第五章細(xì)菌和噬菌體的遺傳

1、第五章 細(xì)菌和噬菌體的遺傳1 細(xì)菌和病毒遺傳研究的意義生物的簡(jiǎn)單分類 自然界所有的生物都可以歸入真核生物 (eukaryote)和原核生物(prokaryote)兩大類。 細(xì)菌和藍(lán)綠藻屬于原核生物。構(gòu)成原核生物的細(xì)胞是原核細(xì)胞。原核細(xì)胞最基本的特征是沒有明確的核膜和核結(jié)構(gòu)，也沒有線粒體等細(xì)胞器，不能進(jìn)行典型的有絲分裂和減數(shù)分裂，只通過簡(jiǎn)單的裂殖方式增殖。因此，它們的遺傳物質(zhì)傳遞和重組的方式與真核生物不同。 病毒是最原始的生物，沒有細(xì)胞結(jié)構(gòu)，甚至自己不能進(jìn)行自主分裂，只能在宿主細(xì)胞內(nèi)以集團(tuán)形式增殖。 遺傳學(xué)研究從經(jīng)典水平發(fā)展到細(xì)胞水平，一個(gè)重要的條件是Morgan利用了果蠅這個(gè)模式試驗(yàn)材料。從細(xì)

2、胞水平發(fā)展到分子水平，有兩個(gè)必不可少的條件：（1）對(duì)基因的物理結(jié)構(gòu)和化學(xué)結(jié)構(gòu)的了解；（2）以微生物為研究材料。 1 細(xì)菌和病毒遺傳研究的意義一、細(xì)菌（ Bacteria）細(xì)菌是單細(xì)胞生物，是地球上最多的一類生物，它占據(jù)了地球上大部分的生物干重。 細(xì)菌的繁殖非?？欤谶m宜的條件下，每20分鐘就能繁殖一代，從一個(gè)細(xì)胞裂殖變成兩個(gè)細(xì)胞。假如以一個(gè)細(xì)胞為基數(shù)，繁殖一代成為2個(gè)，繁殖2代成為4個(gè)。繁殖n代，就有2n-1+1個(gè)。一晝夜以24小時(shí)計(jì)，可以繁殖72代，總個(gè)數(shù)為271+12.361021。 細(xì)菌的基因組很小，只有一條染色體，研究起來非常方便。細(xì)菌群體大，即使突變率很低，也很易得到各種不同的生化突

3、變型。 細(xì)菌遺傳研究的方法： 用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌，待其繁殖到一定程度，用吸管吸取幾滴培養(yǎng)液，滴到固體的瓊脂糖培養(yǎng)基上，用一根滅菌的玻璃棒涂布均勻。若涂布的細(xì)菌濃度很低，單個(gè)細(xì)胞可以分散開來（圖72）。由于每個(gè)細(xì)胞不移動(dòng)的裂殖增生，經(jīng)過大約一夜，每個(gè)細(xì)胞的后代可達(dá)107個(gè)，且集合成群，成為肉眼可見的菌落（colony），或稱為克?。╟lone）。 單個(gè)細(xì)菌繁殖而成的菌落中，每個(gè)細(xì)胞的遺傳組成都應(yīng)該是一樣的，但可以發(fā)生突變，突變后所形成的菌落也會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化。 突變有幾類：形態(tài)性狀突變、生理特性突變、抗性突變。 菌落形狀的突變包括菌落的大小、形狀和顏色。如引起小鼠肺炎的野生型肺炎雙球菌本來形成

4、大而光滑的菌落，而有一種突變形的菌落小而粗糙。 生理特性的突變主要是喪失合成某種營養(yǎng)物質(zhì)的能力，稱為營養(yǎng)缺陷型。如野生型細(xì)菌可以自己合成色氨酸，可能突變以后就不能合成了，若不在培養(yǎng)基中添加色氨酸，該菌就會(huì)死亡。營養(yǎng)缺陷型可以用不同的選擇培養(yǎng)基來檢測(cè)。 抗性突變主要是指抗藥性的突變。在野生型細(xì)菌培養(yǎng)基中加入青霉素（penicillin），可以阻止細(xì)胞壁的形成，從而殺死細(xì)菌。但有抗penicillin的菌株，記為pen r ，對(duì)penicillin敏感的菌株(野生型)記為pen s 。 檢測(cè)突變的方法影印法（圖73）。 先在一個(gè)母板（master plate）上使細(xì)菌長成菌落。 用一個(gè)比培養(yǎng)皿略小

5、的木板，包上消過毒的絲絨。在母板上印一下，使菌落吸附在絲絨上，再把絲絨印到各種不同成分的培養(yǎng)基上。（事先應(yīng)在培養(yǎng)皿的不同方向作好標(biāo)記） 假如在缺乏色氨酸的培養(yǎng)板上有一個(gè)菌落不能生長，則該菌落很可能是色氨酸營養(yǎng)缺陷型，記為try - 。即可在母板上的對(duì)應(yīng)位置挑取菌落，繼續(xù)培養(yǎng)，供進(jìn)一步研究。 若在加有penicillin的培養(yǎng)板上能夠生長的菌落，一定是pen r 突變型，可以直接挑取，供進(jìn)一步研究中。二、病毒（ virus）病毒比細(xì)菌更為簡(jiǎn)單，也只有一條染色體（單倍體）。 病毒的結(jié)構(gòu)很簡(jiǎn)單，只有蛋白質(zhì)外殼和被外殼包裹著的核酸（遺傳物質(zhì)），沒有自身進(jìn)行代謝和分裂所必須的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器，必須借助宿主

6、細(xì)胞的代謝系統(tǒng)才能繁殖自己。所以，病毒都是寄生性的，它們必須生活在活細(xì)胞內(nèi)。 病毒按寄主可分為：動(dòng)物病毒，植物病毒，細(xì)菌病毒。 病毒按遺傳物質(zhì)可分：RNA病毒，DNA病毒。 細(xì)菌病毒（Bacterio-phage）又稱為噬菌體（phage）。噬菌體是研究得比較清楚的病毒。 噬菌體侵染細(xì)菌后，使細(xì)菌不能生長，而在均勻生長的細(xì)菌培養(yǎng)板上形成噬菌斑（plaque）。根據(jù)噬菌斑的形態(tài)和生長特點(diǎn)可以鑒別不同的噬菌體。 噬菌體按其在宿主細(xì)胞中的生活方式又可分為：溫和噬菌體和烈性噬菌體兩大類。 表71 三、細(xì)菌和病毒在遺傳研究中的優(yōu)越性。 世代周期短，繁殖塊，繁殖系數(shù)高。大腸桿菌每20分鐘繁殖一代，噬菌體每

7、小時(shí)可擴(kuò)增百倍。用它們作為研究材料，可以大大節(jié)約實(shí)驗(yàn)時(shí)間。 易于管理和進(jìn)行生物化學(xué)分析。 遺傳物質(zhì)比較簡(jiǎn)單，用于研究基因結(jié)構(gòu)、功能及表達(dá)調(diào)控機(jī)制比較方便。 細(xì)菌和病毒均只有一條染色體（DNA or RNA），結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，不必通過復(fù)雜的化學(xué)分析就可以對(duì)基因結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行精細(xì)的研究。 便于研究基因的突變，因?yàn)樗鼈兪菃伪扼w，所有的突變都能立即表現(xiàn)出來，沒有顯性掩蓋隱性的問題，也不存在分離問題。而且數(shù)量龐大，突變率很低的突變都能檢測(cè)到。 便于研究基因的作用，代謝作用旺盛，能在短時(shí)間內(nèi)積累大量代謝產(chǎn)物，便于對(duì)其本身及其產(chǎn)物進(jìn)行化學(xué)分析。 可用作研究高等生物的簡(jiǎn)單模型。高等生物體內(nèi)機(jī)制復(fù)雜，目前還難以進(jìn)行詳

8、細(xì)研究，而細(xì)菌和病毒結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，可作為模型研究，為開展高等生物的遺傳研究奠定基礎(chǔ)，積累資料。病毒利用寄主的代謝系統(tǒng)進(jìn)行繁殖，勢(shì)必其代謝方式與寄主有相似之處，因此可作為研究寄主的簡(jiǎn)化模型。 四、細(xì)菌和病毒的擬有性過程。 細(xì)菌和病毒的遺傳物質(zhì)也可以從一個(gè)個(gè)體傳遞到另一個(gè)個(gè)體，也能形成重組體。因?yàn)檫@不同于真核生物的有性生殖，被稱之為擬有性過程。 實(shí)際上，所謂的擬有性過程指的是細(xì)菌或病毒獲取外源遺傳物質(zhì)的方式或途徑。 細(xì)菌與細(xì)菌之間的遺傳物質(zhì)的交流（擬有性過程）。有四種不同的方式：轉(zhuǎn)化、結(jié)合、性導(dǎo)和轉(zhuǎn)導(dǎo)。 2 噬菌體的遺傳分析 一、噬菌體的結(jié)構(gòu)與生活周期 噬菌體(bacteriaphage or pha

9、ge)是病毒的一類，結(jié)構(gòu)很簡(jiǎn)單，基本上由一個(gè)蛋白質(zhì)外殼包裹著一些核酸組成的。噬菌體的多樣性來自于組成其外殼的蛋白質(zhì)的種類，以及其染色體的類型和結(jié)構(gòu)的不同。 （一）烈性噬菌體（ virulent phage） 遺傳學(xué)上應(yīng)用最廣泛的烈性噬菌體是大腸桿菌（ E.coli ）的T偶列噬菌體。它們的結(jié)構(gòu)大同小異，外貌一般呈蝌蚪狀。T偶列和T奇列有些不同，以T 2 的結(jié)構(gòu)最為典型（圖74）。 T偶列噬菌體的頭部為六角形，染色體為雙鏈DNA分子。 T偶列噬菌體的尾絲附著在E.coli表面時(shí)，通過尾鞘的收縮將DNA經(jīng)中空的尾部注入宿主細(xì)胞。DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞以后，隨即破壞宿主的遺傳物質(zhì)，并借助宿主細(xì)胞的代謝系

10、統(tǒng)，轉(zhuǎn)而合成大量的噬菌體DNA 和蛋白質(zhì)，組裝成許多許多新的小噬菌體。最后使宿主細(xì)胞裂解（lysis），一下子釋放出數(shù)百個(gè)子代噬菌體（圖75）。 這樣的噬菌體稱為烈性的噬菌體（virulent Phage）。 （二）溫和噬菌體（ temperate phage） 溫和性噬菌體具有溶原性（lisogeny）的生活周期。這類噬菌體侵入細(xì)菌以后，細(xì)菌細(xì)胞并不馬上裂解。 溫和性噬菌體有兩種類型。 （1）以為代表, 噬菌體侵入細(xì)菌后，細(xì)菌并不裂解，噬菌體的DNA附著于E.coli染色體的gal和bio位點(diǎn)之間的att位點(diǎn)上（attachment site），并通過交換而整合到細(xì)菌染色體上。整合以后，就能

11、阻止其它噬菌體的超數(shù)感染（superinfection）。整合在寄主染色體中的噬菌體稱為原噬菌體（prophage）。 超數(shù)感染：一個(gè)細(xì)菌受一個(gè)以上同種噬菌體感染的現(xiàn)象。 噬菌體的DNA被整合以后，既不大量復(fù)制，亦不大量轉(zhuǎn)錄和翻譯。往往只有一兩個(gè)基因表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物作為阻遏物關(guān)閉其他基因的表達(dá)。 被溶原性噬菌體感染了的細(xì)菌稱為溶原性細(xì)菌（lysogenic bacterium）。 當(dāng)溶原性細(xì)菌分裂成兩個(gè)子細(xì)胞時(shí)，噬菌體DNA隨細(xì)菌染色體的復(fù)制而復(fù)制，每個(gè)細(xì)胞中有一個(gè)拷貝。 原噬菌體通過誘導(dǎo)（induction）可轉(zhuǎn)變?yōu)榱倚允删w，進(jìn)入裂解周期。誘導(dǎo)可以通過不同的方式進(jìn)行，如UV照射、溫度改變、與

12、非溶原性細(xì)菌的接合等，誘導(dǎo)使阻遏物失活，使噬菌體的其他基因得以表達(dá)，促使噬菌體繁殖并進(jìn)入裂解周期。 （2）P 1 噬菌體 P 1 噬菌體感染E.coli以后，不整合到細(xì)菌DNA上，而是獨(dú)立存在于寄主細(xì)胞內(nèi)。P 1 DNA可以復(fù)制但不裂解宿主細(xì)胞，也不影響宿主細(xì)胞的正常代謝，但P 1 的復(fù)制可以使宿主的子細(xì)胞中也會(huì)有P 1 DNA，而且可以多于一個(gè)拷貝。 受P 1 噬菌體感染的細(xì)菌也可以因誘導(dǎo)而進(jìn)入裂解周期。 二、噬菌體的基因重組 兩個(gè)基因型不同的噬菌體同時(shí)感染一個(gè)宿主細(xì)胞，叫做混合感染（mixed infection）或雙重感染（double infection）。共同生存在同一個(gè)宿主細(xì)胞中的

13、兩個(gè)噬菌體的DNA也可以發(fā)生交換，產(chǎn)生基因重組。 比如，一個(gè)噬菌體的基因型是a b - ，另一個(gè)噬菌體的基因型是a - b ，同時(shí)感染同一個(gè)宿主細(xì)胞，宿主細(xì)胞裂解以后，可能釋放出基因型為a b 和a - b - 的重組體來。 研究最深入的噬菌體突變體是T 2 噬菌體的r - （rapid lysis速溶性）突變體。一個(gè)正常的T 2 噬菌體產(chǎn)生的噬菌斑小而邊緣模糊，記為r ，突變體r - 產(chǎn)生的噬菌斑大而邊緣清晰。 正常的T 2 噬菌體能感染E.coli B株。突變型E.coli B株能抗T 2 的感染，記為B/2株，T 2 噬菌體的突變型h - 又能克服B/2株的抗性，既能侵染B株又能侵染B/

14、2株，形成透明的噬菌斑。正常T 2 噬菌體記為h ，只能侵染B株，形成半透明的噬菌斑。 h - 和h 均能感染B株。用基因型為r h - 和r - h 的兩種T 2 噬菌體同時(shí)感染E.coli B株。這種現(xiàn)象稱為雙重感染（double infection）。 將雙重感染后釋放出來的子代噬菌體接種在同時(shí)長有B株和B/2株的培養(yǎng)皿內(nèi)，記錄噬菌斑的數(shù)目和形態(tài)。 h r 半透明，大 h r 透明，小，親本型。h r 透明，大 h r 半透明，小，重組型。 h r 和h r 為重組型。 重組值 （重組型噬菌斑數(shù)/總噬菌斑數(shù)） 100% （h + r + + h r ）/ ( h + r + + h r

15、+ h + r + h r + )100 不同速溶菌突變型的表現(xiàn)型不完全相同，分別記為r a 、r b 、r c 。用r x h + r + h 獲得的試驗(yàn)結(jié)果如下表。表72 雜交組合 每種基因型的 重組值 h + r h r + h + r + h r r a -h + r + h - 34.0 42.0 12.0 12.0 24/100=24% r b -h + r + h - 32.0 56.0 5.9 6.4 12.3/100=12.3% r c -h + r + h - 39.0 59.0 0.7 0.9 1.6/99.6=1.6% 根據(jù)表 72的結(jié)果可以分別作出3個(gè)連鎖圖。P155

16、 有四種可能的排列順序。P155 四種順序都是可能的，要確定到底是那一種，還缺條件。若知道r b 和 r c 之間的距離，就可以推知r b 、r c 和h的排列順序。 為此，需作r b +r c r b r c + 。結(jié)果r b 與r c 之間的距離大于r b 與h之間的距離，可知h應(yīng)位于r b 與r c 之間，即r b hr c 。 至于r a 位于h的哪一邊，是靠近r c 還是靠近r b ？因?yàn)門 2 DNA是環(huán)狀的，所以兩種答案都是正確的。 3 細(xì)菌的遺傳分析 細(xì)菌與細(xì)菌之間的遺傳物質(zhì)的交流（擬有性過程）有四種不同的方式：轉(zhuǎn)化、結(jié)合、性導(dǎo)和轉(zhuǎn)導(dǎo)。 一、轉(zhuǎn)化（ Transformation

17、） 細(xì)菌通過細(xì)胞膜攝取周圍環(huán)境中DNA體段，并通過重組將其整合到自身染色體中的過程，稱為轉(zhuǎn)化。 當(dāng)外源DNA進(jìn)入宿主后，使宿主產(chǎn)生新的表現(xiàn)型時(shí)就能測(cè)知轉(zhuǎn)化的發(fā)生。 肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化試驗(yàn)： 肺炎雙球菌有兩種不同的類型： S型，有毒，菌落光滑，又分為SI ,S,S R型，無毒，菌落粗糙，又分為RI R 1928年，Griffith，做了如下實(shí)驗(yàn)： R S S加熱后 R殺死后的S 當(dāng)時(shí)無法解釋這一結(jié)果，但可以肯定，加熱殺死后的S型含有某種促成R轉(zhuǎn)變?yōu)橛卸拘偷奈镔|(zhì)。 1944年，Avery不僅重復(fù)了上述試驗(yàn)，而且用從S型中提取DNA與R型菌混合在一起，在離體的情況下，也成功地使少數(shù)R型細(xì)菌轉(zhuǎn)變?yōu)镾型 經(jīng)

18、多種試驗(yàn)證明，導(dǎo)致這一轉(zhuǎn)變的物質(zhì)是DNA，這是細(xì)菌遺傳性狀定向轉(zhuǎn)化的第一個(gè)實(shí)例，也是DNA作為遺傳物質(zhì)的最直接的證據(jù)。 但是，并非所有的細(xì)菌都能夠發(fā)生轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化是有條件的。條件包括三個(gè)方面： 受體細(xì)胞的生理狀態(tài)； DNA片段的大小，形態(tài)和濃度； 外源DNA片段與受體DNA的同源程度。（同源是指核苷酸順序的相似程度。這里所說的同源是指整個(gè)染色體的核苷酸順序的近似程度，更重要的是所轉(zhuǎn)化的特定范圍的核苷酸的順序。） 只有那些生理上處于感受態(tài)（competence）的細(xì)胞（決定轉(zhuǎn)化因子能否進(jìn)入細(xì)胞）才能吸收外源DNA。感受態(tài)與細(xì)菌細(xì)胞的生長期有關(guān)。并不是細(xì)菌在整個(gè)生長周期中都能接受外源DNA。有人認(rèn)為

19、，DNA合成結(jié)束，蛋白質(zhì)合成旺盛時(shí)期的細(xì)胞易于吸收外源DNA。肺炎雙球菌和枯草桿菌的感受態(tài)都出現(xiàn)在對(duì)數(shù)期的后期。 外源DNA片段的大小與能否轉(zhuǎn)化有關(guān)。肺炎雙球菌要求外源DNA長于800bp，枯草桿菌要求大于16kb。外源DNA必須是雙鏈結(jié)構(gòu)而且應(yīng)達(dá)到一定的濃度。對(duì)于某一特定的DNA片段來說供體DNA分子的數(shù)量與轉(zhuǎn)化率之間有一定的相關(guān)。有實(shí)驗(yàn)表明，細(xì)胞壁或細(xì)胞膜上有固定數(shù)目的DNA接受座位，這些座位飽和以前，轉(zhuǎn)化體的數(shù)目與DNA濃度呈正相關(guān)，一旦這些座位達(dá)到飽和狀態(tài)，增加的DNA便不再影響轉(zhuǎn)化體的數(shù)目。 轉(zhuǎn)化過程： 當(dāng)受體細(xì)胞處于感受態(tài)時(shí)，符合要求的外源DNA分子可結(jié)合在受體細(xì)胞表面的幾個(gè)接受座

20、位上。最初的結(jié)合是可逆的。 穩(wěn)定結(jié)合在這些座位上的DNA分子隨后縱長地被細(xì)菌所吸收，這是不可逆的過程。 在外援DNA進(jìn)入細(xì)胞的過程中，有核酸外切酶降解其中的一條鏈，并利用降解過程中產(chǎn)生的能量，將另一條單鏈拉進(jìn)細(xì)胞中。 細(xì)菌轉(zhuǎn)化過程中的重組： a：供體片段與受體DNA聯(lián)會(huì)； b：?jiǎn)捂湹墓w片段與受體DNA部分變性部位的一個(gè)單鏈形成雙鏈，置換出受體的一條單鏈； c：完全形成新的雙鏈，但尚有缺口或切刻； d：被置換的受體單鏈被降解；。 e：雜合雙鏈的形成（通過DNA聚合酶和連接酶）。 f：通過DNA復(fù)制產(chǎn)生穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子。 摘自盛祖嘉分子遺傳學(xué)P104 供體的單鏈片段進(jìn)入細(xì)胞后與相應(yīng)的受體DNA片段聯(lián)

21、會(huì)，二者之間同源性越大，越容易形成雜交雙鏈。 外源的單鏈DNA在對(duì)應(yīng)位點(diǎn)置換受體DNA的一條鏈從而完成轉(zhuǎn)化的全過程。在相應(yīng)位置上受體的一條單鏈片段被置換下來，最終被降解。 整合對(duì)同源DNA具有特異性，視親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，整合的頻率不同。 轉(zhuǎn)化以后，只有出現(xiàn)了遺傳性狀的變異，才能得知轉(zhuǎn)化的發(fā)生。 由于DNA是以小片段的形式進(jìn)入的，所以距離很遠(yuǎn)的兩個(gè)基因很難同時(shí)存在于一個(gè)片段中，除非分別包括這兩個(gè)基因的兩個(gè)片斷同時(shí)進(jìn)入受體，它們一般是不能同時(shí)對(duì)受體進(jìn)行轉(zhuǎn)化的。按照概率原理，兩個(gè)片斷同時(shí)轉(zhuǎn)化的概率應(yīng)該是它們單獨(dú)轉(zhuǎn)化的概率的乘積，所以這種概率是很低的。但是，當(dāng)兩個(gè)基因密切連鎖時(shí)，它們就有較多的機(jī)會(huì)包括在

22、同一個(gè)DNA片斷中同時(shí)被整合到受體染色體中。因此，密切連鎖的基因可以通過轉(zhuǎn)化進(jìn)行作圖。 Nestar等用枯草桿菌（Bacullus subtilis）的一個(gè)菌株trp 2 + his 2 + tyr 2 + 做供體，提取DNA向受體trp 2 his 2 - tyr 2 菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化，結(jié)果列于表74。 從表中資料可見，經(jīng)過轉(zhuǎn)化的個(gè)體，即轉(zhuǎn)化體（transformant）中，數(shù)目最多的是三個(gè)座位同時(shí)被轉(zhuǎn)化的類別，這意味著所研究的三個(gè)座位在染色體上是靠得很近的。 計(jì)算trp 2 和his 2 之間的重組值時(shí)，685個(gè)trp 2 his 2 應(yīng)當(dāng)看成是沒有機(jī)會(huì)和帶有這兩個(gè)基因的供體DNA片斷相遇的細(xì)胞

23、，計(jì)算時(shí)不能考慮。同理，計(jì)算trp 2 和tyr 1 的重組值時(shí)不能考慮418個(gè)trp 2 tyr 2 ，對(duì)于his 2 和tyr 2 的重組率時(shí)則不考慮2600個(gè)his 2 tyr 2 。由表中的計(jì)算表明，三個(gè)基因的順是trp 2 his 2 tyr 2 。 轉(zhuǎn)化時(shí)細(xì)菌染色體的重組和接合一樣，只有一種重組體，相反的重組體是不存在的，只有雙交換和偶數(shù)次的多次交換才是有效的。 二、接合（conjugation） 在原核生物中，兩個(gè)細(xì)胞在相互接觸過程中，遺傳物質(zhì)從一個(gè)個(gè)體轉(zhuǎn)移到另一個(gè)個(gè)體的現(xiàn)象稱為接合。 輸出遺傳物質(zhì)的個(gè)體稱為供體（donor），又稱為“雄性”。接受外源遺傳物質(zhì)的個(gè)體稱為受體（re

24、ceptor），又稱為雌性。 E.coli（大腸桿菌）是遺傳學(xué)研究中應(yīng)用最為廣泛的細(xì)菌。野生型的E.coli可以在只含有鹽類和葡萄糖的簡(jiǎn)單培養(yǎng)基上生長。 1946年，Leaderberg和Tatum發(fā)現(xiàn)E.coli可以通過結(jié)合交換遺傳物質(zhì)。選用兩個(gè)不同營養(yǎng)缺陷型的E.coli菌株，A和B。A菌株，met bio ，需要在基本營養(yǎng)培養(yǎng)基上補(bǔ)充蘇氨酸（thr）和亮氨酸（leu）才能生長。采用多營養(yǎng)缺陷型是為了防止回復(fù)突變干擾試驗(yàn)結(jié)果。 A和B均不能在基本培養(yǎng)基上生長，但若將A和B在完全液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)幾個(gè)小時(shí)以后再涂布在基本培養(yǎng)基上，就能長出一些原養(yǎng)型（met + bio + thr + leu

25、+ ）的菌落。細(xì)菌的野生型又稱為原養(yǎng)型。換句話說，能夠在基本培養(yǎng)基上生長的細(xì)菌稱為原養(yǎng)型。這種原養(yǎng)型菌落的出現(xiàn)是轉(zhuǎn)化的結(jié)果呢，還是由于兩種不同類型細(xì)胞直接接觸而交換了遺傳物質(zhì)的結(jié)果呢？必須予以鑒別。因?yàn)樵谂囵B(yǎng)過程可能有部分細(xì)胞死亡放出DNA而發(fā)生轉(zhuǎn)化反應(yīng)。 1950年，Davis設(shè)計(jì)了一種U型管試驗(yàn)。在U型管兩臂分別放入帶有A菌株和B菌株的完全培養(yǎng)液，中間用過濾器隔開，過濾器的孔很小，細(xì)菌不能通過，但生物大分子，包括DNA分子可以自由往來。從U型管的一端使用加壓和吸引的方法使培養(yǎng)液和大分子相互混合，但細(xì)菌因有濾板相阻，彼此不能直接接觸。待兩側(cè)的細(xì)胞停止生長后，將它們分別涂布在基本培養(yǎng)基上，在任

26、何一臂內(nèi)都沒有長出菌落。說明：兩個(gè)菌株間的直接接觸是原養(yǎng)型細(xì)菌出現(xiàn)的必要條件。這就否定了轉(zhuǎn)化的可能。 1952年，Hages通過實(shí)驗(yàn)證明，在結(jié)合過程中，遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移是單向的。上例中是A轉(zhuǎn)向B，而不會(huì)反向轉(zhuǎn)移。所以一般可將供體看成“雄性”，受體看成“雌性”。在結(jié)合過程中，到底是什么東西由雄體輸入了雌體呢？ F因子。 A菌株之所以能成為供體，是因?yàn)樗幸粋€(gè)性因子（sex factor）又稱致育因子（fertility factor），簡(jiǎn)稱F因子。 攜帶F因子的菌株稱為供體菌或雄性，用F + 表示。沒有F因子的菌體稱為受體菌，又稱雌性，用F 表示。 F因子是雙鏈環(huán)狀DNA，分子量大約是3.510

27、6，是染色體外遺傳物質(zhì)，是質(zhì)粒的一種，在分類學(xué)上屬于附加體（episome）。它既能以自主狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中，又能整合到細(xì)菌的染色體內(nèi)。F小環(huán)與主染色體大環(huán)之間發(fā)生一次交換就可以插入到宿主染色體中。F因子整合到E.coli染色體上以后，該菌株就成為高頻重組株（High frequence recombination ,Hfr），以Hfr表示。 F因子處于自主狀態(tài)時(shí)，可以不依賴宿主細(xì)胞的染色體而獨(dú)立復(fù)制（每個(gè)F+細(xì)胞只有一個(gè)F因子）。據(jù)研究，F(xiàn)因子至少包含有15個(gè)基因，其中有的基因控制F傘毛（F pillus）的形成，F(xiàn)傘毛是F + 細(xì)胞表面伸出的一種長附屬物。F + 與F + 之間互不理睬，但

28、F + 和F 一旦相互接觸，F(xiàn)傘毛就變成了兩個(gè)細(xì)胞之間原生質(zhì)的通道，叫做結(jié)合管（conjugation tube）。F + 細(xì)胞中的F因子由結(jié)合管向F 傳遞，使F 變成F + 。 轉(zhuǎn)移時(shí)，F(xiàn)因子中的雙鏈之一被切開，這切開的單鏈從3端開始向F轉(zhuǎn)移，一旦進(jìn)入F 中就以此為模板，從53的方向復(fù)制，最終形成一個(gè)完整的雙連環(huán)狀F因子。另一條沒有切口的完整單鏈留在供體內(nèi)作為母板，進(jìn)行復(fù)制，也形成一個(gè)完整的F因子。在接合過程中，F(xiàn)因子的復(fù)制是按DNA復(fù)制的滾環(huán)模式進(jìn)行的，兩個(gè)接合產(chǎn)物，即接合后體（exconjugants）都成為F+，各具備一個(gè)F因子。 在Hfr中，F(xiàn)因子的復(fù)制是與宿主染色體同步進(jìn)行的。當(dāng)H

29、frF時(shí)，Hfr細(xì)胞可以把部分甚至全部染色體傳遞給F受體，而且當(dāng)供體和受體帶有不同的標(biāo)記基因時(shí)，相互之間的重組頻率很高，故而被稱為Hfr（High frequence recombination）。 當(dāng)Hfr與F 相互接觸時(shí)，整合在宿主染色體上的F因子的復(fù)制系統(tǒng)首先活躍起來，由內(nèi)切酶在F DNA的一端近端部切成單鏈缺口，細(xì)菌染色體以這一小段單鏈的F DNA為前導(dǎo)，向F 轉(zhuǎn)移。若時(shí)間充裕，整個(gè)Hfr細(xì)胞的染色體（包括F因子）都可以轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞，使F 變成Hfr，但這種情況較為罕見。大多數(shù)情況下，只有一小部分細(xì)菌染色體轉(zhuǎn)移，結(jié)合即行中斷，受體細(xì)胞仍保持為F ，因?yàn)镕 DNA的絕大部分仍留在供體內(nèi)，

30、F 得到的僅僅是F因子的一小部分。 值得注意的是：距離前導(dǎo)F DNA小片段越近的細(xì)菌染色體DNA越先轉(zhuǎn)移，越遠(yuǎn)的越后轉(zhuǎn)移。 當(dāng)Hfr菌的部分染色體進(jìn)入F 后，F(xiàn) 細(xì)胞中就有一段DNA具有2份拷貝，被稱為部分二倍體（partial diploid）或部分合子（mero zygote）。新轉(zhuǎn)入的DNA片斷稱為供體外基因子（exogenote），而受體的染色體稱為受體內(nèi)基因子（endogenote）。 外基因子和內(nèi)基因子可以發(fā)生交換而產(chǎn)生基因重組。部分二倍體中，若發(fā)生單數(shù)交換是沒有意義的，因?yàn)閱谓粨Q使環(huán)狀的內(nèi)基因子打開成為線性DNA，這種細(xì)胞是不能成活的。發(fā)生偶數(shù)次交換才能產(chǎn)生可遺傳的重組體（rec

31、ombinant）和一個(gè)片斷（fragment）。片斷以后為酶所降解。這樣，重組后的F細(xì)菌不再是部分二倍體，而是單倍體，得到的重組體的類型只有一個(gè)，而不是兩個(gè)，相反的重組體是不能存活的（例如有，沒有）。 用中斷雜交試驗(yàn)作染色體連鎖圖。 Hfr中的DNA向F轉(zhuǎn)移時(shí)，是從酶切端點(diǎn)開始直線式進(jìn)行的。為證明這一點(diǎn)，50年代有人設(shè)計(jì)了一個(gè)著名的中斷雜交試驗(yàn)（interrupted mating experiment）。 將一個(gè)Hfr菌株和一個(gè)F 菌株混合在一起進(jìn)行培養(yǎng)，使之發(fā)生接合， Hfr： str s thr + leu + azi s tonA s galb + lac + F ： str r t

32、hr - leu - azi r tonA r galb lac str r 對(duì)鏈霉素有抗性 azi r 對(duì)疊氮化合物有抗性 tonA r 對(duì)T 1 噬菌體有抗性 thr + leu + galb + lac + 對(duì)蘇氨酸、亮氨酸、半乳糖和乳糖為原養(yǎng)型 每隔一定時(shí)間吸取部分營養(yǎng)液放入食品攪拌器內(nèi)攪拌，以中斷雜交。經(jīng)過稀釋，接種到含有鏈霉素的完全培養(yǎng)板上，在培養(yǎng)過程中殺死所有Hfr 細(xì)胞，保留下來的全部為F。然后對(duì)形成菌落的F 細(xì)胞用影印法檢測(cè)其基因型。結(jié)果如下表和為圖717。 表75 大腸桿菌Hfr str s thr + leu + azi s tonA s galb + lac + F s

33、tr r thr - leu - azi r tonA r galb lac 的結(jié)果 標(biāo)記基因 轉(zhuǎn)入的時(shí)間（min） 頻 率 thr + 8 100（經(jīng)選擇的） leu + 8.5 100（經(jīng)選擇的） azi s 9 90 tonA s 11 70 lac + 18 40 galb + 25 25 混合培養(yǎng) 9分鐘后取樣，開始出現(xiàn)少量azi r 菌落，說明azi r 基因已經(jīng)進(jìn)入少數(shù)的F 細(xì)胞中。但對(duì)于T 1 噬菌體來說，全部F 細(xì)胞還屬于敏感型，說明tonA r 基因還沒有進(jìn)入F 中。11分鐘后才開始出現(xiàn)抗T 1 的 菌落（colony）。18min和24min取樣時(shí)，分別出現(xiàn)乳糖發(fā)酵和半乳

34、糖發(fā)酵的菌落。說明Hfr的基因確實(shí)是按一定的線性順序依次進(jìn)入F 的。也就是說，是以F DNA片斷上的酶切斷點(diǎn)為原點(diǎn)（記做O）開始以直線方式進(jìn)入F 細(xì)胞的?；蚓郞點(diǎn)越近，進(jìn)入F 越早，反之越晚。由于在自然狀態(tài)下不經(jīng)攪拌也能中斷雜交，因此，距O點(diǎn)越遠(yuǎn)的基因進(jìn)入F 的機(jī)會(huì)越少。 根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，用 Hfr基因在F 中出現(xiàn)的時(shí)間為標(biāo)準(zhǔn)，可以作出大腸桿菌的遺傳連鎖圖。 8 9 11 18 25 F 圖中以接合實(shí)驗(yàn)的時(shí)間作為遺傳距離的單位。 用不同的Hfr菌株進(jìn)行中斷雜交試驗(yàn)做出的E.coli基因連鎖圖，其基因向F細(xì)胞轉(zhuǎn)移的順序大不相同。見表7-6。 表76 用中斷雜交法確定的幾個(gè)Hfr菌株的基因順序

35、 Hfr的類型 基 因 轉(zhuǎn) 移 順 序 HfrH 0 thr pro lac pur gal his gly thi 1 0 thr thi gly his gal pur lac pro 2 0 pro thr thi gly his gal pur lac 3 0 pur lac pro thr thi gly his gal AB312 0 thi thr pro lac pur gal his gly 從表中可以看出，轉(zhuǎn)移順序的差異是由于各 Hfr之間轉(zhuǎn)移的原點(diǎn)（O）和轉(zhuǎn)移的方向不同所致。 該實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步說明F因子和細(xì)菌DNA都是環(huán)狀的，F(xiàn)因子插入環(huán)狀染色體的不同位置形成不同的轉(zhuǎn)移原點(diǎn)和

36、轉(zhuǎn)移方向。 重組作圖 如果兩個(gè)基因間的轉(zhuǎn)移時(shí)間差小于2分鐘，用中斷雜交法所測(cè)得的圖距是不太可靠的，還須采用傳統(tǒng)的重組作圖法予以驗(yàn)證。 例如，lac + 和ade 緊密連鎖，為了求得它們之間的準(zhǔn)確距離，用Hfr lac + ade + F lac ade 作雜交試驗(yàn)。雜交以后，用完全培養(yǎng)基但不加腺嘌呤，能使F ade + 生長。在中斷雜交試驗(yàn)中，ade + 基因進(jìn)入F 細(xì)胞的時(shí)間較lac + 遲，可知既然ade + 基因已經(jīng)進(jìn)入F ，lac + 位于ade + 之前，一定也已經(jīng)進(jìn)入了。進(jìn)一步對(duì)lac + 進(jìn)行篩選，若某菌株既是ade + 又是lac + ，說明在lacade之間沒有發(fā)生過交換，若

37、ade + 而lac ，說明在它們之間已發(fā)生了交換。（圖7-20） lac ade + 重組率= =22% (lac + ade + lac ade + ) 在中斷雜交試驗(yàn)中，這兩個(gè)基因進(jìn)入F細(xì)胞的時(shí)間差為1分鐘，可見，一分鐘大約相當(dāng)于20%左右的重組率。 三、性導(dǎo)（sexduction） 整合到細(xì)菌中的F因子也可以重新離開染色體，成為獨(dú)立的環(huán)。這個(gè)過程是整合的逆過程，稱為環(huán)出（looping out）。 F因子在環(huán)出過程中并不是完全準(zhǔn)確無誤的，往往連同部分染色體片段一同離開。部分染色體DNA與F DNA的雜合環(huán)稱為F因子。 F所攜帶的細(xì)菌DNA片段的大小不等，可以是一個(gè)基因，也可以長達(dá)細(xì)菌染

38、色體的一半。 F因子以極高的頻率轉(zhuǎn)移它所攜帶的基因。 F因子有極高的自整合率，且整合在一定的座位上，因?yàn)樗信c細(xì)菌染色體同源的區(qū)段。F因子整合在染色體上的位點(diǎn)不是固定不變的。 F因子進(jìn)入受體細(xì)胞以后，在整合以前，受體細(xì)胞就成為部分二倍體。F因子所攜帶的基因就可以在受體細(xì)胞中表達(dá)。 例如，某一Hfr系（ stock）的F因子在環(huán)出時(shí)帶走了lac + ，當(dāng)此F轉(zhuǎn)移到F lac以后，受體菌（receptor）成為 F + lac + 的比率很高。但lac位于染色體的遠(yuǎn)端，在中斷雜交試驗(yàn)中，只有1/100的受體成為F+ lac+。這是因?yàn)镕攜帶 lac + 基因進(jìn)入受體后使 lac座位成為部分二倍體F

39、lac + / lac ，lac + 對(duì) lac 是顯性，所以部分二倍體的表現(xiàn)型是 lac + 。 部分二倍體是不穩(wěn)定的，F(xiàn)因子可能丟失，使Flac + / lac 回復(fù)為lac ，但F也可以與染色體發(fā)生重組，形成穩(wěn)定的lac + 菌株。 性導(dǎo)（sexduction）：以F因子為媒介，將供體細(xì)胞的部分遺傳物質(zhì)導(dǎo)入受體細(xì)胞形成部分二倍體的過程稱為性導(dǎo)。 并發(fā)性導(dǎo)（Cosexduction）：兩個(gè)緊密連鎖的基因，同處于一個(gè)F因子上被轉(zhuǎn)移，稱為并發(fā)性導(dǎo)。 性導(dǎo)的意義： （1）性導(dǎo)產(chǎn)生部分二倍體，為研究單倍體細(xì)菌中等位基因間的顯隱性關(guān)系提供了可能的途徑。 （2）環(huán)出時(shí)，形成大量的F因子，不同F(xiàn)因子可能

40、攜帶E.coli的不同基因，因此并發(fā)性導(dǎo)是建立遺傳圖譜的重要途徑。 （3）性導(dǎo)形成的部分二倍體也可用作互補(bǔ)試驗(yàn)，確定兩個(gè)突變型是屬于同一個(gè)順反子還是屬于不同的順反子。四、轉(zhuǎn)導(dǎo)（ Transduction） 以噬菌體為媒介，將細(xì)菌的小片段染色體或基因從一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞的過程叫做轉(zhuǎn)導(dǎo)。 轉(zhuǎn)導(dǎo)是細(xì)菌遺傳物質(zhì)傳遞和交換的又一重要方式，它與轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合的主要不同之處在于是以噬菌體為媒介的。 轉(zhuǎn)導(dǎo)分為兩種：普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)和特異性轉(zhuǎn)導(dǎo)。 1、 普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo) EColi可以通過細(xì)胞與細(xì)胞的接合而交換遺傳物質(zhì)，那么，鼠傷寒沙門氏菌是否也有同樣的現(xiàn)象存在呢？ 用沙門氏菌的兩個(gè)突變株雜交，一個(gè)是phe

41、 tr tyr ,另一個(gè)是met his 。兩菌株分別培養(yǎng)時(shí)，沒有發(fā)現(xiàn)野生菌落。將兩菌株在基本培養(yǎng)基上混合培養(yǎng)時(shí)，大約10 5 個(gè)細(xì)胞可以得到一個(gè)原養(yǎng)型菌落。這似乎與E.coli的重組沒有什么不同。 為了證明這一點(diǎn)，將兩菌株放入U(xiǎn)型管的兩臂，中間用濾板隔開，以防止細(xì)胞接觸，但可以允許比細(xì)胞小的生物大分子通過，也獲得了野生型細(xì)胞。這說明沙門氏菌的基因重組不是通過細(xì)胞接合，而是通過過濾因子（filterable agent）而發(fā)生的。 以后發(fā)現(xiàn)這種過濾因子就是噬菌體P 22 。P 22 是一種沙門氏菌的噬菌體。 這一實(shí)驗(yàn)雖然沒有證明沙門氏菌中有接合現(xiàn)象存在，但是卻發(fā)現(xiàn)了噬菌體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移過程轉(zhuǎn)導(dǎo)。 P 22 感染細(xì)菌細(xì)胞時(shí)，細(xì)菌染色體斷裂成許多小片段。在形成子代噬菌體顆粒時(shí)，偶爾會(huì)產(chǎn)生錯(cuò)誤，把細(xì)菌染色體的片段組合到頭部。因?yàn)闆Q定噬菌體感染能力的是外殼蛋白，并不是外殼所包裹的遺傳物質(zhì)。所以，這種假噬菌體照樣可以吸附到細(xì)菌上，并注入其