大腸桿菌K88相關產品的研制ppt課件

1、.大腸桿菌口服疫苗的研制 匯報人:范群平生物制品實驗室.What is vaccine？ 廣義的疫苗是 為了預防、控制傳染病的發(fā)生和流行而接種于機體的預防性生物制品。 生物制品，是指用微生物或其毒素，人或動物的血清、細胞等制備的用來預防、診斷和治療用的制劑 。預防用的抗體制劑也可以歸類為疫苗.What is oral vaccine？口服疫苗，顧名思義，就是經“口途徑接種的疫苗，進一步來說是經過消化道途徑進展接種的疫苗。.Why choose the oral vaccine？首先，口服疫苗防止了注射疫苗呵斥的驚嚇應激，有效維護了動物福利。其次，口服疫苗降低了養(yǎng)殖本錢，例如人力本錢、抗應激產品

2、的本錢。最后，對于許多經腸道和黏膜外表感染的致病微生物有較好的防御才干 ?？诜呙缇哂泻甏蟮氖袌銮熬?！.Why do we choose the E.Coli ? 之所以選擇大腸桿菌作為研討對象，就是由于仔豬大腸桿菌病是豬的常見傳染病之一，發(fā)病率、死亡率高達50%100%，直接給豬場呵斥宏大的經濟損失。 治療不及時，即使恢復也變成僵豬，影響仔豬的生長發(fā)育，呵斥飼料的浪費，間接影響豬場的經濟效益。.Why is the K88 ?1、大腸桿菌的致病性取決于它在小腸的粘附、定植、增殖以及產生毒素的才干，粘附因子或纖毛決議細菌定植的才干，一旦發(fā)生細菌定植，就會快速增值并產生毒素從而導致腹瀉的發(fā)生。2

3、、經過流行病學調查，我們發(fā)現(xiàn)導致仔豬大腸桿菌病的的最主要的粘附因子就是 3、K88幾乎100%由蛋白質組成，具有較強的免疫原性。K88.How to prevent and treat the E.Coli disease?最好的方法就是運用為此，根據(jù)仔豬免疫系統(tǒng)的發(fā)育情況，我們設計了兩種抗體運用方案：一、早期直接抗體運用方案雞抗豬產腸毒素大腸桿菌K88卵黃抗體的研制二、后期間接抗體運用方案攜帶豬源產腸毒素大腸桿菌(k88)抗原基因的口服乳酸菌疫苗的開發(fā)及運用抗體.一、雞抗豬產腸毒素大腸桿菌K88卵黃抗體的研制.Why do we choose yolk antibodyIgY ?1、抗體程度

4、高 卵黃抗體所含有的抗體滴度大于血清中的抗體滴度，作為飼料添加劑具有更高的免疫維護效率。2、穩(wěn)定性高 卵黃抗體具有很高的熱穩(wěn)定性，便于機械消費、加工。3、平安性高 卵黃抗體可以用來防治相應的病原體引起的感染并且無藥物殘留、不產生耐藥性。4、用途廣泛 純化的卵黃抗體可以用來診斷疾病并且具有經濟省時省力的特點。.Research mathods1、產腸毒素大腸桿菌K88菌株的分別鑒定以及擴展培育培育基+誘導劑 37、220rpm24小時震蕩培育.名稱豬大腸桿菌豬沙門氏菌培養(yǎng)基豬大腸桿菌培養(yǎng)基疫苗生產用豬沙門氏菌培養(yǎng)基疫苗生產用細菌計數(shù)2.5109cfu/ml1109cfu/ml表1：細菌計數(shù)結果2

5、、經過SDS實驗證明K88粘附素蛋白表達了以后，進展細菌計數(shù)，以保證有較高的細菌數(shù)來用于疫苗制備。.3、疫苗的制備 1、 菌株的滅活 在菌液濃度為1109cfu/mL的細菌懸液中參與終濃度為3的甲醛溶液，37恒溫振蕩作用48h。 2、滅活效果鑒定滅活苗12滅活前細菌計數(shù)109 cfu/mL109 cfu/mL滅活后細菌計數(shù)00.3、疫苗的乳化 將配制好并高壓滅菌的油相佐劑與滅活的菌液按照1:1的比例混合，并用勻漿儀乳化，乳化期間不定時抽樣檢測疫苗的乳化效果乳化好的滅活疫苗呈乳白色牛奶狀，滴入清水中時不溶解，不分散，不沉淀。.4、預接種實驗 為了檢驗動物實驗設計的科學性和可行性，防止設計不周呵斥

6、浪費，我們設計了預實驗 。預實驗證明以6 109 cfu的量免疫效果最好，免疫雞群一開場出現(xiàn)應激反響，采食量下降、精神抑郁，趴臥不起。接種一周后雞群恢復正常，沒有出現(xiàn)實驗雞只死亡。. 免疫170日齡待開產雞，雞群分為2組，每組100只，一組 為對照組，一組為實驗組。1、首免每羽注射1.0 mL。2、兩周左右進展二免，方法同初免，每羽注射1.5ml。3、周圍后進展三免，方法同初免，每羽注射2.0ml。4、每周搜集卵黃液，采用試管直接凝集法進展卵黃 液中卵黃抗體效價的測定。5、免疫待開產雞群，誘導免疫應對，產生高抗體程度的雞蛋.樣品編號12345678910111213抗體效價（log2）3666

7、.57.58989111010106、免疫雞群的抗體效價變化表3：免疫雞群大腸桿菌k88抗體效價.免疫雞群的抗體效價變化以上結果闡明：免疫蛋雞在免疫后卵黃中的特異性抗體開場明顯升高，10周到達頂峰，并繼續(xù)到13周。. 搜集免疫雞1013周產的雞蛋，進展噴干工藝的探求，最后確定噴干時進口溫度設定為160，出口溫度設定為90，對卵黃抗體滴度無影響，并且易于操作。7、卵黃抗體的噴霧枯燥.指標色澤粒度粗蛋白消化率卵黃抗體粉初產品淡黃色80目12.6%97.6%8、卵黃抗體粉目的測定保管條件：常溫下放置半年，卵黃抗體活性無影響。卵黃抗體噴干粉在消費上具有良好的加工和儲存性能！表4：卵黃抗體目的.9、小鼠

8、造模飼喂實驗5周齡小鼠豢養(yǎng)察看一周后無異常，直腸試紙檢測ETEC陰性，感染前,停頓喂食12h，腹腔注射0.2ml菌液，2h后正常喂食。對照組處置的不同之處是把菌液改為生理鹽水。感染后對動物的察看:每隔3h察看1次，延續(xù)察看24小時并記錄。 表5：各實驗組小鼠死亡情況.10、k88卵黃抗體的斷奶仔豬飼喂實驗從表6可見，3個組日增重最好的為實驗組達169.72g，最差的為對照組131.94g，料重比最好的為實驗組1.48，最差的為對照組達1.92，實驗組介于兩者之間。腹瀉頭次以實驗組為最小。.對照組的腹瀉率最高為16.49%顯著高于2個實驗組，這闡明合用IgY對有效降低仔豬斷奶后腹瀉的發(fā)生，且在合

9、理范圍內隨著劑量的添加其腹瀉效果越好。但是綜合料重比，腹瀉呵斥的死亡率等數(shù)據(jù)來看，根底日糧+1%的k88卵黃抗體粉可以收到最正確的效果.思索到實踐消費中，導致仔豬腹瀉的情況較為復雜，不只是大腸桿菌K88粘附素，因此我們有做了進一步的任務調整，將攜帶K88、K99、987P、F41、F18菌毛抗原的幾種大腸桿菌還有傷寒沙門氏菌結合在一同制成了大腸桿菌沙門氏菌二聯(lián)5價卵黃抗體。.二、攜帶豬源產腸毒素大腸桿菌(k88)抗原基因的口服乳酸菌疫苗的開發(fā)及運用.實驗一、重組乳酸菌的PCR鑒定及表達產物的 SDS和West-blot分析.重組菌活化、增菌及質粒的提取鑒定PCR鑒定重組菌的誘導表達Wester

10、n-blotSDS免疫動物多克隆抗體的制備產毒素大腸桿菌疫苗的制備確定為攜帶誘導肽和抗原基因的重組乳酸菌技術道路.1、重組乳酸菌的分子鑒定PCR鑒定圖1:重組乳酸菌核酸PCR分子鑒定M:DL2000；1、4、7:為重組乳酸菌核酸PCR擴增結果.重組菌活化、增菌及質粒的提取鑒定PCR鑒定重組菌的誘導表達Western-blotSDS免疫動物多克隆抗體的制備產毒素大腸桿菌疫苗的制備確定為攜帶誘導肽和抗原基因的重組乳酸菌.2 大腸桿菌和乳酸菌發(fā)酵產物免疫印跡West-bloting結果 1 M 2 3 4M:低分子量蛋白marker;1:大腸桿菌(K88)發(fā)酵液；2、4 :乳酸菌發(fā)酵上清液3 :乳酸

11、菌菌體沉淀樣品18KD28KD45KD60KD100KD圖4:大腸桿菌和乳酸菌發(fā)酵產物免疫印跡結果.實驗二、乳酸工程菌誘變選育及工業(yè)化消費條件的探求.重組菌的紫外誘變選育耐酸耐膽鹽遺傳穩(wěn)定性檢測培育基工業(yè)化配方的優(yōu)化發(fā)酵條件的優(yōu)化中試最正確培育基溫度、轉速等確定工業(yè)化消費最正確發(fā)酵條件遺傳穩(wěn)定性檢測技術道路.1 重組乳酸菌的誘變選育1.1 紫外誘變結果稀釋度對照誘變時間菌落個數(shù)致死率10-7300120s6877.4%150s4884%180s2093%10-82790s774%120s966.7%150s966.7%10-90180s0結論：誘變結果闡明，誘變數(shù)據(jù)符合誘變勝利的前提條件，可以

12、對存活的菌落進展選育。.1.2、重組乳酸菌的選育以活菌下降對數(shù)值均小于2為規(guī)范，從17株乳桿菌中初步挑選出1株優(yōu)良菌株，其耐酸和耐膽鹽測定結果如表編號耐膽鹽測定（log）耐酸(log)原液(log)耐膽鹽對數(shù)差耐酸對數(shù)差147.727.6222247.827.6722347.777.7122447.787.782255.017.757.72265.117.597.6922747.617.8422847.577.612294.697.77.72221047.727.722114.487.697.68221247.887.89221347.987.98221447.97.7822156.147.5

13、87.5322165.267.687.6622174.887.797.7622.2 重組乳酸菌選育株對小鼠腸粘液的體外粘附實驗名稱活菌數(shù)（cfu/mL）原液活菌總數(shù)（cfu/mL）體外粘附率粘液11.63 1094.7 10964.2%粘液21.73 1094.7 10963.2%灌腸1.28 1094.7 10972.8%.3 選育株的遺傳穩(wěn)定性實驗選育株傳10代后，在紅霉素培育基里的計數(shù)情況，闡明遺傳穩(wěn)定性較好。.重組菌的紫外誘變選育耐酸耐膽鹽遺傳穩(wěn)定性檢測培育基工業(yè)化配方的優(yōu)化發(fā)酵條件的優(yōu)化中試最正確培育基溫度、轉速等確定工業(yè)化消費最正確發(fā)酵條件遺傳穩(wěn)定性檢測技術道路.運用消費常用的發(fā)酵

14、條件和培育基，沒再單獨進展優(yōu)化實驗，做好種子液后加到500L發(fā)酵罐中，發(fā)酵12h后，再轉入5噸的發(fā)酵罐，每2h取一次樣，進展乳酸菌計數(shù)和pH值的測定，并繪制生長曲線。.1 選育株的生長曲線測定.2 選育株的菌液PH值變化情況測定在5噸大罐中發(fā)酵時間以20小時為宜。.實驗三、重組乳酸菌作為口服疫苗對小鼠免疫 目的的影響及免疫維護效果的研討.小鼠實驗進程一覽9.10開場動物實驗10.19處置第一批小鼠11.6處置第二批11.22處理第三批10.28-30號，延續(xù)三天灌胃，同時進展疫苗免疫9.24-26號，延續(xù)三天灌胃，同時進展疫苗免疫10.10-12號，延續(xù)三天灌胃，同時進展疫苗免疫11.14-1

15、6號，延續(xù)三天灌胃，同時進展疫苗免疫12.4攻毒實驗12.17處置最后一批.1 小鼠脾臟指數(shù)mg/kg測定結果從結果可以看出，各實驗組小鼠脾臟指數(shù)均高于對照組，且均差別顯著P疫苗組LP組生理鹽水組。組別乳酸菌大腸桿菌生理鹽水組8.94.17LP組8.535.11疫苗組8.834工程菌組8.74.結果闡明：1、在非特異性免疫方面，運用重組乳酸菌對小鼠生長初期的脾臟指數(shù)和小鼠腸道內sIgA的分泌有繼續(xù)的促進作用；2、在特異性免疫方面，重組乳酸菌的效果相比自制的大腸桿菌疫苗效果更加耐久，能長時間刺激機體產生高程度的大腸桿菌K88抗體。.實驗四、重組乳酸菌選育株作為口服疫苗對斷奶仔豬飼喂效果的研討.4.1重組乳酸菌對斷奶仔豬糞便中sIgA含量的影響 結果闡明，飼喂重組乳酸菌的斷奶仔豬糞便中sIgA的含量顯著多于對照組。闡明基因工程乳酸菌可以顯著提高斷奶仔豬的腸道粘膜免疫，加強動物機體的抵抗力。.4.2重