56-突變位點(diǎn)的檢測(cè)課件

1、2 主要核酸操作技術(shù)核酸凝膠電泳技術(shù)核酸分離技術(shù)PCR技術(shù)mRNA的純化和文庫(kù)的構(gòu)建基因克隆技術(shù)DNA序列分析技術(shù)突變位點(diǎn)的檢測(cè)主要內(nèi)容遺傳標(biāo)記DNA遺傳標(biāo)記基因突變SNPSNP檢測(cè)技術(shù)遺傳標(biāo)記遺傳標(biāo)記：形態(tài)學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記、生化標(biāo)記、分子標(biāo)記分子標(biāo)記（Molecular Markers）廣義：可遺傳并可檢測(cè)的特異DNA序列、RNA或蛋白質(zhì)。狹義：指DNA或RNA標(biāo)記。DNA遺傳標(biāo)記：指以個(gè)體間遺傳物質(zhì)內(nèi)核苷酸序列變異為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記，是DNA水平遺傳多態(tài)性的直接的反映。DNA遺傳標(biāo)記的種類（P436）：限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性RFLP、簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）、SNP。主要內(nèi)容遺傳標(biāo)記DNA遺傳

2、標(biāo)記基因突變SNPSNP檢測(cè)技術(shù)DNA遺傳標(biāo)記(P437)第一代標(biāo)記： 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）定義：用限制性內(nèi)切酶特異性切割DNA鏈，由于DNA的一個(gè)“點(diǎn)”上的變異所造成的能切與不能切兩種狀況，可產(chǎn)生不同長(zhǎng)度的片段，可用凝膠電泳顯示多態(tài)性。優(yōu)點(diǎn)：廣泛用于檢測(cè)已知DNA點(diǎn)突變，可以檢測(cè)大到幾千個(gè)堿基對(duì)DNA片段；對(duì)SNP位點(diǎn)檢測(cè)和基因分型均能較準(zhǔn)確的判斷。缺點(diǎn)：限制性酶切過(guò)程中不可避免的遭遇到酶切不完全或DNA降解的現(xiàn)象，且只能檢測(cè)已知多態(tài)位點(diǎn)，不能罕見(jiàn)的或未知的突變位點(diǎn)；每次酶切2-3個(gè)片段，信息量有限；限制性內(nèi)切酶價(jià)格較昂貴。DNA遺傳標(biāo)記第二代標(biāo)記：簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）定義：真

3、核生物基因組中散布有由大量由簡(jiǎn)單重復(fù)序列所組成的微衛(wèi)星和由串聯(lián)重復(fù)短序列組成的小衛(wèi)星。在小衛(wèi)星或微衛(wèi)星的兩端往往是相對(duì)保守的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。通過(guò)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增、凝膠電泳和放射自顯影（或銀染），可以檢測(cè)到在簡(jiǎn)單重復(fù)序列中由于重復(fù)單位數(shù)不同而造成的DNA區(qū)域的多態(tài)性。優(yōu)點(diǎn)：與RFLP標(biāo)記相比SSR檢測(cè)的多態(tài)性頻率高得多。應(yīng)用：基因定位、DNA指紋分析、遺傳分析和疾病診斷等。缺點(diǎn)：要克隆足夠數(shù)量的SSR并進(jìn)行測(cè)序，需要投入足夠的資金、人力和時(shí)間。DNA遺傳標(biāo)記第三代標(biāo)記：SNP 定義：基因組DNA序列中單個(gè)核苷酸的突變引起的多態(tài)性。SNP是基因組中最簡(jiǎn)單、最常見(jiàn)的多態(tài)形式，具有很高的遺傳

4、穩(wěn)定性。 已經(jīng)在人類基因組中發(fā)現(xiàn)了超過(guò)1000萬(wàn)個(gè)SNP位點(diǎn)，平均約每300bp就有一個(gè)SNP。絕大多數(shù)SNP位于非編碼區(qū)。優(yōu)點(diǎn)：可用于檢測(cè)未知突變；可以與DNA芯片技術(shù)相結(jié)合實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化檢測(cè)。缺點(diǎn)：存在假陽(yáng)性和假陰性；檢測(cè)效果受檢測(cè)條件影響。DNA遺傳標(biāo)記依據(jù)DNA遺傳標(biāo)記進(jìn)行基因分型。P473基因型（genotype）： 人：除性染色體外，人類細(xì)胞內(nèi)的染色體都有兩份，一個(gè)人所擁有的一對(duì)等位位點(diǎn)的類型被稱為-。 泛指：同一基因座位上多個(gè)等位位點(diǎn)的類型?；蚍中停╣enotyping）：確定某個(gè)個(gè)體基因型的實(shí)驗(yàn)。等位位點(diǎn)（P66）：指染色體DNA同一位置上的每個(gè)堿基類型。主要內(nèi)容遺傳標(biāo)記DNA遺

5、傳標(biāo)記基因突變SNPSNP檢測(cè)技術(shù)基因突變定義：由于體內(nèi)外各種因素使基因特定的DNA序列的堿基組成或排列順序發(fā)生改變，導(dǎo)致DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)改變。根據(jù)分子機(jī)制不同分為：插入突變、缺失突變、點(diǎn)突變 。插入/缺失突變：DNA序列插入/缺失一個(gè)或多個(gè)核苷酸的突變。eg. 轉(zhuǎn)座子（復(fù)制型轉(zhuǎn)座子、非復(fù)制型轉(zhuǎn)座子）?；蛲蛔凕c(diǎn)突變：指一種堿基通過(guò)化學(xué)修飾、遺傳變異、復(fù)制錯(cuò)誤等引起的單一堿基的改變。分為轉(zhuǎn)換（transition）和顛換（transversion）。轉(zhuǎn)換最常見(jiàn)，約占SNP的2/3。主要內(nèi)容遺傳標(biāo)記DNA遺傳標(biāo)記基因突變SNPSNP檢測(cè)技術(shù)SNP (P66)SNP廣泛存在于人類基因組中。單倍/體型

6、（haplotype）：位于染色體上某一區(qū)域的一組相關(guān)聯(lián)的SNP等位位點(diǎn)被稱為-。相鄰SNPs的等位位點(diǎn)傾向于以一個(gè)整體遺傳給后代（圖2-42）。34個(gè)相鄰的SNP標(biāo)記構(gòu)成的單體型就可有816種。SNPSNP分類：根據(jù)SNP在基因組中的分布位置，可分為： cSNP（1/5）、pSNP、rSNP。從對(duì)生物遺傳性狀的影響上看，cSNP又可分為： 同義cSNP、非同義cSNP 。SNP的應(yīng)用（P69）：人類基因單體型圖的繪制SNP與疾病易感基因的相關(guān)性分析指導(dǎo)用藥與藥物設(shè)計(jì)動(dòng)物、植物、微生物的遺產(chǎn)改造/育種主要內(nèi)容遺傳標(biāo)記DNA遺傳標(biāo)記基因突變SNPSNP檢測(cè)技術(shù)SNP檢測(cè)技術(shù)（課下拓展，各技術(shù)有何

7、優(yōu)缺點(diǎn)）限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析-RFLP單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析-SSCP 毛細(xì)管電泳變性高效液相色譜-DHPLC異源雙鏈分析-HA變性梯度凝膠電泳分析-DGGE DNA芯片技術(shù)-DNA chip 實(shí)時(shí)熒光PCR分析 直接序列測(cè)定， PCRSNP檢測(cè)技術(shù) PCR-RFLP： 原理：先用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因片段，由于DNA個(gè)別堿基的突變，致使DNA分子的限制酶切位點(diǎn)及數(shù)目發(fā)生改變，用限制酶切割目的片段，所產(chǎn)生的片段數(shù)目和每個(gè)片段的長(zhǎng)度就不同，即所謂的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性。P427： 突變位點(diǎn)的檢測(cè)技術(shù) 單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）： 是一種基于單鏈DNA構(gòu)象差別的點(diǎn)突變檢測(cè)方法。相同長(zhǎng)度的單鏈D

8、NA如果順序不同，甚至單個(gè)堿基不同，就會(huì)形成不同的構(gòu)象，在電泳時(shí)泳動(dòng)的速度不同。將PCR產(chǎn)物經(jīng)變性后，進(jìn)行單鏈DNA凝膠電泳時(shí)，靶DNA中若發(fā)生單個(gè)堿基替換等改變時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)泳動(dòng)變位。 優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單快速，價(jià)廉，特別適合大樣本的篩選；用SSCP法檢測(cè)小于200bp的PCR產(chǎn)物時(shí)，檢出率可達(dá)70-95。 缺點(diǎn)：存在假陽(yáng)性和假陰性；檢測(cè)效果受凝膠交聯(lián)度、電泳溫度、片斷長(zhǎng)度等條件影響，當(dāng)片段大于400bp時(shí)，檢出率僅為50左右；同時(shí)該法不能測(cè)定突變的準(zhǔn)確位點(diǎn)，還需通過(guò)序列分析來(lái)確定。突變位點(diǎn)的檢測(cè)技術(shù) 異源雙鏈分析法（HA） 原理： 由于突變和野生型DNA形成的異源雜合雙鏈DNA在其錯(cuò)配處會(huì)形成一突起，

9、在非變性凝膠中電泳時(shí)，會(huì)產(chǎn)生與相應(yīng)的同源雙鏈DNA不同的遷率。 優(yōu)點(diǎn)：HA是SSCP法鮮為人知的姊妹篇，操作也比較簡(jiǎn)便。 HA和SSCP兩種方法突變檢測(cè)模式不同，兩種方法可以同時(shí)在同一張凝膠上進(jìn)行，二者可以相互掩蓋對(duì)方的缺點(diǎn)與不足，使突變檢出率提高到近100。 缺點(diǎn)： 只能分離雙鏈DNA；也只適合于小片段的分析。SNP檢測(cè)技術(shù) 實(shí)時(shí)熒光PCR分析 原理：使用針對(duì)核酸中不同多態(tài)性序列的熒光探針，只有與靶序列完全匹配的探針才能被相應(yīng)的切割，它們?cè)赑CR擴(kuò)增中被水解切割釋放出熒光信號(hào)，不同探針標(biāo)記不同的熒光報(bào)道信號(hào)。 優(yōu)點(diǎn)：操作方便簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)時(shí)間是現(xiàn)有方法中最短的，重復(fù)性強(qiáng)，適合于大量樣本的檢測(cè)；同

10、時(shí)整個(gè)實(shí)驗(yàn)是在閉管的狀態(tài)下完成，可以非常有效避免污染；結(jié)果判斷借助儀器軟件自動(dòng)判讀，客觀性強(qiáng)。缺點(diǎn)：只能對(duì)已知的多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行分析；需要專門(mén)的儀器、試劑。SNP檢測(cè)技術(shù) 基因芯片法 (DNA chip) ： 原理：又稱為DNA 微探針陣列（Micro array）。它是集成了大量的密集排列的已知序列探針，通過(guò)與被標(biāo)記的若干靶核酸序列互補(bǔ)匹配，與芯片特定位點(diǎn)上的探針雜交，利用基因芯片雜交圖象，確定雜交探針的位置，便可根據(jù)堿基互補(bǔ)匹配的原理確定靶基因的序列。 優(yōu)點(diǎn)：快速簡(jiǎn)單、自動(dòng)化程度高，使SNPs的分析更加便捷，具有很大的發(fā)展?jié)摿?；還可用于基因定位、DNA測(cè)序、物理圖譜和遺傳圖譜的構(gòu)建等。 缺點(diǎn)

11、：需要專門(mén)的儀器、試劑，費(fèi)用較高。 直接測(cè)序測(cè)定： 是診斷未知突變基因最直接的方法，其方法是將PCR產(chǎn)物在自動(dòng)測(cè)序儀上直接測(cè)序。 優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便，測(cè)序時(shí)間短。 缺點(diǎn)：費(fèi)用昂貴，僅適合于小樣本量分析。SNP檢測(cè)技術(shù)思考簡(jiǎn)述DNA遺傳標(biāo)記的種類？突變位點(diǎn)的檢測(cè)技術(shù) 變性梯度凝膠電泳法（DGGE） 原理：當(dāng)雙鏈DNA在變性梯度凝膠中進(jìn)行到與DNA變性濕度一致的凝膠位置時(shí)，DNA發(fā)生部分解鏈，電泳遷移率下降；當(dāng)解鏈的DNA鏈中有一個(gè)堿基改變時(shí)，會(huì)在不同的時(shí)間發(fā)生解鏈，因影響電泳速度變化的程度不同而被分離。 優(yōu)點(diǎn)：檢測(cè)片段可達(dá)1kb，最適范圍為100bp-500bp，如果突變發(fā)在最先解鏈的DNA區(qū)域，檢

12、出率可達(dá)100；檢測(cè)結(jié)果無(wú)假陽(yáng)性重復(fù)性好，準(zhǔn)確率高，可判斷基因型；該法一經(jīng)建立，操作也較便，適合于大樣本的檢測(cè)篩選。 缺點(diǎn)：由于本法是利用溫度和梯度凝膠遷移率來(lái)檢測(cè)，需要一套專的電泳裝置，合成的PCR引物最好在5末端加一段40bp-50bp的GC夾，以利于檢測(cè)發(fā)生于高熔點(diǎn)區(qū)的突變。突變位點(diǎn)的檢測(cè)技術(shù) 變性高效液相色譜檢測(cè)（DHPLC） 原理：含有突變位點(diǎn)的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)變性、退火，將形成同源和異源雙鏈兩種DNA 分子。在部分變性條件下，發(fā)生錯(cuò)配的異源雙鏈DNA 更易于解鏈為單鏈DNA，與DNASep 柱結(jié)合力降低，比同源雙鏈DNA 分子更易于被乙腈洗脫下來(lái)，從而與同源雙鏈DNA 分離。 優(yōu)點(diǎn)：分離DNA分子快速，操作自動(dòng)化、簡(jiǎn)便，經(jīng)濟(jì)； PCR產(chǎn)物無(wú)須進(jìn)行純化處理即可用于突變檢測(cè)；能準(zhǔn)確測(cè)定DNA片段大小，基因突變檢出率高（達(dá)95-100%） 。 缺點(diǎn)： DHPLC 檢測(cè)的靈敏性、特異性受PCR引物、PCR 體系及反應(yīng)條件、檢測(cè)溫度、DNASep柱質(zhì)量以及流動(dòng)相梯度等多重影響。突變位點(diǎn)的檢測(cè)技術(shù) 蛋白截?cái)嗉夹g(shù)（PTT） 由于基因的非缺失型突變多可能造成翻譯過(guò)程的提前終止(突出表現(xiàn)為點(diǎn)突變形成終止密碼子)，其蛋白質(zhì)產(chǎn)物為截短肽鏈；在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，這種突變雜合子電泳