三、DNA與RNA分析方法課件

1、第三章 DNA與RNA分析方法電泳 電泳是分離、鑒定和純化DNA與RNA片段的標準方法，該方法操作簡便、快速，可分辨其他方法(如密度梯度離心、纖維素柱等分離方法)無法分離的DNA或RNA片段。將低濃度的熒光 嵌入染料染色后可直接確定DNA或RNA在凝膠 中的位置。檢測的量可少至1-10ng。并可從凝膠中回收DNA條帶，用于基因的克隆等操作。 根據(jù)凝膠介質(zhì)的不同可分為瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳。第一節(jié) 瓊脂糖凝膠電泳 瓊脂糖是從海藻中提取出來的線狀高聚物，經(jīng)過純化后可作為分離DNA或RNA的介質(zhì)。瓊脂糖經(jīng)某些化學修飾后可變?yōu)榈腿埸c瓊脂糖，其熔點和凝固點降低，但凝固后凝膠的強度無明顯改變。

2、瓊脂糖的基本結(jié)構(gòu)： 瓊脂糖凝膠分離DNA片段的原理 瓊脂糖吸水形成膠球，不同大小的DNA分子通過膠球之間的孔隙時移動的速度不同，DNA分子越小移動的速度越快，DNA分子越大移動的速度越慢。一、普通瓊脂糖凝膠電泳 目的：檢測、分離和純化DNA或RNA片段（0.5-25 kb）1. 凝膠濃度與待分離DNA大小的關(guān)系 瓊脂糖濃度（%） 線性DNA的有效分離范圍（kb） 0.5 30 - 1 0.7 12 - 0.8 1.0 10 - 0.5 1.2 7 - 0.4 1.5 3 - 0.2 2.0 2 - 0.12. 瓊脂糖凝膠的制備1) 配膠：按一定的比例加入瓊脂糖和電泳緩沖液 常見的電泳緩沖液。

3、緩沖液 使用濃度 儲存液TAE ( pH 7.5 8.0） 1 x : 40 mM Tris-乙酸 50 x : 242 g Tris 1 mM EDTA 57.1 g 冰乙酸 100 ml 0.5 M EDTA (pH 8.0)TPE (pH 7.5 8.0) 1 x : 90 mM Tris-磷酸 10 x : 108 g Tris 堿 2 mM EDTA 15.5 ml 85% 磷酸 40 ml 0.5 M EDTA (pH 8.0)TBE (pH 8.3) 0.5 x : 45 mM Tris-硼酸 5 x : 54 g Tris 堿 1 mM EDTA 27.5 g 硼酸 20 ml

4、 0.5 M EDTA (pH 8.0) 2）煮膠： * 注意要使瓊脂糖充分膠化 3）倒膠： * 注意要將固定框封閉好，防止漏膠瓊脂糖凝膠的制備過程3. 凝膠電泳 在電泳槽中加入電泳緩沖液至膠面上3-5mm，將DNA樣品加入到凝膠的梳孔中，先在較高電場下電泳5min，然后在正常電場下電泳。一般瓊脂糖凝膠電泳時加在膠上的電壓不超過5V/cm。 在低電壓時，線狀DAN片段的遷移速率與所加的電壓成正比，但隨著電場強度的增加，高分子量DNA片段的遷移率以不同的幅度增長。隨著電壓的增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍縮小。影響凝膠DNA電泳的因素1）瓊脂糖的濃度2）DNA的構(gòu)象：分子量相同的超螺旋環(huán)狀（I型）

5、、 帶切口環(huán)狀（II型）和線狀（III型）DNA在凝膠 中的運動速度不一樣。它與凝膠的瓊脂糖濃度、 電流強度、緩沖液離子強度和DNA超螺旋度有關(guān)3）電場方向： 電場方向不變時，較長的DNA分子（50-100kb）在瓊脂糖凝膠上的遷移速率相同。但如果周期性的改變電場的方向，DNA的分辨率將發(fā)生改變。4）堿基組成與溫度： DNA在瓊脂糖凝膠中的電泳行為與堿基組成和電泳溫度變化關(guān)系不大，不同大小的DNA片段在4 oC 30 oC相對遷移率不變。5）嵌入染料： 溴化乙錠堆積在DNA堿基之間，能拉長線狀和帶切口DNA，使線狀DNA的遷移率降低15%。6）電泳緩沖液的組成： 離子強度低，遷移率低。離子強度

6、高，遷移率高，但會引起凝膠發(fā)熱。4. DNA的檢測 瓊脂糖經(jīng)溴化乙錠染色后在紫外燈下進行檢測凝膠成像分析系統(tǒng) WD-9413A型DNA分子量的測定常用標準分子量：DNA（48.5 kb）, pBR322(4.36 kb) DNA-EcoR I: 21226, 7421, 5804, 5643,4878, 3530 (bp)DNA-Hind III: 23130, 9416, 6557,4361, 2322, 2027,564, 125 DNA-EcoR I- Hind III: 21226,5148, 4973, 4268, 3530, 2027, 1904, 1584, 1375, 947,

7、 831, 564,125 pBR322 DNA-Hae III: 587, 540, 504, 458, 434, 267,234,213,192,184,124,123,104,89,80,64,57, 51,21,18,11,8DNA分子量的測定 方法一： 根據(jù)已知不同大小DNA片段的相對遷移率(從原點到峰尖的距離)求出待測DNA片段的大小。方法二：估算法 根據(jù)標準分子量的大小估算待測分子量的大小。5. DNA片段的回收1）DEAE - 纖維素膜電泳回收： 利用適當濃度的瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，然后在緊靠目的DNA的前方切下一裂隙，將一經(jīng)處理的DEAE-纖維素膜插入裂隙中，繼續(xù)電泳

8、，直至所有的DNA均收集到膜上，然后取出膜，依次用低離子強度的緩沖液、高離子強度的緩沖液洗脫。透析袋電洗脫：將切下的含DNA的凝膠帶置于透析袋中，在低電壓（2V/cm）下電泳。該方法主要用于分離大量DNA片段（500g）。電泳500 2000 bp ，2h；2000 4000 bp ，4 h。 電泳完畢后100 V反向30 S。 得率：1 kb時：為80 90 %， 1 kb 時為50 60%。透析袋回收DNA片段過程3）低熔點瓊脂糖凝膠分離DNA片段 將DNA在1%的低熔點瓊脂糖中電泳，切下目的DNA凝膠帶，置于65 熔化，加入足夠的TE緩沖液（pH 8.0）,降低至瓊脂糖的濃度為0.4%。

9、然后以乙醇沉淀，最后將沉淀溶于TE緩沖液中。4）利用試劑盒從凝膠中回收DNA片段 DEAE 纖維素柱法 玻璃珠法 硅膠膜 二、脈沖場凝膠電泳( 10 - 2000 kb)倒轉(zhuǎn)場凝膠電泳： 通過周期性地改變電場的方向而使不同大小的DNA片段分離的方法 a) 可分離的最大片段 ( kb): 0.13(T+40)V1.1(3-A)0.6t0.875 b) 可分離的最小片段 (kb)： 0.75 可分離的最大片段* T(溫度 ), V(電場強度 V/cm), A (瓊脂糖的百分濃度), t (脈沖時間,對于倒轉(zhuǎn)電場指反向時間,單位S)脈沖場凝膠電泳示意 胡冬梅，陳世平。肺炎克雷伯菌的耐藥性及PFGE電

10、泳核型。中華微生物學和免疫學雜志, 2000年第20卷第 4期2. 鉗位均勻電場電泳* 通過周期性地改變電場的角度而分離大分子DNA* 可分離的最大片段:： 0.034 (T+40) V1.1(3-A)0.6t0.875 (kb) * 可分離的最小片段 0.75 最大可分離片段 * 10 kb片段遷移速率(cm/h)： 0.0012(T+25) V1.6cos(/2)/A (改向角度)鉗位瓊脂糖凝膠電泳示意第二節(jié) 聚丙烯酰胺凝膠電泳一、非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 (Native poly- acrylamide gel electrophoresis, PAGE) 目的：分離和純化較小的雙鏈DN

11、A片段1丙烯酰胺的濃度與分離的DNA片段的關(guān)系 丙烯酰胺濃度(% w/v) 有效分離范圍(bp) 二甲苯青FF 溴酚藍* 3.5 1000 2000 460 100 5.0 80 500 260 65 8.0 60 400 160 45 12.0 40 200 70 20 15.0 25 150 60 15 20.0 6 100 45 12 * 遷移率與染料相同的雙鏈DNA片段的粗略大小核酸電泳的指示劑 常見的有兩種： 溴酚藍(bromophenol blue，Bb)呈藍紫色二甲苯青(xylene cyanol，Xc)呈藍色。 溴酚藍的分子量為670，在不同濃度凝膠中，遷移速度基本相同，它的分

12、子篩效應(yīng)小，近似于自由電泳，故被普遍用作指示劑。 在0.6、1、2的瓊脂糖凝膠電泳中，溴酚藍的遷移率分別與1kb、0.6kb和0.15kb的雙鏈線性DNA片段大致相同。 在5的聚內(nèi)烯酰胺凝膠和78mol/L尿素PAG中，分別與65mer和35mer的寡聚核苷酸遷移率相同。 二甲苯青的分子量為554.6，攜帶的電荷量比溴酚藍少，在凝膠中遷移率比溴酚藍慢，在5PAG含78mol/L 尿素PAG的膠中遷移率分別相當于260mer和130mer的寡核苷酸。 根據(jù)分離樣品中DNA分子的大小，可以參照指示劑 Bb 和Xc的遷移情況決定是否停止電泳指示劑。一般加在電泳上樣緩沖液中，為了使樣品能沉入膠孔，還要

13、加入適星的蔗糖、聚蔗糖400或甘油以增加比重。2. 聚丙烯酰胺凝膠的制備原 理： 由過硫酸銨提供并可被TEMED（N, N, N, N-四甲基乙二胺）所穩(wěn)定的自由基引發(fā)的一個鏈式反應(yīng),使丙烯酰胺單體聚合成長鏈。雙功能基團N,N-亞甲基雙丙烯酰胺參與聚合反應(yīng)時，鏈與鏈之間鉸鏈成凝膠，其孔徑由鏈長和交聯(lián)度決定。 * 使用 TBE電泳緩沖液 * 凝膠在垂直裝置中制備聚丙烯酰胺凝膠形成過程示意聚丙烯酰胺凝膠制膠裝置 3電泳：低電壓（1- 8 V/cm）電泳，防止電流 通過時產(chǎn)生的熱量引起小片段DNA變性。 * DNA條帶遷移率與堿基組成和序列特征有關(guān) 4特點: I 分辨率高，DNA的長度僅相差0.2%

14、 (1 bp) ii 所裝載的DNA量遠大于瓊脂糖凝膠(g) iii 回收的DNA的純度很高 二、變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳目 的： 分離純化單鏈DNA分子原 理： 凝膠在可抑制核酸中堿基配對的試劑 (尿素，甲醛）的存在下聚合，變性的DNA在凝膠中的遷移率與堿基的組成及序列無關(guān)，只與DNA的片段大小相關(guān)。應(yīng) 用： 放射性探針的分離，S1核酸酶產(chǎn)物的分析，DNA測序反應(yīng)產(chǎn)物的分析等。 變性的梯度凝膠電泳Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) DGGE已廣泛用于分析自然環(huán)境中細菌、藍細菌、古菌、微微型真核生物、真核生物和病毒群落的生物多樣性。這一

15、技術(shù)能夠提供群落中優(yōu)勢種類信息和同時分析多個樣品。具有可重復(fù)和容易操作等特點，適合于調(diào)查種群的時空變化，并且可通過對切下的帶進行序列分析或與特異性探針雜交分析鑒定群落成員。 變性的梯度凝膠電泳 由 Fisher和 Lerman于1983年創(chuàng)立。以后該技術(shù)和PCR技術(shù)相結(jié)合被廣泛應(yīng)用于各種突變分析。它主要是利用梯度變性膠來分離 DNA片段。電泳開始時，DNA在膠中的遷移速率僅與分子大小有關(guān)，而一旦 DNA泳動到某一點時，即到達該DNA變性濃度位置時，使得 DNA雙鏈開始分開，從而大大降低了遷移速率。由于不同的DNA片段的堿基組成有差異，使得其變性條件產(chǎn)生差異，從而在凝膠上形成不同的條帶。目前常用

16、的變性劑有尿素 (urea)和甲酰胺 (formamide)。 一：核酸的提??； 二： 16SrRNA、18SrRNA或功能基因如可溶性甲烷加單氧酶羥化酶基因 (mmo X)和氨加單氧酶 -亞單位基因 (amo A)片段的擴增； 三：通過DGGE分析 PCR產(chǎn)物 DGGE分析微生物群落的一般步驟如下： Bacterial 16S rRNA genes were PCR-amplied using a universal primer complementary to position 517-534 (5-ATTACCGCGGCTGCTGG-3) and a bacterial primer complementary to position 341-358 plus a GC clamp (5-CGCCCGCCGCGC GCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3) (Muyzer et al. 1993).Lasse Riemann et al. Deep-Sea Research II, 1999, 46, 1791-1811 The depth range covered by each sample is S1 (1-85 m); S2 (0-60 m); S11(0-80 m);