腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)方法

1、腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)方法腫瘤細(xì)胞在組織培養(yǎng)中占有核心的位置，首先癌細(xì)胞是比較容易培養(yǎng)的細(xì)胞。當(dāng)前建立的細(xì)胞系中癌細(xì)胞系是最多的。另外腫瘤對(duì)人類是威脅最大的疾病。腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)是研究癌變機(jī)理、抗癌藥檢測(cè)、癌分子生物學(xué)極其重要的手段。腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)闡明和解決癌癥將起著不可估量的作用。 一、組織培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性 腫瘤細(xì)胞與體內(nèi)正常細(xì)胞相比，不論在體內(nèi)或在體外，在形態(tài)、生長增值、遺傳性狀等方面都有顯著的不同。生長在體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞和在體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞，其差異較小，但也并非完全相同。培養(yǎng)中的腫瘤細(xì)胞具以下突出特點(diǎn)： （）形態(tài)和性狀 培養(yǎng)中癌細(xì)胞無光學(xué)顯微鏡下特異形態(tài)，大多數(shù)腫瘤細(xì)胞鏡下觀察比二倍體細(xì)胞清晰

2、，核膜、核仁輪廓明顯，核糖體顆粒豐富。電鏡觀察癌細(xì)胞表面的微絨毛多而細(xì)密，微絲走行不如正常細(xì)胞規(guī)則，可能與腫瘤細(xì)胞具有不定向運(yùn)動(dòng)和錨著不依賴性有關(guān)。 （二）生長增殖 腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)具有不受控增殖性，在體外培養(yǎng)中仍如此。正常二倍體細(xì)胞在體外培養(yǎng)中不加血清不能增殖，是因血清中含有很細(xì)胞增殖生長的因子，而癌細(xì)胞在低血清中（25）仍能生長。已證明腫瘤細(xì)胞有自泌或內(nèi)泌性產(chǎn)生促增殖因子能力。正常細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化后，出現(xiàn)能在低血清培養(yǎng)基中生長的現(xiàn)象，已成為檢測(cè)細(xì)胞惡變的一個(gè)指標(biāo)。癌細(xì)胞或培養(yǎng)中發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化后的單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，形成集落（克?。┑哪芰Ρ日＜?xì)胞強(qiáng)。另外癌細(xì)胞增殖數(shù)量增多擴(kuò)展時(shí)，接觸抑制消除，細(xì)胞能相

3、互重疊向三維空間發(fā)展，形成堆積物。 （三）永生性 永生性也稱不死性。在體外培養(yǎng)中表現(xiàn)為細(xì)胞可無限傳代而不凋亡（Apoptosis）。體外培養(yǎng)中的腫瘤細(xì)胞系或細(xì)胞株都表現(xiàn)有這種性狀，體內(nèi)腫瘤細(xì)胞是否如此尚無直接證明。因惡性腫瘤終將殺死宿主并同歸于盡，從而難以證明這一性狀的存在。體外腫癌細(xì)胞的永生性是否能反證它在體內(nèi)時(shí)同樣如此？也尚難肯定。從近年建立細(xì)胞系或株的過程說明，如果永生性是體內(nèi)腫瘤細(xì)胞所固有的，腫瘤細(xì)胞應(yīng)易于培養(yǎng)。事實(shí)上，多數(shù)腫瘤細(xì)胞初代培養(yǎng)時(shí)并不那么容易。生長增殖并不旺盛；經(jīng)過純化成單一化瘤細(xì)胞后，也大多增殖若干代后，便出現(xiàn)類似二倍體細(xì)胞培養(yǎng)中的停滯期。過此階段后才獲得永生性，順利傳代

4、生長下去。從而說明體外腫瘤細(xì)胞的永生性有可能是體外培養(yǎng)后獲得的。從一些具有永生性而無惡性性的細(xì)胞系，如NIH3T3、Rat1、10T1/2等細(xì)胞證明，永生性和惡性（包括浸潤性）是兩種性狀，受不同基因調(diào)控，但卻有相關(guān)性?？赡苡郎允羌?xì)胞惡變的階段。至少在體外是如此。（四）浸潤性 浸潤性是腫瘤細(xì)胞擴(kuò)張性增殖行為，培養(yǎng)癌細(xì)胞仍持有這種性狀。在與正常組織混合培養(yǎng)時(shí)，能浸潤入其它組織細(xì)胞中，并有穿透人工隔膜生長的能力。 （五）異質(zhì)性 所有腫瘤都是由有增殖能力、遺傳性、起源、周期狀態(tài)等性狀不同的細(xì)胞組成。異質(zhì)性構(gòu)成同一腫瘤內(nèi)細(xì)胞的活力有差別的瘤組織；處于瘤體周邊區(qū)的細(xì)胞獲得血液供應(yīng)多，增殖旺盛，中心區(qū)有的

5、細(xì)胞衰老退化，有的處于周期阻滯狀態(tài)，那些呈活躍增殖狀態(tài)的細(xì)胞稱干細(xì)胞（Stem Cells）、只有這些干細(xì)胞才是支持腫瘤生長的成分。腫瘤干細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)易于生長增殖；把干細(xì)胞分離出來的培養(yǎng)方法稱干細(xì)胞培養(yǎng)。 （六）細(xì)胞遺傳 大多數(shù)腫瘤細(xì)胞有遺傳學(xué)改變，如失去二倍體核型、呈異倍體或多倍體等。腫瘤細(xì)胞群常由多個(gè)細(xì)胞群組成，有干細(xì)胞系和數(shù)個(gè)亞系，并不斷進(jìn)行著適應(yīng)性演變。 （七）其它 腫瘤細(xì)胞在體外不易生長的原因可能由于： 依賴性：腫瘤細(xì)胞雖有較強(qiáng)克隆生長力，但仍有一定的群體性或與其它細(xì)胞相依存關(guān)系。一是腫瘤細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的相互依存，二是腫瘤細(xì)胞與基質(zhì)成纖維細(xì)胞的依賴。體外分散培養(yǎng)和排除成纖維細(xì)胞后也會(huì)同

6、時(shí)消除或減弱這些依存關(guān)系，可能影響癌細(xì)胞增殖生長的活性； 腫瘤細(xì)胞的自泌也會(huì)因分散培養(yǎng)而被稀釋，達(dá)不到腫瘤生長的需求，降低腫瘤細(xì)胞的生長增殖力； 并非所有腫瘤細(xì)胞都有強(qiáng)的生長活力和長的Life Span，只有干細(xì)胞才有強(qiáng)的增殖生長能力，但這些細(xì)胞數(shù)量很少； 離體培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞可能需求與體內(nèi)相似的特殊生存條件。 二、培養(yǎng)方法 腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)成功關(guān)鍵在于：取材、成纖維細(xì)胞的排除、選用適宜的培養(yǎng)液和培養(yǎng)底物等幾個(gè)方面。在具體培養(yǎng)方法方面，腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)與正常組織細(xì)胞培養(yǎng)并無原則差別，初代培養(yǎng)應(yīng)用組織塊和消化培養(yǎng)法均可。 1取材： 人腫瘤細(xì)胞來自外科手術(shù)或活檢瘤組織。取材部位非常重要，體積較大的腫瘤組織中有

7、退變或壞死區(qū)，取材時(shí)盡量避免用退變組織，要挑選活力較好的部位。癌性轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)或胸腹水是好的培養(yǎng)材料。取材后宜盡快進(jìn)行培養(yǎng)，如因故不能立即培養(yǎng)，可貯存于4中，但不宜栽過24小時(shí)。 2培養(yǎng)基： 腫瘤細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基的要求不如正常細(xì)胞嚴(yán)格，一般常用的 RPMIl640、 DMEM、Mc-Coy5A等培養(yǎng)基等皆可用于腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)。腫瘤細(xì)胞對(duì)血清的需求比正常細(xì)胞低，正常細(xì)胞培養(yǎng)不加血清不能生長，腫瘤細(xì)胞在低血清培養(yǎng)基中也能生長。腫瘤細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)環(huán)境適應(yīng)性較大，是因腫瘤細(xì)胞有自泌（Autocrine）性產(chǎn)生促生長物質(zhì)之故。但這并不說明腫瘤細(xì)胞完全不需要這些成分。按不同細(xì)胞需要不同的生長因子；腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞之

8、間、腫瘤細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞之間對(duì)生長因子的需求都存在著差異。但大多數(shù)腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)中仍需要生長因子。有的還需特異性生長因子如乳腺癌細(xì)胞等）。總之培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞仍需加血清和相關(guān)生長因子培養(yǎng)更易成功。 3成纖維細(xì)胞的排除： 成纖維細(xì)胞常與腫瘤細(xì)胞同時(shí)混雜生長，致難以純化腫瘤細(xì)胞。而且成纖維細(xì)胞常比腫瘤細(xì)胞生長得快，最終能壓制腫瘤細(xì)胞的生長。因此排除成纖維細(xì)胞成為腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)中的關(guān)鍵。排除成纖維細(xì)胞有多種方法（表21）。 表21 抑制成纖維細(xì)胞生長因素方法 因素 組織細(xì)胞 選擇性附著 選擇性附著底物 匯合飼細(xì)胞層 選擇性培養(yǎng)基 胰蛋白酶 膠原酶 聚丙烯酰胺 聚四氟乙烯（Teflon） 膠原（豬皮） 小鼠3T

9、3 人胎小腸 D-纈氨酸（Valine） MCDB-710 MCDB-153 Phenobarbitone 胚胎小腸、心肌、表皮 乳癌 各種腫瘤 轉(zhuǎn)化細(xì)胞 表皮細(xì)胞 表皮 正常和惡性乳腺上皮 結(jié)腸癌 腎組織 乳腺 表皮 肝細(xì)胞 注：上表結(jié)果為個(gè)別實(shí)驗(yàn)室經(jīng)驗(yàn)，僅供參考 三、成纖維細(xì)胞排除法 1機(jī)械刮除法： 是用不銹鋼絲末端插有橡膠刮頭（用膠塞剪成三角形插以不銹鋼絲）、或裹少許脫脂棉制成，裝入試管中高壓滅菌后備用（也可用特制電熱燒灼器刮除）。刮除程序?yàn)椋?（1）標(biāo)記：鏡下觀察，用不脫色筆在培養(yǎng)瓶皿的背面圈下生長腫瘤細(xì)胞的部位； （2）刮除：棄掉培養(yǎng)液，把無菌膠刮伸入瓶皿中，肉眼或顯微鏡窺視下，刮除

10、無標(biāo)記空間； （3）用Hanks液沖洗一兩次，洗除被刮掉的細(xì)胞； （4）注入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，如發(fā)現(xiàn)仍有成纖維細(xì)胞殘留，可重復(fù)刮除至完全除掉為止 2反復(fù)貼壁法： 根據(jù)腫瘤細(xì)胞比成纖維細(xì)胞貼壁速度慢的特點(diǎn)，并結(jié)合使用不加血清的營養(yǎng)液，把含有兩類細(xì)胞的細(xì)胞懸液反復(fù)貼壁，使兩類細(xì)胞相互分離，操作方法與傳代相同。 （1）待細(xì)胞生長達(dá)一定數(shù)量后，倒出舊培養(yǎng)液，用胰酶消化后，Hanks 沖洗2次，加入不含血清的培養(yǎng)液，吹打制成細(xì)胞懸液； （2）取編號(hào)為此A、B、C三個(gè)培養(yǎng)瓶；首先把懸液接種入A培養(yǎng)瓶中。置溫箱中靜止培養(yǎng)520分鐘后，輕輕傾斜培養(yǎng)瓶，讓液體集中瓶角后慢慢吸出全部培養(yǎng)液，再接種入B培養(yǎng)瓶中后；向

11、A瓶中補(bǔ)充少許完全培養(yǎng)液置溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)； （3）培養(yǎng)B瓶中細(xì)胞520分鐘后，接處理A的方法，把培養(yǎng)液注入C培養(yǎng)瓶中；再向B瓶中補(bǔ)加完全培養(yǎng)基。 當(dāng)三個(gè)瓶內(nèi)都含有培養(yǎng)液后，均在溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)。如操作成功，次日觀察可見A瓶主要為成纖維細(xì)胞，B瓶兩類細(xì)胞相雜，C瓶可能主要為癌細(xì)胞。必要時(shí)可反復(fù)處理多次，直至癌細(xì)胞純化為止。 3消化排除法： 此法曾用于乳癌細(xì)胞的培養(yǎng)，具體程序是： （1）先是用0.5%胰蛋白酶和0.02EDTA（1：1）混合液漂洗培養(yǎng)細(xì)胞一次，然后再換成新的混合液繼續(xù)消化，并在倒置顯微鏡下窺視和不時(shí)搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，到半數(shù)細(xì)胞脫落下來后，便立即停止消化； （2）把消化液吸入離心管中，離心去

12、上清，吸入另瓶中，加培養(yǎng)液置溫箱中培養(yǎng)；向原瓶內(nèi)也補(bǔ)加新的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。用此法處理后，成纖維細(xì)胞比腫瘤細(xì)胞易先脫落。經(jīng)過幾次反復(fù)處理，可能把成纖維細(xì)胞除凈。 4膠原酶消化法： 本法是利用成纖維細(xì)胞對(duì)膠原酶較為敏感的特點(diǎn)，通過消化進(jìn)行選擇。 （1）可用0.5mg/ml的膠原酶消化處理，邊消化邊在倒置顯微鏡下窺視，當(dāng)發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞被除掉后，即終止消化； （2）用Hanks洗滌處理一次后，更換新培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，可獲純凈腫瘤細(xì)胞。如成纖維細(xì)胞未被除凈，可再次重復(fù)。 5其它方法： 有人發(fā)現(xiàn)聚丙烯酰胺有抑制成纖維細(xì)胞生長的作用；也有人用聚蔗糖制備成比重1.0251.085的密度梯度離心液，加入細(xì)胞懸液

13、后，在23中800g離心 10分種。在比重1.0251.050層為成纖維細(xì)胞，在比重1.0501.085層為上皮細(xì)胞，再經(jīng)過分離進(jìn)行培養(yǎng)。最近也有人應(yīng)用特殊化學(xué)物如SOD抑制成纖維細(xì)胞生長的方法。 選用上述任何一種方法，都需進(jìn)行試驗(yàn)，取得必要經(jīng)驗(yàn)，找出適合的條件，才能獲得好的效果。 四、提高腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)存活率和生長率措施 根據(jù)人們的經(jīng)驗(yàn)，腫瘤細(xì)胞在體外不易培養(yǎng)，建立能傳代的腫瘤細(xì)胞系更為困難。當(dāng)腫瘤組織或細(xì)胞初代接種培養(yǎng)后，常出現(xiàn)以下幾種情況：完全無細(xì)胞游出或移動(dòng)； 有細(xì)胞移動(dòng)和游出，但無細(xì)胞增殖，細(xì)胞長時(shí)間處于停滯狀態(tài)以致難以傳代； 有細(xì)胞增殖，傳若干代后停止生長或衰退死亡； 傳數(shù)代后細(xì)胞增

14、殖緩慢，經(jīng)過一段停滯期后，才又呈旺盛生長狀態(tài)，形成穩(wěn)定生長的腫瘤傳代細(xì)胞系。以上現(xiàn)象說明腫瘤細(xì)胞對(duì)體外生存條件有較高的要求，并需經(jīng)過對(duì)新環(huán)境的適應(yīng)才能生長，因此欲獲得好的培養(yǎng)效果，不能局限于一般培養(yǎng)法，必須采用一些特殊的措施。 1適宜底物：把經(jīng)過純化的細(xì)胞接種在不同的底物上，如鼠尾膠原底層、飼細(xì)胞層等。 2生長因子：應(yīng)用促細(xì)胞生長因子，向培養(yǎng)液中增加一種或幾種促細(xì)胞生長因子。根據(jù)細(xì)胞種類不同選用不同的促生長物，常用有胰島素、氫化可的松、雌激素以及其它生長因子。 為提高腫瘤細(xì)胞對(duì)體外培養(yǎng)環(huán)境的適應(yīng)力和增加有活力癌細(xì)胞（干細(xì)胞）的數(shù)量，可采用動(dòng)物體轉(zhuǎn)嫁接種成瘤后，再從動(dòng)物體內(nèi)取出進(jìn)行培養(yǎng)，能提高體

15、外培養(yǎng)的成功率。受體動(dòng)物以裸鼠最好。 3.動(dòng)物體媒介培養(yǎng)方法： （1）瘤塊接種：取新鮮瘤組織，用Hanks液洗凈血污，切成13毫米小塊，用穿刺針頭吸一小瘤塊，用酒精棉球擦拭動(dòng)物腹部后，直接刺入皮下，注入瘤塊； （2）飼養(yǎng)觀察，待腫瘤生長達(dá)較大體積后，剝?nèi)〕隽鼋M織； （3）進(jìn)行體外培養(yǎng)。 （4）為防止失敗，仍取部分瘤組織繼續(xù)在裸鼠體內(nèi)傳代。通過裸鼠媒介接種，有活力的腫瘤細(xì)胞數(shù)量增多，細(xì)胞培養(yǎng)易于成功。 腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)方法與培養(yǎng)正常細(xì)胞完全相同，但成功率比正常細(xì)胞高。 五、體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)檢測(cè) 一旦培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞生長成形態(tài)上單一的細(xì)胞群體或細(xì)胞系（或株）后，不論用于實(shí)驗(yàn)研究還是建立細(xì)胞系，都需

16、要做一系列的細(xì)胞生物學(xué)測(cè)定，主要的目的在于求得證明： 所培養(yǎng)的細(xì)胞系的確來源于原體內(nèi)具有惡性的細(xì)胞，而非正常細(xì)胞或其它細(xì)胞。均具有瘤種特異性。闡明一般生物學(xué)性狀。測(cè)定項(xiàng)目數(shù)量無明確規(guī)定，根據(jù)需要而定，以下為常做的項(xiàng)目和要點(diǎn)。 【形態(tài)觀察】主要觀察細(xì)胞的一般形態(tài)，如大體形態(tài)、核漿比例、染色質(zhì)和核仁大小、多少等以及細(xì)胞骨架微絲微管的排列狀態(tài)等。 【細(xì)胞生長增殖】檢測(cè)細(xì)胞生長曲線、細(xì)胞分裂指數(shù)、倍增時(shí)間、細(xì)胞周期時(shí)間。 【細(xì)胞核型分析】檢測(cè)核型特點(diǎn)，染色體數(shù)量、標(biāo)記染色體的有無、帶型等。 【凝集試驗(yàn)】檢測(cè)凝集力。 【軟瓊脂培養(yǎng)】檢測(cè)集落形成能力。 【異體動(dòng)物接種】向異體動(dòng)物體內(nèi)（皮下）接種細(xì)胞懸液，

17、觀察成瘤能力。 【其它】除上述項(xiàng)目外，根據(jù)需要還可做同位素標(biāo)記、組織化學(xué)成分分析，熒光顯微鏡觀察等。 在上述腫瘤細(xì)胞生物學(xué)檢測(cè)中，最主要的為：異體動(dòng)物（以用裸鼠為上）接種成瘤、軟瓊脂培養(yǎng)、核型分析、細(xì)胞骨架和電鏡觀察等幾項(xiàng)。當(dāng)然從分子細(xì)胞學(xué)角度考慮尚應(yīng)做癌基因和抗癌基因等的檢測(cè)，這些項(xiàng)目將在本書第二篇中介紹。 六、對(duì)腫瘤細(xì)胞系或細(xì)胞株的評(píng)價(jià) 已建成的各種腫瘤細(xì)胞系或細(xì)胞株，無疑都是可用的實(shí)驗(yàn)對(duì)象。近年我國已建成的腫瘤細(xì)胞系已非常多，并獲得越來越廣泛的應(yīng)用。但根據(jù)研究者的經(jīng)驗(yàn)，在使用這些細(xì)胞系時(shí)，應(yīng)持特別審慎態(tài)度，主要是應(yīng)考慮到這些細(xì)胞在長期傳代中有否發(fā)生遺傳性改變的可能。眾所周知，長期傳代細(xì)胞

18、系染色體核型常是不穩(wěn)定的。另外也可能發(fā)生如基因突變、基因易位或缺失等變化。其結(jié)果可能導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生生物學(xué)性狀上的變動(dòng)。以近年建成的各種腫瘤細(xì)胞系為例，都已傳代少則幾十，多則百代以上后，才確認(rèn)建成了細(xì)胞系。這種情況下很難保證細(xì)胞從初代到建成時(shí)的性狀仍是一致的。 已如前述，癌細(xì)胞在培養(yǎng)中并非能很順利地傳下去，凡已長期傳代的細(xì)胞系，都已獲得不死性。當(dāng)前尚未完全確證所有癌細(xì)胞都具有不死性；因此尚難肯定在長期培養(yǎng)中的癌細(xì)胞的生物學(xué)性狀與體內(nèi)時(shí)仍完全相同（包括不死性）。據(jù)上述對(duì)用癌細(xì)胞系所獲實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)盡量做分析性的結(jié)論，避免做概括性的與體內(nèi)等同的結(jié)論，外推與體內(nèi)等同更是不妥的。廣泛來說，應(yīng)用各種較長時(shí)間培養(yǎng)

19、細(xì)胞做實(shí)驗(yàn)時(shí)，都應(yīng)如此。199細(xì)胞培養(yǎng)基（粉末型）成分序號(hào) 化合物名稱 含量 (mg/L) 序號(hào) 化合物名稱 含量 (mg/L) 1 無水氯化鈣 185.00 31 維生素 D 2 0.010 2 硝酸鐵 .9H 2 O 0.72 32 氯化膽堿 0.500 3 氯化鉀 400.00 33 葉酸 0.010 4 無水硫酸鎂 97.67 34 肌醇 0.050 5 乙酸鈉 50.00 35 維生素 K 0.016 6 氯化鈉 6800.00 36 煙酰胺 0.025 7 無水磷酸二氫鈉 122.00 37 煙酸 0.025 8 L-丙氨酸 50.00 38 對(duì)氨基苯甲酸 0.050 9 L-鹽酸

20、精氨酸 70.00 39 泛酸鈣 0.010 10 L-門冬氨酸 60.00 40 鹽酸吡哆醇 0.025 11 L-鹽酸半胱氨酸 0.11 41 鹽酸吡哆醛 0.025 12 L-鹽酸胱氨酸 26.00 42 維生素 A醋酸鹽 0.100 13 DL-谷氨酸 133.60 43 核黃素 0.100 14 L-谷氨酰胺 100.00 44 鹽酸硫胺 0.010 15 甘氨酸 50.00 45 D 2 -磷酸生育酚鈉鹽 0.010 16 L-鹽酸組氨酸 21.88 46 硫酸腺嘌呤 10.00 17 L-羥脯氨酸 10.00 47 腺嘌呤三磷酸 1.00 18 DL-異亮氨酸 40.00 48

21、腺嘌呤一磷酸 0.2385 19 DL-亮氨酸 120.00 49 膽固醇 0.200 20 L-鹽酸賴氨酸 70.00 50 脫氧核糖 0.500 21 DL-甲硫氨酸 30.00 51 葡萄糖 1000 22 DL-苯丙氨酸 50.00 52 還原谷胱甘肽 0.050 23 L-脯氨酸 40.00 53 鹽酸鳥嘌呤 0.300 24 DL-絲氨酸 50.00 54 次黃嘌呤 0.300 25 DL-蘇氨酸 60.00 55 吐溫 80 5.00 26 DL-色氨酸 20.00 56 核糖 0.500 27 L-酪氨酸.鈉鹽 57.66 57 胸腺嘧啶 0.300 28 DL-纈氨酸 50.

22、00 58 尿嘧啶 0.300 29 維生素 C 0.0566 59 黃嘌呤鈉鹽 0.300 30 D-生物素 0.010 60 酚紅 20.00 199(無酚紅)細(xì)胞培養(yǎng)基（粉末型）成分序號(hào)化合物名稱含量 (mg/L)序號(hào)化合物名稱含量 (mg/L)1無水氯化鈣185.0031維生素 D 20.0102硝酸鐵 .9H 2 O0.7232氯化膽堿0.5003氯化鉀400.0033葉酸0.0104無水硫酸鎂97.6734肌醇0.0505乙酸鈉50.0035維生素 K0.0166氯化鈉6800.0036煙酰胺0.0257無水磷酸二氫鈉122.0037煙酸0.0258L-丙氨酸50.0038對(duì)氨基苯

23、甲酸0.0509L-鹽酸精氨酸70.0039泛酸鈣0.01010L-門冬氨酸60.0040鹽酸吡哆醇0.02511L-鹽酸半胱氨酸0.1141鹽酸吡哆醛0.02512L-鹽酸胱氨酸26.0042維生素 A醋酸鹽0.10013DL-谷氨酸133.6043核黃素0.10014L-谷氨酰胺100.0044鹽酸硫胺0.01015甘氨酸50.0045D 2 -磷酸生育酚鈉鹽0.01016L-鹽酸組氨酸21.8846硫酸腺嘌呤10.0017L-羥脯氨酸10.0047腺嘌呤三磷酸1.0018DL-異亮氨酸40.0048腺嘌呤一磷酸0.238519DL-亮氨酸120.0049膽固醇0.20020L-鹽酸賴氨酸

24、70.0050脫氧核糖0.50021DL-甲硫氨酸30.0051葡萄糖100022DL-苯丙氨酸50.0052還原谷胱甘肽0.05023L-脯氨酸40.0053鹽酸鳥嘌呤0.30024DL-絲氨酸50.0054次黃嘌呤0.30025DL-蘇氨酸60.0055吐溫 805.0026DL-色氨酸20.0056核糖0.50027L-酪氨酸.鈉鹽57.6657胸腺嘧啶0.30028DL-纈氨酸50.0058尿嘧啶0.30029維生素 C0.056659黃嘌呤鈉鹽0.30030D-生物素0.010199(無血清)細(xì)胞培養(yǎng)基（粉末型）成分序號(hào)化合物名稱含量 (mg/L)序號(hào)化合物名稱含量 (mg/L)1D

25、水氯化鈣.2H 2 O265.0032維生素 D 20.0102硝酸鐵 .9H 2 O0.3033氯化膽堿0.5003氯化鉀400.0034葉酸0.0104無水硫酸鎂97.6735肌醇0.0505乙酸鈉50.0036維生素 K0.0166氯化鈉6800.0037煙酰胺0.0257無水磷酸二氫鈉122.0038煙酸0.0258硫酸鋅0.1039對(duì)氨基苯甲酸0.0509L-丙氨酸25.0040泛酸鈣0.01010L-鹽酸精氨酸150.0041鹽酸吡哆醇0.02511L-門冬氨酸30.0042鹽酸吡哆醛0.02512L-半胱氨酸4.0043維生素 A醋酸鹽0.10013L-鹽酸胱氨酸43.844核黃

26、素0.10014L-谷氨酸75.0045鹽酸硫胺0.01015L-谷氨酰胺300.0046D 2 -磷酸生育酚鈉鹽0.01016甘氨酸100.0047硫酸腺嘌呤10.0017L-鹽酸組氨酸40.0048腺嘌呤三磷酸1.0018L-羥脯氨酸10.0049膽固醇0.20019L-異亮氨酸20.0050脫氧核糖0.50020L-亮氨酸60.0051無水半乳糖1000.0021L-鹽酸賴氨酸70.0052葡萄糖2000.0022L-甲硫氨酸15.0053還原谷胱甘肽0.05023L-苯丙氨酸25.0054鹽酸鳥嘌呤0.30024L-脯氨酸40.0055次黃嘌呤0.30025L-絲氨酸25.0056酚紅

27、鈉11.0026L-蘇氨酸30.0057吐溫 805.0027L-色氨酸10.0058丙酮酸鈉150.0028L-酪氨酸二鈉鹽116.0059核糖0.50029L-纈氨酸25.0060胸腺嘧啶0.30030維生素 C0.05061尿嘧啶0.30031D-生物素0.01062黃嘌呤鈉0.300DMEM(A) 細(xì)胞培養(yǎng)基（粉末型）成分序號(hào)化合物名稱含量 (mg/L)序號(hào)化合物名稱含量 (mg/L)1無水氯化鈣 .2H 2 O265.0018L-絲氨酸42.002硝酸鐵 .9H 2 O0.1019L-蘇氨酸95.003氯化鉀400.0020L-色氨酸16.004無水硫酸鎂97.6721L-酪氨酸72

28、.005氯化鈉6400.0022L-纈氨酸94.006無水磷酸二氫鈉109.0023D-泛酸鈣4.007丁二酸75.0024酒石酸膽堿7.208丁二酸鈉100.0025葉酸4.009L-鹽酸精氨酸84.0026肌醇7.2010L-鹽酸胱氨酸63.0027煙酰胺4.0011甘氨酸30.0028核黃素0.4012L-鹽酸組氨酸42.0029鹽酸硫胺4.0013L-異亮氨酸105.0030鹽酸吡哆辛4.0014L-亮氨酸105.0031葡萄糖1000.0015L-鹽酸賴氨酸146.0032丙酮酸鈉110.0016L-甲硫氨酸30.0033酚紅9.30.0017L-苯丙氨酸66.00DMEM(H) 細(xì)

29、胞培養(yǎng)基（粉末型）成分序號(hào)化合物名稱含量 (mg/L)序號(hào)化合物名稱含量 (mg/L)1無水氯化鈣200.0017L-絲氨酸42.002硝酸鐵 .9H 2 O0.1018L-蘇氨酸95.003氯化鉀400.0019L-色氨酸16.004無水硫酸鎂97.6720L-酪氨酸鈉鹽104.005氯化鈉6400.0021L-纈氨酸94.006無水磷酸二氫鈉125.0022D-泛酸鈣4.007L-鹽酸精氨酸84.0023氯化膽堿4.008L-鹽酸胱氨酸63.0024葉酸4.009L-谷氨酰胺584.0025肌醇7.2010甘氨酸30.0026煙酰胺4.0011L-鹽酸組氨酸42.0027核黃素0.4012

30、L-異亮氨酸105.0028鹽酸硫胺4.0013L-亮氨酸105.0029鹽酸吡哆辛4.0014L-鹽酸賴氨酸146.0030葡萄糖4500.0015L-甲硫氨酸30.0031丙酮酸鈉110.0016L-苯丙氨酸66.0032酚紅15.00DMEM(L) 細(xì)胞培養(yǎng)基（粉末型）成分序號(hào)化合物名稱含量 (mg/L)序號(hào)化合物名稱含量 (mg/L)1無水氯化鈣200.0017L-絲氨酸42.002硝酸鐵 .9H 2 O0.1018L-蘇氨酸95.003氯化鉀400.0019L-色氨酸16.004無水硫酸鎂97.6720L-酪氨酸鈉鹽104.005氯化鈉6400.0021L-纈氨酸94.006無水磷酸

31、二氫鈉125.0022D-泛酸鈣4.007L-鹽酸精氨酸84.0023氯化膽堿4.008L-鹽酸胱氨酸63.0024葉酸4.009L-谷氨酰胺584.0025肌醇7.2010甘氨酸30.0026煙酰胺4.0011L-鹽酸組氨酸42.0027核黃素0.4012L-異亮氨酸105.0028鹽酸硫胺4.0013L-亮氨酸105.0029鹽酸吡哆辛4.0014L-鹽酸賴氨酸146.0030葡萄糖1000.0015L-甲硫氨酸30.0031丙酮酸鈉110.0016L-苯丙氨酸66.0032酚紅15.00實(shí)驗(yàn)一 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)是用無菌操作的方法將動(dòng)物體內(nèi)的組織(或器官)取出，模擬動(dòng)物體內(nèi)的生理?xiàng)l件，

32、在體外進(jìn)行培養(yǎng)使其不斷地生長、繁殖，人們借以觀察細(xì)胞的生長、繁殖、細(xì)胞分化以及細(xì)胞衰老等過程的生命現(xiàn)象。細(xì)胞培養(yǎng)的突出優(yōu)點(diǎn)，一是便于研究各種物理、化學(xué)等外界因素對(duì)細(xì)胞生長發(fā)育和分化等的影響；二是細(xì)胞培養(yǎng)便于人們對(duì)細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)(如細(xì)胞骨架等)、細(xì)胞生長及發(fā)育等過程的觀察。因而細(xì)胞培養(yǎng)是探索和指示細(xì)胞生命活動(dòng)規(guī)律的種簡便易行的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，同時(shí)我們也不可忽略的另一個(gè)因素，那就是它脫離樂生物機(jī)體后的些變化。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)目前已廣泛地被應(yīng)用于生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。如分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)、腫痛學(xué)及病毒學(xué)等為此有必要使學(xué)生在細(xì)胞培養(yǎng)方面得到一些初步的感性知識(shí)，了解動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本操作過程，觀察體外

33、培養(yǎng)細(xì)胞的生長特征，對(duì)原代細(xì)胞與傳代細(xì)胞有一個(gè)基本概念。本實(shí)驗(yàn)分兩次進(jìn)行即清洗與消毒和傳代細(xì)胞的培養(yǎng)與觀察。清洗與滅菌一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康哪塥?dú)立地進(jìn)行用于細(xì)胞培養(yǎng)的各種器皿的清洗與消毒，掌握干熱滅菌法、濕熱滅菌法和濾過除菌法的操作，了解化學(xué)消毒法的使用方法。二、實(shí)驗(yàn)原理清洗與消毒是組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的第一步，是組織培養(yǎng)中工作量最大，也是最基本的步驟。體外培養(yǎng)細(xì)胞所使用的各種玻璃或塑料器皿對(duì)清潔和無菌的要求程度很高。細(xì)胞養(yǎng)不好與清洗不徹底有很大關(guān)系。清洗后的玻璃器皿，不僅要求干凈透明，無油跡，而且不能殘留任何物質(zhì)。如有毒的化學(xué)物質(zhì)，哪怕殘留01個(gè)，也可能影響細(xì)胞生長。滅菌手段的選擇十分重要，對(duì)不同的物品需采用

34、不同的滅菌方法。假如選用的方法不對(duì)，即使達(dá)到了無菌卻使被滅菌藥品喪失了營養(yǎng)價(jià)值、生物學(xué)特性或其他使用價(jià)值也不行。以下在每種滅菌步驟中都介紹其使用范圍。三、實(shí)驗(yàn)材料、用品材料：無臭氧型紫外燈，微孔濾膜(直徑25)：孔徑為022m，微孔濾膜(直徑90)：孔徑為022 m，過濾器(直徑25)。藥品：70或75酒精，01新潔爾滅，煤酚皂溶液(來蘇兒水)，05過氧乙酸，乳酸，37甲醛，高錳酸鉀，NaOH，鹽酸，重鉻酸鉀，濃硫酸(工業(yè))，DEPC水體積分?jǐn)?shù)01的焦炭酸二乙酯(diethylpyroearbonate)。儀器：超凈臺(tái)，干燥箱，高壓鍋，過濾器，過濾泵。四、實(shí)驗(yàn)步驟(一)清洗1新玻璃器皿的清洗先

35、用自來水刷洗，再浸泡5稀鹽酸以中和玻璃表面的堿性物質(zhì)和其他有害物質(zhì)。2使用過的玻璃器皿的清洗(1)使用過的培養(yǎng)用品應(yīng)立即浸入清水，避免干涸難洗。(2)用洗滌劑清洗玻璃器皿，自來水清洗數(shù)遍，倒置自然干燥。(3)浸酸性洗液過夜。(4)從酸性洗液撈出后自來水沖洗1015次去除殘余酸液，蒸餾水涮洗3次，倒置烘干。 (5)包裝(牛皮紙或一般紙)。 (6)高壓(15磅20 min)或干熱(1702 h)滅菌。(7)貯存?zhèn)溆谩?3膠塞的處理 (1)新膠塞應(yīng)先用清水清洗之后再用02NaOH煮沸l(wèi)O-20 min。 (2)自來水清洗10次。 (3)再用1稀鹽酸浸泡30 min。 (4)自來水清洗10次，蒸餾水涮

36、洗3次。晾干，高壓滅菌(見(二)消毒與滅菌)。舊膠塞不必用酸堿處理可直接用洗滌劑煮沸和清洗數(shù)次，過蒸餾水，晾干，包裝并高壓滅菌后，便可使用。（二）消毒1物理消毒法 (1)紫外線消毒 用于消毒空氣、操作臺(tái)面和一些不能用干熱、濕熱滅菌的培養(yǎng)器皿，如塑料培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板等。這是常使用的消毒方法之一。 (2)干熱滅菌 主要用于玻璃器皿的滅菌。將用于細(xì)胞培養(yǎng)的器皿放人干燥箱內(nèi)，加熱至160，保溫90120 min。用于RNA提取實(shí)驗(yàn)的用品則需180，保溫58 h。 (3)濕熱滅菌 此方法也稱為高壓蒸汽滅菌，是最有效的一種滅菌方法。主要應(yīng)用范圍是布類、橡膠制品(如膠塞)、金屬器械、玻璃器皿、某些塑料制品以及

37、加熱后不發(fā)生沉淀的無機(jī)溶液(如Hanks液、PBS、20SSC等)。手動(dòng)高壓滅菌鍋操作如下： 首先查看高壓鍋內(nèi)的水是否充足，放人物品蓋好蓋。加熱高壓鍋。將放氣閥打開，放氣510 min，以排除鍋內(nèi)的冷空氣。 待鍋內(nèi)水沸騰后，落下放氣閥繼續(xù)升溫升壓，玻璃器皿等用15磅(121)30 min，膠塞、塑料制品、溶液等可用10磅(115 )20 min。調(diào)節(jié)火力大小保持該壓力。停止加熱，待壓力自然下降至0再打開放氣閥排汽，開蓋，取出高壓滅菌的物品烘干。 電熱自動(dòng)滅菌鍋使用說明(型號(hào)：SANYO Autoclave MLS-3020)： 放氣筒加水至LOW水平線處，將與高壓鍋相連的導(dǎo)氣管插入放氣筒里，然

38、后將放氣筒歸于原位。 打開高壓鍋蓋，加入蒸餾水至高壓鍋底的水位線，水位線位于V型凹槽的1323處。 打開電源。 設(shè)定高壓溫度及時(shí)間，高壓鍋的溫度范圍為105121，高壓滅菌一般采用1212030 min。 把待高壓的物品置于高壓鍋內(nèi)，順時(shí)針方向?qū)xhaust鈕旋至close位置。 關(guān)閉高壓鍋蓋，旋至顯示屏上左上角的紅亮點(diǎn)剛出現(xiàn)為止。按start鈕，開始高壓，在溫度達(dá)80時(shí)顯示器開始顯示溫度，當(dāng)溫度達(dá)到所需的設(shè)定溫度時(shí)，在顯示屏的左下角有一長形的指示燈閃亮，直到高壓時(shí)間結(jié)束后指示燈滅，此時(shí)蜂鳴器報(bào)警一聲。當(dāng)壓力降至0 MPa時(shí)，蜂鳴器再報(bào)警一聲。溫度降至80時(shí)，蜂鳴器報(bào)警10次。顯示屏溫度指示

39、消失，此時(shí)才可打開鍋蓋。 關(guān)電源，開高壓鍋蓋，取出已滅菌的物品，烘干。 (4)濾過除菌 用于培養(yǎng)用液和各種不能高壓滅菌的溶液的滅菌。采用金屬濾器和小型的塑料濾器，配上可以更換的微孔濾膜，極大地方便了操作。濾器型號(hào)按直徑大小劃分。如過濾量大的培養(yǎng)用液常用較大型號(hào)的金屬濾器(直徑90 mm、100 mm、142 mm等)，配以過濾泵使用。過濾量較小的液體常用注射器推動(dòng)的塑料小濾器(直徑20 mm、25 mm等)。濾膜孔徑有060 m、045 m、035 m、022 m、010m等，以022 m除菌最為保險(xiǎn)，但對(duì)于較粘稠難濾過的液體，仍需選用孔徑較大的濾膜。在過濾器上裝上微孔濾膜，孔徑為022m。用

40、布包好，濕熱滅菌后使用。 2化學(xué)消毒法 常用的消毒液有如下幾種：(1)70(或75)酒精：超凈臺(tái)里常備70酒精棉球(衛(wèi)生級(jí)酒精)，用于手和一些金屬器械或工作臺(tái)面的消毒。(2)01新潔爾滅：主要用于手和前臂的清洗以及工作后超凈臺(tái)面的清潔。超凈臺(tái)旁應(yīng)常備盛有01新潔爾滅溶液的容器及紗布。 (3)來蘇兒水(煤酚皂溶液)：主要用于無菌室桌椅、墻壁、地面的消毒和清洗，以及空氣噴撒消毒，特別是污染細(xì)胞的消毒處理。使用濃度請(qǐng)按瓶上說明。 (4)05過氧乙酸：是強(qiáng)效消毒劑，10 min即可將芽孢菌殺死。用于各種物品的表面消毒，用噴撒和擦拭方式進(jìn)行。 (5)乳酸蒸氣：將乳酸放入坩鍋內(nèi)用酒精燈或電爐加熱至沸騰為止

41、。將門窗緊閉13 d?？蓪⒖諝庵衅〉奈⑸餁⑺?。 (6)37甲醛加高錳酸鉀：使用前先緊閉門窗。將37甲醛用酒精燈或電爐加熱至沸騰后斷電或滅火。用一張紙盛好適量的高錳酸鉀，迅速放人已加熱好的甲醛中形成蒸氣。13 d后方可達(dá)到消毒空氣的目的。 3煮沸消毒 急性消毒可用煮沸法，器械等煮沸15 min后使用。 五、注意事項(xiàng)1清洗玻璃制品時(shí)，浸酸之后一定要用自來水沖洗1015次。因?yàn)闅埓娴南匆簩?duì)細(xì)胞粘附有很大影響。清洗塑料制品時(shí)要用棉花或柔軟紗布擦洗。千萬不要用硬毛刷，否則損害塑料表面后細(xì)胞不易貼壁。Tip和Tube一定要用超聲清洗處理后逐個(gè)清洗。如沒有洗凈會(huì)影響下一次使用的效果。 2干熱滅菌時(shí)，應(yīng)在

42、白天使用烤箱，并不斷觀察，以免發(fā)生意外。當(dāng)溫度超過100時(shí)，不能再打開烤箱門。器皿烤完后，待溫度降至100之下才能開烤箱門。金屬器械和橡膠、塑料制品不能使用干熱滅菌方法。 3高壓滅菌后器皿務(wù)必晾干或烘干，以防包裝紙潮濕發(fā)霉。4牛血清、大部分培養(yǎng)基、胰酶和一些生物制劑是有機(jī)溶液，均不能高壓(如TdR，秋水仙素，谷氨酰胺，異硫氰酸胍，MOPS等)。5濾過除菌時(shí)，濾器在使用前先裝好濾膜(有時(shí)可在上面加一層定性濾紙)，包好，經(jīng)高壓滅菌后才能使用。濾過酶類制劑時(shí)應(yīng)待濾器溫度降至室溫下再進(jìn)行。過濾時(shí)壓力不宜過大，壓力數(shù)字以2為宜。壓力太大時(shí)微孔濾膜可能破裂，或使某些微生物變形而通過濾膜。裝濾膜時(shí)位置要準(zhǔn)確

43、。另外濾器包裝時(shí)，螺釘不要擰得太緊，以防高壓蒸汽不能進(jìn)入，待高壓滅菌之后，再擰緊使用。 6使用化學(xué)消毒法時(shí)，配制75酒精應(yīng)用衛(wèi)生級(jí)，不要用化學(xué)純、分析純和優(yōu)質(zhì)純酒精。來蘇兒水不能用于皮膚消毒，它對(duì)皮膚有刺激性?？諝庀緯r(shí)，所有的物品要事先準(zhǔn)備齊全并使消毒者有較方便的退出途徑。因?yàn)榧兹┗蛉樗峒訜岷蠓懦龅恼魵鈱?duì)人的角膜和呼吸道上皮有嚴(yán)重的刺激和傷害作用。 六、思考題1哪些物品適合于高壓滅菌，并說明理由。2紫外線消毒的適用范圍和目的是什么?II、傳代細(xì)胞培養(yǎng)與觀察一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私鈧鞔?xì)胞的傳代方法及操作過程，學(xué)習(xí)觀察體外培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)及生長狀況二、實(shí)驗(yàn)原理傳代培養(yǎng)是指細(xì)胞從一個(gè)培養(yǎng)瓶以1：2或1：2

44、以上的比例轉(zhuǎn)移，接種到另一培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)。這種培養(yǎng)，第一步也是制備細(xì)胞懸液，當(dāng)細(xì)胞長成致密單層時(shí)，它很容易被蛋白水解酶和EDTA)所破壞。所以般采用胰蛋白酶和EDTA(乙二胺四乙酸鹽)的混合物，做為消化液。細(xì)胞培養(yǎng)是一種操作繁瑣而又要求十分嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)技術(shù)。要使細(xì)胞能在體外長期生長，必須滿足兩個(gè)基本要求：一是供給細(xì)胞存活所必需的條件，如適量的水、無機(jī)鹽、氨基酸、維生素、葡萄糖及其有關(guān)的生長因子、氧氣、適宜的溫度，注意外環(huán)境酸堿度和滲透壓的調(diào)節(jié)。二是嚴(yán)格控制無菌條件。三、實(shí)驗(yàn)用品1、器材解剖剪、解剖鑷、眼科剪(尖頭、彎頭)、眼科鑷(尖頭、彎頭)、培養(yǎng)皿、量筒、試管、錐形瓶、吸管、橡皮頭、培養(yǎng)瓶(小方

45、瓶或中方瓶)等。上述器材均須徹底清洗、烤干、包裝好，99xl04Pa(15磅)滅菌30min備用。此外，還有顯微鏡、血細(xì)胞計(jì)數(shù)器、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、酒精燈、酒精棉球、碘酒棉球、試管架、標(biāo)記筆、解剖板等。2、試劑L磷酸鹽緩沖液(PBs)無鈣、鎂溶液細(xì)胞消化液：o5胰蛋白酶和o4%EDTAEMEM液3%谷氨酰胺o5臺(tái)盤藍(lán)染液等3、材料喉癌細(xì)胞四、實(shí)驗(yàn)方法在做傳代細(xì)胞培養(yǎng)之前，首先將培養(yǎng)瓶置于顯微鏡下，觀察培養(yǎng)瓶中細(xì)胞是否已長成致密單層，如已長成單層，即可進(jìn)行細(xì)胞的傳代培養(yǎng)。1.營養(yǎng)液配制:EMEM液 90%犢牛血清 10%雙抗(1萬單位m1) 加至約100單位m1 3谷氛酞胺 1m174NaHCO3

46、調(diào)pH至6870 2換液:在酒精燈旁打開瓶塞，倒去瓶中的細(xì)胞營養(yǎng)液。3.消化與分裝在上述瓶中加入1mlEDTA溶液，輕輕搖動(dòng)，將溶液倒出。重復(fù)上述動(dòng)作。加入適量消化液（0.02%EDTA或0.04EDTA1ml十o5胰蛋白酶液0.2ml）以蓋滿細(xì)胞為宜，置于室溫，停留12min后，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，肉眼觀察細(xì)胞單層是否出現(xiàn)縫隙(針孔大小的空隙)，如出現(xiàn)縫隙，即可倒去消化液；如末出現(xiàn)縫隙，則可將瓶翻回，繼續(xù)進(jìn)行消化，直到出現(xiàn)縫隙為讓。此時(shí)，可倒去消化液，加入新配制的營養(yǎng)液20m1。然后用吸管吸取培養(yǎng)瓶中的營養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁上的細(xì)胞層至瓶壁細(xì)胞全部脫落下來為止。此時(shí)，可繼續(xù)輕輕地吹打細(xì)胞懸液，以使細(xì)胞

47、散開。隨之進(jìn)行分裝。4培養(yǎng)分裝好的細(xì)胞瓶上，做好標(biāo)志，注明細(xì)胞代號(hào)、日期。置于培養(yǎng)架上，輕搖使細(xì)胞均勻分布，以免堆積成團(tuán)。然后置于37培養(yǎng)。5.觀察(1)觀察體外培養(yǎng)細(xì)胞的幾個(gè)問題；細(xì)胞培養(yǎng)24h后，即可進(jìn)行觀察，觀察的重點(diǎn)如下：A.首先要觀察培養(yǎng)細(xì)胞是否污染。主要觀察培養(yǎng)液顏色的變化及混濁度B.觀察培養(yǎng)姬顏色變化及細(xì)胞是否生長。C.如細(xì)胞已生長，則要觀察細(xì)胞的形態(tài)特征并判斷其所處的生長階段。觀察時(shí)可參照(2)的描述進(jìn)行。D觀察完畢，可用臺(tái)盤藍(lán)染液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色。以確定死、活細(xì)胞的比例。(2)細(xì)胞的生長階段及其形態(tài)特征傳代培養(yǎng)的細(xì)胞需逐日進(jìn)行觀察，注意細(xì)胞有無污染，培養(yǎng)液顏色的變化及細(xì)胞生長的

48、情況。般中層培養(yǎng)的細(xì)胞，從培養(yǎng)開始，經(jīng)過生長、繁殖、衰老及死亡的全過程。它是一個(gè)連續(xù)的生長過程，但為了觀察及描述，人為地將具分為5個(gè)時(shí)期，但各期間無明顯絕對(duì)界限。現(xiàn)分別描述如下：A游離期：當(dāng)細(xì)胞經(jīng)消化分散成單個(gè)細(xì)胞后，由于細(xì)胞原生質(zhì)的收縮相表面張力以及細(xì)胞膜的彈性。所以，此時(shí)細(xì)胞多為圓形，折光率高，此期可延續(xù)數(shù)h。B吸附期(貼壁)：由于細(xì)胞的附壁持性，細(xì)胞懸液靜置培養(yǎng)一段時(shí)間(約78h)后，便附著在瓶壁上(此期不同細(xì)胞所需時(shí)間不同)。在顯微鏡下觀察時(shí)可見瓶壁上有各種形態(tài)的細(xì)胞，如圓形、扁形、短菱形。細(xì)胞的特點(diǎn)，大多立體感強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)顆粒少，透明。C.繁殖期：培養(yǎng)l2h以后直到72h，細(xì)胞進(jìn)入繁殖

49、期，加速了細(xì)胞生長和分裂。此期包括由幾個(gè)細(xì)胞形成的細(xì)胞島(即由少數(shù)細(xì)胞緊密聚集而呈現(xiàn)的孤立細(xì)胞群，常散在地分布在瓶壁上)，到細(xì)胞鋪滿整個(gè)瓶壁(即所謂形成細(xì)胞單層)的過程。此期細(xì)胞形態(tài)為多角形(呈現(xiàn)上皮樣細(xì)胞的特征)。細(xì)胞特點(diǎn)：透明，顆粒較少，細(xì)胞間界限清楚，并可隱約見到細(xì)胞核。根據(jù)細(xì)胞所占瓶壁有效面積的百分率，又可將其生長狀況分為四級(jí)。以“十”的多少表示如下：十：細(xì)胞占瓶壁有效面積(也就是細(xì)胞能生長的瓶壁面積)的25以內(nèi)有新生細(xì)胞。一般要觀察35個(gè)視野內(nèi)的細(xì)胞生長狀況，然后加以綜合分析判斷。十十：細(xì)胞占瓶壁有效面積的2575以內(nèi)具新生細(xì)胞。十十十：細(xì)胞占瓶壁有效面積的7595具新生細(xì)胞。細(xì)胞排

50、列致密。但仍有空隙。十十十十：細(xì)胞占瓶壁95以上，細(xì)胞已長滿或接近長滿單層，細(xì)胞致密，透明度好。從十十一十十十十為細(xì)胞的對(duì)數(shù)增長期(或稱為指數(shù)增長期)。D維持期：當(dāng)細(xì)胞形成良好單層后，細(xì)胞的生長與分裂都減緩，并逐漸停止生長，這種現(xiàn)象被稱為細(xì)胞生長的接觸抑制。此時(shí)細(xì)胞界限逐漸模糊，細(xì)胞內(nèi)顆粒逐漸增多，且透明度降低，立體感較差。由于代謝產(chǎn)物的不斷積累，維持液逐漸變酸。此時(shí)營養(yǎng)液已變?yōu)槌赛S色或黃色。E衰退期：由于溶液中營養(yǎng)的減少和日齡的增長，以及代謝產(chǎn)物的累積等因素，此時(shí)細(xì)胞間可出現(xiàn)空隙，細(xì)胞中顆粒進(jìn)一步增多，透明度更低，立體感很差。若將細(xì)胞經(jīng)固定染色處理后，可見細(xì)胞中有大而多的脂肪滴及液泡。最后，

51、細(xì)胞皺縮，逐漸死亡，從瓶壁上脫落下來。五、思 考 題1簡述細(xì)胞傳代培養(yǎng)的操作程序及注意鄉(xiāng)項(xiàng)。3細(xì)胞培養(yǎng)獲得成功的關(guān)鍵要素是什么?3簡述體外培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)特征及其生長階段。實(shí)驗(yàn)二 植物細(xì)胞組織培養(yǎng)一實(shí)驗(yàn)?zāi)康?植物細(xì)胞和組織培養(yǎng)的技術(shù)性強(qiáng)，要求無菌操作，通過本實(shí)驗(yàn)可初步掌握常規(guī)的組織培養(yǎng)技術(shù)，加深對(duì)無菌操作的了解。 二實(shí)驗(yàn)原理 植物的全能性：植物體的任何一個(gè)細(xì)胞都具有生長分化成為一個(gè)完整植株的能力，稱為植物的全能性。 植物組織培養(yǎng)就是利用植物的全能性進(jìn)行離體無菌植物培養(yǎng)的一門技術(shù)。植物組織培養(yǎng)按其原始意義，就是指愈傷組織培養(yǎng)。但發(fā)展至今，其范圍日益擴(kuò)大，已包括植物和它的離體器官、組織、細(xì)胞和原生質(zhì)

52、體的離體無菌培養(yǎng)。因此，擁有幾種不同水平的培養(yǎng)技術(shù)，即整體的、器官的、組織的、細(xì)胞的和原生質(zhì)的培養(yǎng)技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)選擇豌豆為材料，豌豆（Pisum sativum）屬豆科植物，是糧食、飼料和重要的蔬菜作物，也是遺傳學(xué)家和植物生理學(xué)家感興趣和樂于采用的實(shí)驗(yàn)植物，豌豆的根、莖、子葉、下胚軸、上胚軸、花芽等外植體，皆可形成愈傷組織，其中莖尖、幼胚、幼葉等器官可成功的再生成植株。莖尖培養(yǎng)可包括小至十幾微米的莖尖分生組織（生長點(diǎn)）和大至幾十毫米的莖尖或更大的芽培養(yǎng)。在實(shí)踐應(yīng)用上，常采用生長點(diǎn)的培養(yǎng)使患病植物去病毒，以達(dá)到挽救優(yōu)良品種，提高產(chǎn)量和質(zhì)量之目的。三實(shí)驗(yàn)材料 儀器設(shè)備：1酒精燈、三角燒瓶，培養(yǎng)皿；2

53、鑷子、剪刀、剖針；3雙筒解剖顯微鏡；4光照培養(yǎng)箱或溫室；材料 煙草無菌苗、豌豆幼苗。試劑（1）MS培養(yǎng)基，植物激素：NAA、6-BA等；（2）飽和漂白粉液（次氯酸鈉）；（3）70%酒精、100%酒精、酒精棉球；（4）無菌水 四實(shí)驗(yàn)步驟 豌豆苗的莖尖培養(yǎng) 取發(fā)芽6天的豌豆幼苗10株，簡取1厘米左右的莖尖，浸入70%的酒精中1分鐘，再浸入飽和次氯酸鈉溶液中消毒15分鐘，（此步以后要求無菌）用無菌水中沖洗5次，在滅菌的濾紙上吸干水分，放入滅菌的培養(yǎng)皿中。 在雙目解剖鏡下，用滅菌的解剖針剝?nèi)ビ兹~露出生長錐，用滅菌的解剖針挑取帶著兩至三個(gè)葉原基的生長錐。 將挑好的莖尖移到MS+10.7mol/L萘乙酸(

54、NAA)+4.4mol/L 6-芐基腺嘌呤（6-BA）的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織形成，用封口膜將培養(yǎng)皿封好。（4）在恒溫培養(yǎng)箱中，26下,培養(yǎng)六周，形成愈傷組織，經(jīng)繼代后，可用于生根培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)三 酵母菌細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)酵母菌原生質(zhì)體制備和再生技術(shù)，為了解酵母菌為材料的外源基因轉(zhuǎn)移等技術(shù)奠定基礎(chǔ)。二、實(shí)驗(yàn)原理酵母菌如釀酒酵母，在遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的研究中有很大作用，尤其是近些年來，隨著科技的進(jìn)步，酵母菌的遺傳操作如轉(zhuǎn)化、基因克隆和外源基因在酵母受體中的表達(dá)等技術(shù)都有了突破性的進(jìn)展。作為受體系統(tǒng)的酵母菌原生質(zhì)體在這些技術(shù)中有獨(dú)特的地位。這種經(jīng)溶菌酶處理脫壁后的細(xì)胞（脫壁不完全者稱原生質(zhì)球）既可以作為不同種屬間細(xì)胞融合的母體，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞器等大結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)移，又可作為外源基因轉(zhuǎn)移的受體，大大提高基因轉(zhuǎn)移的效率。這些新技術(shù)不僅促進(jìn)了酵母菌遺傳學(xué)的發(fā)展，而且很多已應(yīng)用到構(gòu)建新的釀酒業(yè)酵母。本實(shí)