1木瓜蛋白酶性質測定

1、木瓜蛋白酶性質測定一、實驗目的1、學習并掌握木瓜蛋白酶活性測定的基本原理。2、掌握影響木瓜蛋白酶性質的不同因素，如激活劑（如EDTA、半胱氨酸），抑制 劑、pH等。二、實驗原理木瓜蛋白酶（Papain）是一種巰基蛋白酶，它分解比胰臟蛋白水解酶更多、 更廣泛的蛋白底物。它也具有脂酶活力。其分子量約為23 000左右。木瓜蛋白 酶是單條肽鏈，由211個氨基酸殘基折疊成兩部分形成裂縫，酶分子只有1個巰 基，對酶活力是必需的，激活劑有半胱氨酸、硫化物、亞硫酸鹽和EDTA等；抑 制劑有巰基試劑，包括重金屬、羧基試劑和過氧化氫等。酪蛋白是一種蛋白質，它被木瓜蛋白酶降解生成的酪氨酸在紫外光區(qū)275 nm 處

2、有吸收峰，根據測定275 nm處的吸收值，可以判定木瓜蛋白酶的酶活力。吸 收值的大小與酪氨酸含量的多少有關，吸收值大說明酪氨酸含量高，也就是說木 瓜蛋白酶分解的酪蛋白多，酶活力高。三、儀器和試劑1、市售木瓜蛋白酶；2、儀器設備：磁力攪拌器（機）；離心機000rpm （冷凍式）；紫外分光光度計; 水浴槽；冰箱及常規(guī)玻璃儀器。四、實驗步驟（一）激活劑（EDTA ）對木瓜蛋白酶活力的影響1、試劑（1）3 mg mL-1木瓜蛋白酶液（用0.1 mol/L的磷酸緩沖液，pH 7.2配制）；（2）0.1 mol - L-1 的磷酸緩沖液，pH 7.2 ；（3）激活劑：用0.1 mol - L-1磷酸緩沖液

3、（pH 7.2）配制含10 mmol - L-1半胱 氨酸，分別含有 0，0.2，0.6，1.0，2.0，4.0 mmol - L-1 EDTA 的 6 種混合液；（4）1%酪蛋白溶液：用0.1 mol - L-1磷酸緩沖液（pH 7.2）配制；（5）15%三氯乙酸（TCA）溶液。2、方法EDTA濃度(mmol* L-1)00.20.61.02.04.0管號010101010101酶液（mL）0.20.20.20.20.20.20.20.20.20.20.20.2EDTA (mL)1.81.81.81.81.81.81.81.81.81.81.81.837 C水浴預熱10 min1%酪蛋白（m

4、L）01.001.001.001.001.001.037 C水浴 10 minTCA (mL)2.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.0i%酪蛋白（mL）i.0 0i.00i.00i.00i.00i.00搖勻，靜置5 min過濾（或離心）A275nm0 2.0280 2.0360 2.0550 2.i370 0.5780 0.082（二）抑制劑（過氧化氫）對木瓜蛋白酶活力的影響1、試劑配制濃度分別為0，0.25，0.5，1.0，2.0，4.0mmol-L-i的過氧化氫溶液。2、方法過氧化氫濃度00.250.5i.02.04.0(mmol*L-i)管號0 i0 i0

5、 i0 i0 i0 i酶液（mL）0.20.2 0.20.20.20.20.20.20.20.20.20.2過氧化氫0.20.2 0.20.20.20.20.2(mL)0.20.20.20.20.237 C水浴預熱i0 mini%酪蛋白00i.00000(mL)i.0i.0i.0i.0i.037 C浴 i0 minTCA (mL)2.02.0 2.02.02.02.02.02.02.02.02.02.0i%酪蛋白i.0i.00i.00i.00i.00i.00(mL)0搖勻，靜置5 min過濾（或離心）A0 i.5950 i.5050 i.5000 i.4450 i.0350 i.330275n

6、m（三）不同pH值對木瓜蛋白酶活力的影響1、試劑pH 5.0緩沖液0.1 mol-L-i乙酸一乙酸鈉緩沖液；pH 6.0緩沖液0.1 mol-L-i磷酸氫二鈉一磷酸二氫鈉緩沖液；pH 7.0緩沖液0.1 mol-L-i磷酸氫二鈉一磷酸二氫鈉緩沖液；pH 8.0緩沖液0.1 mol-L-i磷酸氫二鈉一磷酸二氫鈉緩沖液；pH 9.3緩沖液0.i mol L-i硼砂一氫氧化鈉緩沖液；2、用以上緩沖液分別配制不同pH值的激活劑（immolL-iEDTA）和i%酪蛋白溶 液。緩沖液pH5.06.07.08.09.3管號0 i0 i0 i0 i0 i酶液（mL）0.2 0.20.2 0.20.20.20.

7、20.20.2 0.2EDTA (mL)i.8 i.8i.8 i.8i.8i.8i.8i.8i.8 i.837 C水浴預熱i0 min1%酪蛋白（mL）01.001.00 1.00 1.001.037 C水浴 10 minTCA (mL)2.0 2.02.0 2.02.02.02.02.02.0 2.01%酪蛋白（mL）1.001.001.001.001.00搖勻，靜置5 min過濾（或離心）A275nm0 0.0340 0.0110 0.1130 0.0430 0.023275nm五、實驗結果分析激活劑（EDTA）對木瓜蛋白酶活力的影響EDTA濃度1、各實驗組分析討論實驗結果，再由老師進行歸納總結。2、做好實驗曲線繪制及數據記錄。3、對該實驗有哪些體會。1.答：激活劑（EDTA）對木瓜蛋白酶活力的影響EDTA濃度(mmolL-1)00.20.61.02.04.0管號010101010101A275nm02.0280 2.0360 2.05502.1370 0.5780 0.082275nm抑制劑（過氧化氫）對木瓜蛋白酶活力的影響過氧化氫濃度 （mmolL-1）00.250.51.02.04.0管號010101010101A275nm0 1.5950 1.5050 1.5000 1.4450 1.0350 1.330275nm不同pH值對木瓜蛋白酶活力的影響緩沖液pH5.06