yù)測基因的蛋白序列分別與Nr、genes、string和GO數(shù)據(jù)庫進行blastp比對，從而獲得預(yù)測基因的注釋信息。通過antiSMASH程序進行抗生素類物質(zhì)生物合成基因簇的快速鑒定，注釋和分析。2結(jié)果與分析2.1地衣芽孢桿菌LCDD6形態(tài)和基因組特征LCDD6（CGMCC NO.19225）是實驗室專利保存菌種，菌落為白色、不透明、形狀不規(guī)則，革蘭氏陽性菌（圖1）。將LCDD6基因組序列通過比對后確定為地衣芽孢桿菌，其基因組信息提交GENBANK（/

24、nuccore/CP065029）。LCDD6基因組包含1條染色體，基因組大小為4249389 bp， GC含量46.22%。共有4736個編碼蛋白的基因，總長度為3799830 bp，占總序列的89.02%，平均每個基因長度為802 bp，基因區(qū)GC含量為47.03%（圖2）。圖1 LCDD6菌落形態(tài)。Fig.1 Bacterial LCDD6 colony morphology. 圖2 LCDD6的基因組環(huán)形圖譜。Fig.2 Ring map of LCDD6 genome.2.2 LCDD6促生特性通過鑒定培養(yǎng)基驗證其可以產(chǎn)吲哚乙酸（圖3A）、降解蛋白質(zhì)（圖3B）、分泌鐵載體（圖3C）以

25、及溶解有機磷（圖3D）。LCDD6菌株的這些特征表明它可以活化土壤中的鐵和磷，將有機氮降解轉(zhuǎn)化，并直接產(chǎn)生植物激素IAA，從而促進植物生長。圖3 LCDD6功能鑒定。（A）產(chǎn)IAA（B）產(chǎn)蛋白酶（C）產(chǎn)鐵載體（D）解磷Fig.3 Identification of LCDD6 function. (A) IAA (B) protease (C) siderophore (D) phosphorus-solubilizing2.3產(chǎn)吲哚乙酸（IAA）關(guān)鍵基因分析合成植物激素IAA促進植物生長是細(xì)菌促生的作用機理之一。細(xì)菌合成IAA有三條主要途徑：吲哚-3-丙酮酸（indole-3-pyruvic

26、acid，IPA）途徑、吲哚-3-乙酰胺（indole-3-acetamide，IAM）途徑和吲哚-3-乙腈（indole-3-acetonitrile，IAN）途徑19。通過對LCDD6基因組的分析發(fā)現(xiàn)（表1），LCDD6菌中IAA主要是通過IPA途徑合成的：以色氨酸為前體物質(zhì)，在patB編碼的氨基轉(zhuǎn)移酶的催化下轉(zhuǎn)化為吲哚3-丙酮酸，然后在yclC編碼的脫羧酶的作用下形成吲哚-3-乙醛，最后在aldH編碼的醛脫氫酶（NAD+）作用下氧化成IAA20。在LCDD6菌株中還找到了酰胺酶的編碼基因amiE，酰胺酶是細(xì)菌通過吲哚乙酰胺（IAM）途徑合成IAA必需的，推測LCDD6在特定條件下還可以通

27、過IAM途徑合成IAA。表1 LCDD6產(chǎn)IAA相關(guān)基因Table 1 Production of IAA related genes in LCDD6 genome基因編號 ID基因功能 FunctionKEGG編號 KEGG IDKO基因編號 KO/Gene_ID基因 GeneLCDD6003707aminotransferase3K14155patBLCDD6000419UbiD family decarboxylaseyclCLCDD6000268aldehyde dehydrogenase (NAD+)K00128aldHLCDD6003966amidaseK01426amiE2.4

28、解有機磷相關(guān)基因分析堿性磷酸酶、堿性磷酸二酯酶和堿性磷脂酶是用來評價有機磷轉(zhuǎn)化為無機磷的常用指標(biāo)，編碼堿性磷酸酶的基因有phoA 、phoB和 phoX，編碼堿性磷酸二酯酶的基因 phoD，編碼甘油磷酸二酯酶的基因glpQ、編碼環(huán)狀二核苷酸磷酸二酯酶的基因yybT21-22。據(jù)報道，絕大部分堿性磷酸酶同時還具有堿性磷脂酶的活性23。LCDD6基因組中與解有機磷相關(guān)的基因有4個（表2）。表2 解有機磷相關(guān)基因Table 2 Genes related to degradation of organophosphorus基因編號 ID基因功能 FunctionKEGG編號 KEGG IDKO基因編

29、號 KO/Gene_ID基因 GeneLCDD6002826alkaline phosphataseK01077phoA、phoBLCDD6003358alkaline phosphatase DK01113phoDLCDD6002854glycerophosphodiester phosphodiesterase6K01126glpQLCDD6004709cyclic dinucleotide phosphodiesterase9K22927yybT、gdpP2.5產(chǎn)鐵載體相關(guān)基因分析細(xì)菌可以通過不依賴于非核糖體肽（NRPS）途徑合成鐵載體， IucA和IucC合成酶是該途徑的重要標(biāo)志24-

30、25。通過對LCDD6基因組的比對分析發(fā)現(xiàn)，LCDD6菌株與地衣芽孢桿菌TCCC 11148、類地衣芽孢桿菌ZAP17等菌株的基因組中都存在相同的鐵載體合成基因簇，LCDD6中該基因簇位置為1217445-1230030，主要包括10個基因，其中包含兩個核心合成基因（表3）。表3 產(chǎn)鐵載體相關(guān)基因Table 3 Genes related to siderophore-producing基因編號 ID基因功能 FunctionLCDD6001260IucA/IucC family siderophore biosynthesis protein LCDD6001263 IucA/IucC fa

31、mily siderophore biosynthesis protein 2.6 LCDD6抗生素合成相關(guān)基因分析使用antiSMASH程序分析LCDD6和拮抗相關(guān)的基因簇，發(fā)現(xiàn)LCDD6的10個基因簇中有3個與已驗證產(chǎn)物的基因簇相似度為100%，分別是地衣素（Lichenysin），基因簇位置在368281-409379；嗜鐵素（Paenibactin）或桿菌素（Bacillibactin），基因簇位置在3789646-3804231和苔蘚素（Lichenicidin），基因簇位置在4016034-4020175，都是具有較好抗菌活性和應(yīng)用性的抗生素26-30。另外發(fā)現(xiàn)LCDD6菌株中脂肽

32、類物質(zhì)生物合成基因簇總長度為27564 bp，包含26個基因，基因簇位置在2133302-2160865；經(jīng)比對分析發(fā)現(xiàn)與貝萊斯芽孢桿菌 FZB42中豐原素（Fengycin）生物合成基因簇的相似性最高，為53%，總長度為49542 bp，包含了15個基因，其中相同的基因有yng E、yng F、yng G、yng H、yng I、yng J和dac C，我們猜測LCDD6菌株可能分泌與FZB42不同類型的脂肽類抗生素31。2.7 LCDD6菌株對核桃的促生作用2.7.1核桃農(nóng)藝性狀選取長勢一致的核桃苗移栽到盆中，菌劑處理60 d后收苗（圖4）。與對照相比，處理組株高提高了24.68%（圖4A

33、），莖粗增長了7.03%（圖4B），分枝數(shù)增加了28.35%（圖4C），鮮重增加了12.96%（圖4D），干重增加了21.55%（圖4F）。圖4 60d核桃幼苗生長情況。A）株高增長值（B）莖粗增長值（C）分枝數(shù)增長值（D）濕重（F）干重Fig.4 Walnut seedling growth after 60d. (A) Plant height (B) Stem thickness (C) Branch number (D) Wet weight (F) Dry weight2.7.2葉綠素含量與光合作用葉綠素是最重要的一類參與光合作用的色素32。處理組可以提高葉片葉綠素含量（圖5A），增

34、強光合作用（圖5C）。與對照相比，葉綠素含量提高了47.50%，達(dá)到極顯著性差異（P 0.01）；在暗適應(yīng)下光系統(tǒng)最大光化學(xué)效率提高了9.43%（圖5B），達(dá)到顯著性差異（P 0.05）。圖5 葉片葉綠素含量和PS最大光化學(xué)效率。Fig.5 Chlorophyll content and maximal efficiency of PSII photochemistry in leaves.2.7.3葉片酶活植物的SOD、POD和CAT活性變化能反應(yīng)植物對外界環(huán)境抗逆性的變化。本文測定了核桃葉片的三種酶活性，結(jié)果表明處理組核桃苗葉片的SOD酶活性提高了20.58%（圖6A）； POD酶活性提高

35、了26.10%（圖6B）；CAT酶活性提高了16.67%（圖6C）。圖6 核桃葉片SOD、POD和CAT含量。Fig.6 Content of SOD, POD and CAT in walnut seedling leaves.2.8 LCDD6對核桃根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響測序共得到9996個細(xì)菌OTU，其中CK對照組特有OTU 4295個，LCDD6處理組特有OTU 4087個；在真菌群落中，共得到1136個OTU，其中CK特有OTU有492個，LCDD6處理組特有OTU有518個。在相似度97%水平下將測序得到的序列進行（alpha）多樣性分析，表4為不同處理的核桃根際土壤的細(xì)菌和

36、真菌群落結(jié)構(gòu)和豐富度指數(shù)。與對照組相比，處理組的細(xì)菌和真菌菌群的Shannon指數(shù)分別降低了0.9%和12.89%；細(xì)菌和真菌菌群的Chao1指數(shù)分別提高了2.67%和10.83%，說明施加LCDD6菌株后，核桃根際土壤的細(xì)菌和真菌的群落多樣性降低但豐富度提高。表4 真菌和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的多樣性和豐富度指數(shù)Table4 Diversity and richness indices of bacterial and fungal communities 樣本 SampleChao1指數(shù) Chao1物種數(shù) Observed speciesSimpson指數(shù) SimpsonShannon指數(shù) Shan

37、non均勻度 Pielous evenness細(xì)菌BacteriaCK7313.64197.615942.90104.210.9990.00011.350.040.9050.005LCDD67508.611003.455409.83634.500.9990.00011.240.220.9070.005真菌FungiCK554.3740.98548.2339.670.9720.0046.590.1350.7240.015LCDD6614.0287.6599.4794.980.8710.1725.740.710.6200.172在屬分類水平對細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進行分析（圖7A），發(fā)現(xiàn)MND1、RB41、

38、芽孢桿菌屬（Bacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、類固醇桿菌屬（Steroidobacter）、溶桿菌屬（Lysobacter）和黃桿菌屬（Flavobacterium）等為核桃根際土壤的核心菌屬。與對照組相比，處理組中的芽孢桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、溶桿菌屬、黃桿菌屬等有益菌屬的相對豐度提高。在屬分類水平對真菌群落結(jié)構(gòu)進行分析（圖7B），發(fā)現(xiàn)被孢霉屬（Mortierella）、柄孢殼屬（Zopfiella）、酵母屬（Issatchenkia）、毛葡孢屬（Botryotrichum）、梭菌屬（Solicoccozyma）、鏈格孢屬（

39、Alternaria）等為核桃根際土壤的核心菌屬。與對照組相比，處理組中的酵母屬、梭菌屬等菌屬的相對豐度提高。芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、酵母屬和梭菌屬是公認(rèn)的對植物有不同程度的促生或防病作用的有益微生物33-36。圖7 屬水平上細(xì)菌（A）和真菌（B）群落結(jié)構(gòu)的組成和相對豐度（前20位）。Fig.7 Composition and relative abundance of bacterial (A) and fungal (B) community structures at genus levels (top 20).3討論細(xì)菌促進植物生長的作用機制包括直接和間接兩種方式。直接促生作用主要是通

40、過合成植物生長所需的化合物，如吲哚乙酸、ACC脫氨酶、細(xì)胞分裂素、赤霉素等，或通過固氮、解磷、解鉀等作用增加土壤環(huán)境中可直接吸收的氮、磷、鉀等有效元素含量37-38。間接作用是指細(xì)菌通過產(chǎn)生拮抗物質(zhì)，如產(chǎn)抗生素、氰化物等或者誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性來減少或阻止一種或多種由病原菌產(chǎn)生的有害作用來間接促進植物生長39；通過改善土壤微生物群落結(jié)構(gòu)也被認(rèn)為是一種間接的促生機制33。常見能產(chǎn)生植物激素IAA的促生細(xì)菌有：假單胞菌（Pseudomonas spp.）、根瘤菌（Rhizobium spp.）、巴西固氮螺菌（Azospirillum brasilense）、多粘類芽孢桿菌（Paenibacillu

41、s polymyxa）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、鏈霉菌（Streptomyces spp.）等19。在解淀粉芽孢桿菌SQR9中發(fā)現(xiàn)了吲哚丙酮酸脫羧酶，枯草芽孢桿菌ZJB-603和ATCC21697菌株、解淀粉芽孢桿菌FZB42均具有IAN途徑中的關(guān)鍵酶，不同種的細(xì)菌其產(chǎn)生IAA的途徑可能相同或不同，同種不同菌株也可能具有不同的途徑19-20。而本研究中的LCDD6菌株既發(fā)現(xiàn)了IPA途徑的關(guān)鍵酶又發(fā)現(xiàn)了IAN途徑中的關(guān)鍵酶，實驗室檢測它能夠產(chǎn)生IAA，說明它具有這兩種產(chǎn)IAA的合成途徑，至少有一種

42、途徑是完整的。土壤磷主要有無機磷和有機磷兩種形態(tài)，有機磷來源主要是生物殘體和有機肥，且其形態(tài)更為復(fù)雜40。有機磷礦化是增加土壤中有效磷的主要方式，細(xì)菌進行有機磷的礦化是通過產(chǎn)生堿性磷酸酶、堿性磷酸二酯酶和堿性磷脂酶來實現(xiàn)的，例如枯草芽孢桿菌NCD-2、解淀粉芽孢桿菌FZB42等均具有降解有機磷的功能41-42。LCDD6基因組中找到4個編碼堿性磷酸酶和堿性磷酸二酯酶的基因，而絕大部分堿性磷酸酶同時還具有堿性磷脂酶的活性，所以檢測的該菌降解卵磷脂的功能是堿性磷脂酶在發(fā)揮作用。微生物產(chǎn)生的鐵載體是一種Fe3+螯合劑，它不僅可以幫助微生物競爭鐵營養(yǎng)還能為植物提供有效鐵，鐵載體可分為兒茶酚型、羥肟酸型

43、或-羥基羧酸型17,43。產(chǎn)生鐵載體的途徑有依賴于非核糖體肽（NRPS）合成酶途徑和不依賴于NRPS合成酶途徑，有一些類型的鐵載體則是通過兩種途徑合成的，例如炭疽芽孢桿菌合成petrobactin25,43。研究表明，微生物不依賴于NRPS途徑合成鐵載體主要以IucA為代表的A型合成酶、以AcsA為代表的B型合成酶、以IucC為代表的C型合成酶為重要標(biāo)志。LCDD6中找到兩個核心合成基因Iuc A和Iuc C，說明其可以進行不依賴于NRPS途徑合成鐵載體，但本文所用的CAS方法并不能驗證鐵載體的類型。本文研究發(fā)現(xiàn)LCDD6菌株既具有直接促生作用也具有間接促生作用，其直接促生作用是通過產(chǎn)生特定的

44、代謝產(chǎn)物來完成的，通過基因組比對找到了產(chǎn)生鐵載體、吲哚乙酸和堿性磷脂酶等相關(guān)的功能基因，從平板試驗結(jié)果來看，該菌株能分泌鐵載體、吲哚乙酸、堿性磷脂酶和蛋白酶，說明LCDD6能夠產(chǎn)生有活性的代謝產(chǎn)物，與這些功能相關(guān)的基因是具有活性的。同時還發(fā)現(xiàn)有編碼非核糖體肽和脂肽類化合物合成相關(guān)基因，但這些基因的真實功能和菌株是否能分泌有活性的代謝產(chǎn)物是需要通過實驗進行驗證的，可以采用LC-MS和HPLC的方法進行研究。隨著組學(xué)技術(shù)和生物信息學(xué)的不斷完善，接下來可以利用比較基因組學(xué)進一步挖掘LCDD6的功能基因。4結(jié)論（1）LCDD6菌株具有豐富的促生基因資源。LCDD6菌株可以通過IPA途徑和IAN途徑合成

45、IAA；基因組上含有4個與降解有機磷有關(guān)的堿性磷酸酶和堿性磷酸二酯酶的基因，菌株具有礦化有機磷的功能；LCDD6中含有不依賴于NRPS途徑合成鐵載體的兩個核心合成基因Iuc A和Iuc C，具有產(chǎn)生鐵載體的能力；另外，發(fā)現(xiàn)LCDD6具有豐富的抗生素基因資源，包含地衣素、嗜鐵素或桿菌素、苔蘚素以及脂肽類物質(zhì)生物合成基因簇。（2）LCDD6菌株既能夠直接促進核桃苗的生長，又能夠通過誘導(dǎo)植株系統(tǒng)抗性和影響土壤微生態(tài)環(huán)境來間接促進核桃苗的生長。施用菌株發(fā)酵液使核桃苗光合作用顯著增強、提高了有機物質(zhì)的合成，使植株干重增加，植株的系統(tǒng)抗性增強；使核桃苗根際土壤微生物菌群的豐富度提高，芽孢桿菌屬、鞘氨醇單胞

46、菌屬、溶桿菌屬、黃桿菌屬、酵母屬、梭菌屬等有益菌屬的相對豐度提高。（3）LCDD6菌株具有明顯的促生功能，研究結(jié)果豐富了農(nóng)業(yè)微生物菌種資源和基因資源，該菌株具有較高的應(yīng)用和研究價值。菌株的代謝產(chǎn)物如鐵載體和抗生素類型及活性單位并沒有進一步的研究，今后將采用質(zhì)譜和高效液相色譜等方法詳細(xì)的分析有用的代謝產(chǎn)物，為更好的應(yīng)用菌株提供依據(jù)。參考文獻(xiàn) References1 Voigt B, Schroeter R, Britta Jrgen, Albrecht D, Evers S, Bongaerts J, Maurer K, Schweder T, Hecker M. The response of

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