生物儀器分析期末重點

1、名詞解釋精密度（precision）：是指用同樣的方法所測得的數(shù)據(jù)相互一致性的程度，是表征數(shù)據(jù)隨機誤差大小的一個量，一般用標(biāo)準(zhǔn)偏差來度量，標(biāo)準(zhǔn)偏差越大，儀器精密度越低。檢出限（detection limit）：指在適當(dāng)?shù)闹眯潘缴媳粰z出的組分的最小量。靈敏度（sensitivity）：物質(zhì)單位濃度或單位質(zhì)量的變化所引起的響應(yīng)信號值變化的程度，也就是校正曲線的斜率，斜率越大，則靈敏度越大。沉降系數(shù)：指單位離心力作用下顆粒的沉降速度。沉降速度：在離心作用下顆粒在單位時間內(nèi)運動的距離。生色團：指分子中能吸收紫外或可見光的基團，其含有非鍵軌道和分子軌道的電子體系。主要包括乙烯基、羧基、亞硝基、偶氮基、

2、乙炔基、氰基。助色團：指能使生色團吸收峰向長波方向移動并增強其強度的基團。溶劑效應(yīng)：指由溶劑極性不同造成的化合物吸收光譜的紅移或藍(lán)移現(xiàn)象。藍(lán)移：溶液極性增強，導(dǎo)致激發(fā)態(tài)能量下降，并且導(dǎo)致躍遷所需能量下降，最大吸收波長max發(fā)生紅移。紅移：溶劑極性增強，導(dǎo)致躍遷所需能量增大，最大吸收波長max發(fā)生藍(lán)移。增色效應(yīng)：由于助色團或生色團的引入，以及溶劑的影響，吸收強度增大。減色效應(yīng)：由于基團取代或溶劑的影響，吸收強度減小。溶劑效應(yīng)：指由溶劑極性不同造成的化合物吸收光譜的紅移或藍(lán)移現(xiàn)象。朗伯比爾定律：當(dāng)一束平行單色光垂直照射到樣品溶液時，溶液的吸光度與溶液的濃度及光程成正比關(guān)系。AlgT= kbc A

3、: 吸光度，T : 透射比， K :比例常數(shù)，b : 光程(溶液厚度)，c :溶液濃度半峰寬：一半熒光強度時，所對應(yīng)的發(fā)射波長范圍，被稱為熒光半峰寬。熒光壽命()：當(dāng)激發(fā)光切斷后熒光強度衰減至原強度的1/e所經(jīng)歷的時間，它表示熒光分子S1激發(fā)態(tài)的平均壽命。 在沒有非輻射躍遷發(fā)生的情況下， = 1/kfkf : 熒光發(fā)射的速率常數(shù)，即單位時間內(nèi)發(fā)射的光子數(shù)K：各種分子內(nèi)的非輻射躍遷過程的速率常數(shù)之和熒光量子產(chǎn)率：熒光物質(zhì)吸收后，所發(fā)射的熒光的光子數(shù)與所吸收的激發(fā)光的光子數(shù)的比值。熒光量子產(chǎn)率越大，單位濃度的熒光物質(zhì)的熒光強度越大，熒光性能更加優(yōu)越熒光淬滅：熒光分子與溶劑分子或其它溶質(zhì)分子的相互作

4、用而引起的熒光量子產(chǎn)率降低的作用。19、熒光閾值：在熒光定量PCR擴增的指數(shù)期，畫一條線，在此直線上，所有樣品的熒光強度與其本底熒光強度的差值全部相同。20、CT值：PCR擴增過程中，擴增產(chǎn)物的熒光信號達到設(shè)定的閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)次數(shù)。21、死時間(t M )：不被固定相吸附或溶解的物質(zhì)經(jīng)過色譜柱時，從進樣到出現(xiàn)峰極大值所需的時間稱為死時間。22、分配系數(shù) (K )：它是指在一定溫度和壓力下，組分在固定相和流動相之間分配達平衡時的濃度比。23、分配比 (kappa) ：分配比又稱容量因子，它是指在一定溫度和壓力下，組分在固定相和流動相之間分配達平衡時的質(zhì)量比，即 ：24、分離因子：也稱為選

5、擇因子，是樣品中兩個最難分離組分(A和B)的相對保留值之比。25、親和色譜：是利用生物分子和固定相表面存在的某種特異性的靶向性和親和力，進行選擇性分離的一種方法。26、固定相：通常是在擔(dān)體表面鍵合具有生物識別能力的生物分子(配體)，擔(dān)體如果是凝膠，還可以實現(xiàn)“親和尺寸排阻”雙重作用。27、顯微鏡分辨率(resolution)：指顯微鏡將近鄰的兩個質(zhì)點分辨清楚的能力，通常是用顯微鏡所能分辨清楚最近的相鄰兩點間的距離(即最小分辨距離)來表示。28、焦點深度：簡稱焦深，指在使用顯微鏡時，當(dāng)焦點對準(zhǔn)標(biāo)本某一點時，不僅看清這一點，而且它的上下兩側(cè)也能同時看清楚，看到的物體不僅僅是一個平面，而且還能看到一

6、定的厚度，這個清晰的厚度就是焦深。29、鏡像亮度(image brightness)：指顯微鏡中觀察到的圖像的明暗程度，在一定放大倍數(shù)下，與數(shù)值孔徑的平方成正比。30、視場亮度(field brightness)：指顯微鏡中觀察到的整個視場的明暗程度。31、分離度：又叫分辨率，是相鄰兩組分(A和B)色譜峰保留值之差的兩倍與兩組分色譜峰底寬之和的比值。填空、選擇、判斷知識點1：1）玻璃勻漿器 原理：筒狀套管和槌管之間的擠壓作用 應(yīng)用：動物細(xì)胞和組織 優(yōu)點：溫和、便捷 缺點：效率較低、不適合于植物組織和微生物細(xì)胞的破碎2）超聲波細(xì)胞破碎儀原理：超聲波在液體中的空化效應(yīng)，壓迫、擠碎細(xì)胞 應(yīng)用：細(xì)菌細(xì)

7、胞、動物細(xì)胞、以及組織破碎 優(yōu)點：快速、高效缺點：作用劇烈，容易破壞蛋白質(zhì)相互作用，厚壁細(xì)胞（如酵母和植物細(xì)胞）的破碎效率較低3）玻璃珠細(xì)胞破碎儀原理：在劇烈震蕩中，通過玻璃珠的球磨作用破碎細(xì)胞應(yīng)用：微生物細(xì)胞、動植物細(xì)胞、組織、尤其是某些厚壁細(xì)胞的破碎（如酵母細(xì)胞和植物細(xì)胞）優(yōu)點：快速、高效缺點：樣品處理量低，儀器噪音大，容易發(fā)熱，對樣品產(chǎn)生影響4）高壓細(xì)胞破碎儀原理：高壓產(chǎn)生的擠壓作用破碎細(xì)胞或組織應(yīng)用：幾乎所有微生物細(xì)胞、動植物細(xì)胞優(yōu)點：快速、高效、處理量大、可低溫控制缺點：價格相對昂貴5）高速組織搗碎機原理：通過葉片刀高速攪拌應(yīng)用：較為堅硬的組織或樣品，如骨骼、植物果實，一般用于細(xì)胞破

8、碎前的組織樣本預(yù)處理優(yōu)點：處理質(zhì)地堅硬的樣品缺點：容易過熱影響樣品，并且不適合處理細(xì)胞樣品6）高溫消解儀原理：通過高溫、強酸（硝酸）、強氧化劑（高錳酸鉀）徹底破壞細(xì)胞或組織的結(jié)構(gòu)應(yīng)用：針對所有樣本，為元素分析制備樣品，如重金屬含量的檢測1、為了研究植物細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用，破碎較為堅硬的植物葉片，應(yīng)該首選（B）制備得到細(xì)胞漿液后，再用（E）破碎細(xì)胞A 玻璃勻漿器； B 高速組織搗碎機；C 超聲波細(xì)胞破碎儀； D 高溫消解儀；E 高壓細(xì)胞破碎儀2、為了測定大米中重金屬鎘含量是否超標(biāo)，應(yīng)選用（D）制備樣品A 玻璃勻漿器； B 高速組織搗碎機；C 超聲波細(xì)胞破碎儀； D 高溫消解儀；E 高壓細(xì)胞破碎

9、儀知識點2：顆粒最大、最沉的下沉的快，質(zhì)量相同形狀不同的，球形顆粒比不規(guī)則形狀的顆粒要快，密度大的比密度小的快，水中的顆粒沉降比油中的顆粒沉降快。知識點3：知識點4：溶劑效應(yīng)：指由溶劑極性不同造成的化合物吸收光譜的紅移或藍(lán)移現(xiàn)象，例如：*躍遷：溶液極性增強，導(dǎo)致激發(fā)態(tài)能量下降，激發(fā)態(tài)極性大于基態(tài)極性，下降更多，并且導(dǎo)致躍遷所需能量下降，最大吸收波長max發(fā)生紅移。n*躍遷：溶劑極性增強，基態(tài)n電子容易與極性溶劑形成氫鍵，從而降低基態(tài)能量，導(dǎo)致躍遷所需能量增大，最大吸收波長max發(fā)生藍(lán)移。知識點5：代表性生物分子的紫外-可見吸收光譜大多數(shù)氨基酸在可見光區(qū)(380-750 nm)和近紫外區(qū)(200

10、-380 nm)范圍內(nèi)沒有吸收，只有芳香族氨基酸(Phe、Tyr、Trp)具有近紫外區(qū)（280nm）的吸收，因為它們的R基帶有苯環(huán)共軛 鍵系統(tǒng)。1、苯丙氨酸(Phe)max : 257 nm max : 200 Lmol-1 cm-1 2、酪氨酸(Tyr)max : 275 nm max : 1400 Lmol-1 cm-1 3、色氨酸(Trp)max : 280 nm max : 5600 Lmol-1 cm-1 嘌呤堿和嘧啶堿具有共軛雙鍵，使得堿基、核苷、核苷酸和核酸分子在240-290 nm處具有強烈吸收，最大吸收值在260 nm附近。核酸分子的紫外吸收與其堿基的相互作用具有很大關(guān)系，其

11、中變性(單鏈)核酸分子的max 相對于雙鏈核酸分子的max大，這是由于雙鏈的形成導(dǎo)致堿基對的電子云發(fā)生重疊，產(chǎn)生減色效應(yīng)，減少了對紫外光的吸收。DNA變性(增色效應(yīng))；DNA復(fù)性(減色效應(yīng)最有用的吸收光譜往往是基于n*躍遷和*躍遷而產(chǎn)生的。5、核酸的定量和純度檢測純DNA： OD260 / OD280 = 1.8；OD260 / OD230 = 2.5 純RNA： OD260 / OD280 = 2.0 ；OD260 / OD230 = 2.5 OD260 / OD280 1.8 或 2.0，則樣品污染了蛋白質(zhì)或苯酚類物質(zhì)OD260 / OD230 2.5，則樣品污染了糖類、無機鹽和有機溶劑知

12、識點6：熒光與磷光的比較：產(chǎn)生過程：熒光是從S1 S0的輻射躍遷，磷光是從T1 S0的輻射躍遷2）壽命：熒光壽命較短10-710-9s，磷光壽命較長10-410s 知識點7：生物樣本自熒光的主要來源 苯丙氨酸Phe 酪氨酸Tyr 色氨酸Trp來源：蛋白質(zhì)(由芳香族氨基酸引起)和一些小分子代謝物特點：熒光強度較弱，最大發(fā)射波長一般小于500 nm還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)最大激發(fā)波長：340 nm；最大發(fā)射波長：450 nm知識點8：設(shè)計qPCR 實驗的關(guān)鍵一步是選擇監(jiān)測目標(biāo)序列擴增的化學(xué)方法，可用的熒光化學(xué)方法多種多樣，被分為2 大類：1）DNA 結(jié)合染料（SYBR Gree

13、n I），2）熒光探針（分子信標(biāo)和TaqMan）這一類方法利用熒光共振能量傳遞（FRET），或一些其它熒光淬滅形式來保證僅在擴增產(chǎn)物出現(xiàn)時特異的熒光知識點9：優(yōu)化的qPCR實驗應(yīng)該滿足以下幾方面的要求：標(biāo)準(zhǔn)品、待檢測的未知樣品和陰性對照樣品，在相同條件下和同一次qPCR實驗環(huán)境中進行擴增；每個樣品至少具有3個平行重復(fù)，且檢測到的 CT 值波動范圍在 0.1-0.2之內(nèi)，表明各重復(fù)樣品的數(shù)據(jù)具有良好的一致性；標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)(R2)大于0.98，表明各標(biāo)準(zhǔn)品具有一致的擴增效率；標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率應(yīng)在 -3 到 -3.5 之間，能夠反映出標(biāo)準(zhǔn)品的10倍梯度稀釋關(guān)系；擴增效率應(yīng)在 90-105%之間，

14、表明反應(yīng)體系具有良好的擴增性能；如果是SYBR Green I 法，熔鏈曲線分析中，只出現(xiàn)單一峰，表明擴增過程具有良好的特異性，擴增產(chǎn)物僅為單一的目的片段，結(jié)果可靠；7. 通過熔鏈曲線分析，陰性對照中無擴增發(fā)生，既不會產(chǎn)生特異性產(chǎn)物，也不會產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物，表明整個擴增體系和過程中，沒有污染外源DNA片段，并且不會產(chǎn)生非特異性優(yōu)化方法：1、無擴增產(chǎn)物：降低退火溫度， 增加模板用量， 增加鎂離子濃度，減少dNTP用量，增加酶用量，重新設(shè)計引物2、非特異性：提高退火溫度， 減少模板用量， 減少鎂離子濃度，減少酶用量，重新設(shè)計引物3、擴增效率過高或過低：降低模板用量，重新稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，注意加樣操作4、

15、R2值過低：重新稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，注意加樣操作5、污染發(fā)生：更換模板和實驗用具知識點10：1、由于該物質(zhì)不被色譜柱吸附或溶解，因此死時間可以被用來測定流動相的平均線速度2、相對保留值只與柱溫和固定相性質(zhì)有關(guān)，而與柱徑、柱長、填充情況和流動相流速無關(guān)，因此是色譜分析方法中廣泛使用的定性依據(jù)3、速率理論式中 H為板高，u 為流動相線速度，A, B, C分別為渦流擴散項系數(shù)、分子擴散項系數(shù)、傳質(zhì)阻力擴散項系數(shù)4、分離度又叫分辨率，是相鄰兩組分(A和B)色譜峰保留值之差的兩倍與兩組分色譜峰底寬之和的比值，即知識點11：色譜方法的選擇根據(jù)樣品物理、化學(xué)性質(zhì)選擇色譜方法；各種氣體、沸點5000C以下?lián)]發(fā)性、熱穩(wěn)

16、定的樣品，一般采用氣相色譜分析；非揮發(fā)性樣品，包括有機物、無機物、高分子化合物等均可采用液相色譜分析。知識點12：正相色譜法：流動相極性小于固定相極性，即親水的固定相選用疏水的流動相；在正相色譜法中：極性小的組分，保留時間短，先出峰；極性大的組分，保留時間長，后出峰。反相色譜法：流動相極性大于固定相極性，即疏水的固定相選用親水的流動相；在反相色譜法中：極性大的組分，保留時間短，先出峰；極性小的組分，保留時間長，后出峰知識點13：離子交換原理離子交換色譜法是利用不同離子對離子交換劑的親和力差異實現(xiàn)分離；離子交換劑一般采用離子交換樹脂，樹脂上分布有固定的帶電荷基團和游離的平衡離子，分析物質(zhì)電離后產(chǎn)

17、生的離子可與樹脂上游離的平衡離子進行可逆交換；根據(jù)交換的對象，可分為陽離子交換樹脂(帶負(fù)電荷)和陰離子交換樹脂(帶正電荷)，它們各自的交換反應(yīng)過程分別如下：陽離子交換：陰離子交換：如果增加鹽離子的濃度，則可降低樣品離子的競爭吸附能力，從而降低其在固定相上的保留值PH視情況不同而定，增大pH值會使酸的解離增加，使堿的解離減少；降低pH值，其結(jié)果相反；對于單純的酸或堿，只要解離增加，就可以增大保留值；對于兩性電解質(zhì)，情況則要復(fù)雜一些蛋白質(zhì)離子交換色譜蛋白質(zhì)的等電點(isoelectric point IP)蛋白質(zhì)所帶正、負(fù)電荷相等，即總凈電荷為零時，溶液對應(yīng)的 pH 稱該蛋白質(zhì)等電點對于中性pH下

18、，某種帶有正電荷的蛋白質(zhì)，可通過陽離子交換色譜進行純化，知識點14：尺寸排阻色譜原 理：組分中，尺寸(流體力學(xué)體積)較大的分子由于不能進入凝膠顆粒的內(nèi)部，而只能通過凝膠顆粒之間的縫隙，因此保留時間最短，最先流出；尺寸中等的組分，可以進入較大的凝膠顆粒的內(nèi)部，同時經(jīng)過凝膠顆粒之間的縫隙，因此，保留時間較長，相對于大尺寸組分，后流出；尺寸最小的組分，可以進入所有凝膠顆粒的內(nèi)部，并經(jīng)過凝膠顆粒之間的縫隙，所經(jīng)過路徑最長，因此，保留時間最長，最后流出；此外，形狀規(guī)則的分子比形狀不規(guī)則的分子先流出尺寸排阻色譜的特點：1. 由于溶劑分子非常小，在絕大多數(shù)情況下，可被認(rèn)為是試樣中尺寸最小的組分，因此，最后流

19、出這樣試樣中的待分離組分的保留時間均小于死時間，這與其他色譜是完全相反的；2. 組分不是通過兩相之間的作用力差異來進行分離，而是按照組分的大小和形狀進行分離知識點15：親和色譜親和色譜是利用生物分子和固定相表面存在的某種特異性的靶向性和親和力，進行選擇性分離的一種方法固定相：通常是在擔(dān)體表面鍵合具有生物識別能力的生物分子(配體)，擔(dān)體如果是凝膠，還可以實現(xiàn)“親和尺寸排阻”雙重作用流動相：一般選擇離子強度較小、pH接近中性的緩沖液分離原理：組分首先與固定相上鍵合的配體進行作用，能夠與配體進行特異性識別和相互作用的組分將被保留，而不能作用的組分則先被洗脫，然后通過高鹽或者可溶性配體對與配體結(jié)合的組

20、分進行洗脫，因此存在如下關(guān)系：不能與配體發(fā)生特異性親和作用的組分：保留值小，先出峰；能夠與配體發(fā)生特異性親和作用的組分：保留值大，后出峰；常用的親和識別對包括：抗原抗體；生物素(biotin)鏈合親霉素(SA)；組氨酸鎳；酶底物(如，谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶谷胱甘肽)；鈣鈣調(diào)蛋白等知識點16：數(shù)值孔徑又稱為(numerical aperture NA)，是物鏡前透鏡與被檢測物體之間介質(zhì)的折射率()和孔徑角()半數(shù)的正弦之乘積，用公式表示如下：顯微鏡的有效放大倍數(shù)取決于其NA的大小，一般是NA的5001000 倍；可見，提高NA，可以提高有效放大倍數(shù)；焦深與放大率和NA成反比；NA越大，焦深越淺NA大的

21、物鏡，工作距離小，這是因為相應(yīng)的孔徑角較大視場直徑與視場數(shù)成正比，與物鏡倍率成反比前向散射(FSC)也稱小角散射，該值的大小與細(xì)胞的直徑成近似線性關(guān)系，即細(xì)胞尺寸越大，其FSC越大，反之亦然側(cè)向散射(SSC)也稱90散射，它對細(xì)胞膜、胞質(zhì)和核膜的折射更加敏感，其散射強度幾乎與細(xì)胞內(nèi)顆粒結(jié)構(gòu)的質(zhì)量成近似線性關(guān)系，即細(xì)胞內(nèi)部顆粒結(jié)構(gòu)越復(fù)雜、質(zhì)量越大，其SSC越大，反之亦然計算題離心力與轉(zhuǎn)速的換算：離心力： F m2r 習(xí)慣上F常以相對離心力(RCF)的大小來衡量：RCF m2r /mg 2r /g g980cm/s將上式中角速度用轉(zhuǎn)速n (rpm；r/min)來表示： 2n/60 則 RCF (

22、2n/60) 2r /g 1.11910-5n2r ( 單位:g)例如：文獻中報道，對某樣品的離心使用半徑為23.5 cm的轉(zhuǎn)頭，12,000 r/min離心30 min可獲得較好的離心結(jié)果，但是你的實驗室中只有25 cm轉(zhuǎn)頭，請問如何重復(fù)出文獻中的離心效果？RCF 1.11910-5n2rRCF 3, 7866.96 g2、3、塔板理論如果色譜柱長度為 L，理論塔板數(shù)用n表示，則柱長度、理論塔板高度、理論塔板數(shù)的關(guān)系如下：但是，在上述公式中，由于死時間 tM 包括在保留時間 tR 內(nèi)，但是流動相并不參與兩相分配過程，計算出的理論塔板數(shù)比實際偏高，因此提出將死時間 tM 扣除，再來計算有效塔板

23、數(shù)論述題朗伯比爾定律：當(dāng)一束平行單色光垂直照射到樣品溶液時，溶液的吸光度與溶液的濃度及光程成正比關(guān)系。AlgT= bc : 摩爾吸光系數(shù) 表示物質(zhì)的濃度為1mol/L，液層厚度為1cm時溶液的吸光度，單位： (Lmol-1 cm-1) A=lg (I0 / It ) lgT T = It / I0 朗伯比爾定律的局限性：比爾定律本身的局限性 比爾定律只適用于稀溶液，這是該定律的最主要限定條件濃度過大，吸收組分的平均距離減小，以致每個粒子都會影響其相鄰粒子的電荷分布，導(dǎo)致發(fā)生改變，吸光度和濃度關(guān)系偏離比爾定律2）化學(xué)偏離 比爾定律成立的條件之二：測試體系中無發(fā)射、散射或光化學(xué)反應(yīng)，即溶液中存在著

24、離解、聚合、互變異構(gòu)等化學(xué)平衡時，會導(dǎo)致溶液濃度發(fā)生變化，影響吸光度與濃度的線性關(guān)系。3）儀器偏離 比爾定律成立的條件之三： 平行單色光，即只有采用真正的單色輻射，才能觀測到吸收體系嚴(yán)格遵守比爾定律 當(dāng)儀器單色光不純引起的偏離，事實上，通過波長選擇器從連續(xù)光源中分離出的波長，只是包括所需波長的波長帶，即從連續(xù)光源中獲得單一波長的純單色光是很難辦到的4）非均相體系偏離 比爾定律成立的條件之四：均相體系(真溶液 非均勻介質(zhì) 膠體，懸浮、乳濁等對光產(chǎn)生散射，使實測吸光度增加，導(dǎo)致線性關(guān)系上彎，偏離比爾定律2、三種類型光譜儀的結(jié)構(gòu)、光路、優(yōu)缺點：（不是重點） 1）單光束分光光度計：從單色器中分離得到的

25、單一光束輪流通過參比溶液和試樣溶液進行吸光度測量優(yōu)點：結(jié)構(gòu)簡單；價格低廉；容易維修缺點：受光源、檢測器波動的影響；不能自動記錄吸收光譜應(yīng)用范圍：常規(guī)分析 2）雙光束分光光度計：從單色器中分離得到的光束經(jīng)過分光鏡分為兩束光，并分別同時通過參比溶液和試樣溶液，最后再通過另一組反射鏡和分光鏡進入檢測器進行檢測優(yōu)點：能自動記錄吸收光譜（自動掃描）；不受光源和檢測器的波動不影響(不斷通過參比校正誤差)；是目前用得最多的分光光度計缺點：無應(yīng)用范圍：最為廣泛 3）雙波長分光光度計：從光源發(fā)出的光被分為兩束，并分別進入兩個單色器，從而同時得到兩束不同波長的單色光，再經(jīng)過切光器使這兩束單色光交替通過同一樣品池，

26、并檢測兩波長處的吸光度差值，當(dāng)兩個波長保持1-2 nm間隔，并同時掃描時，將得到吸光度對波長的變化率曲線，即導(dǎo)數(shù)吸收光譜曲線。優(yōu)點：更高的分辨能力，可以測定較高濃度的樣品溶液，不受光源和檢測器波動的影響，可以扣除背景吸收缺點：價格昂貴應(yīng)用范圍：多組分混合物或透明性較差的生物樣品分析。3、熒光光譜的基本過程基本過程及機理：分子熒光、磷光產(chǎn)生以電子能級間的躍遷為基礎(chǔ)分子被激發(fā)到S1以上的不同振動能級，處于這種激發(fā)態(tài)的分子不穩(wěn)定，其電子很快發(fā)生振動弛豫，衰變到到同一電子態(tài)的最低振動能級如果分子被激發(fā)到S2以上的不同振動能級，則發(fā)生S2到S1的內(nèi)轉(zhuǎn)化(S2 到S1)和振動弛豫而衰變到S1的最低振動能級

27、，接著，有如下幾種途徑衰變到基態(tài)： 1）S1 S0 的輻射躍遷而發(fā)射熒光 (10-710-9s) 2）S1 S0 的非輻射躍遷，即內(nèi)轉(zhuǎn)換 (不發(fā)光) 3） S1 T1的非輻射躍遷，即系間竄越，接著發(fā)生T1 S0的輻射躍遷而發(fā)射磷光 (10-410s)4）S1 T1的系間竄越，接著發(fā)生TIS1的熱活化，最后通過S1 S0的輻射躍遷而發(fā)射遲滯熒光。發(fā)射光譜的特征：斯托克斯位移：熒光波長總是大于激發(fā)光波長斯托克斯位移的產(chǎn)生說明了在激發(fā)和發(fā)射之間存在一定的能量損失，其產(chǎn)生的原因在于：a分子在發(fā)射熒光之前，很快經(jīng)歷了振動弛豫和(或)內(nèi)轉(zhuǎn)化，而損失部分激發(fā)能，只是發(fā)射相對激發(fā)有第一定的能量損失 (主要原因

28、) b輻射躍遷可能只使激發(fā)態(tài)分子衰變到基態(tài)的不同振動能級，然后通過基態(tài)的振動弛豫進一步損失能量 c溶劑效應(yīng)，比如極性溶劑會使激發(fā)態(tài)能量降低發(fā)射光譜的形狀通常與激發(fā)光波長無關(guān)：發(fā)射光譜通常只含有一個發(fā)射帶發(fā)射光譜與吸收光譜呈鏡像對稱的關(guān)系，熒光發(fā)射是光吸收的逆過程6、熒光量子產(chǎn)率( Yf )：熒光物質(zhì)吸收光后，所發(fā)射的熒光的光子數(shù)與所吸收的激發(fā)光的光子數(shù)的比值熒光量子產(chǎn)率的大小取決于物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)和實際測定的溶液環(huán)境，但通常不隨激發(fā)光波長而改變，因此，可以用來反應(yīng)熒光物質(zhì)的熒光性能熒光量子產(chǎn)率越大，單位濃度的熒光物質(zhì)的熒光強度越大，熒光性能更加優(yōu)越影響熒光的因素有：其特定分子的結(jié)構(gòu)，測試溶液性質(zhì)

29、包括PH值，溫度等結(jié)構(gòu)因素包括：1）隨著電子共軛度的加大和分子平面度的增加，熒光效率也增大隨著鹵素取代基鹵素原子序數(shù)增加而熒光下降，原因是“重原子效應(yīng)”導(dǎo)致系間竄越幾率增大；環(huán)境因素包括：1）熒光波長隨著溶劑極性的增大而紅移，熒光強度增強溶劑粘度減小或溫度升高，增加熒光分子相互碰撞的機會，導(dǎo)致非輻射躍遷的幾率增加，而使熒光效率下降PH值：每一種熒光物質(zhì)都有它最適宜的發(fā)射熒光的存在形式，也就是它最適宜的PH范圍，熒光物質(zhì)本身是弱酸或弱堿時，PH值對熒光強度有較大的影響。熒光淬滅的幾種方式：熒光分子與溶劑分子或其它溶質(zhì)分子的相互作用而引起的熒光量子產(chǎn)率降低的作用常見的熒光猝滅劑：分子氧，能引起幾乎

30、所有熒光物質(zhì)產(chǎn)生不同程度的熒光猝滅；胺類物質(zhì)，大多數(shù)未取代芳烴的有效猝滅劑；鹵素化合物，對奎寧的熒光有顯著的猝滅作用重金屬離子；硝基化合物等淬滅方式動態(tài)淬滅：淬滅劑與熒光物質(zhì)的激發(fā)態(tài)分子之間的相互作用，激發(fā)態(tài)的熒光分子與淬滅劑發(fā)生碰撞后，將激發(fā)能轉(zhuǎn)化為熱能，便使激發(fā)態(tài)分子以非輻射躍遷的方式回到基態(tài)，影響熒光分子的激發(fā)態(tài)壽命，而不改變其吸收光譜，溫度升高，淬滅增強靜態(tài)淬滅：淬滅劑與熒光物質(zhì)的基態(tài)分子之間相互作用，形成不發(fā)光的配合物，不影響熒光分子的激發(fā)態(tài)壽命，涉及吸收光譜發(fā)生改變，溫度升高，淬滅減弱能量轉(zhuǎn)移，也屬于動態(tài)淬滅，淬滅劑與受激發(fā)的熒光分子相互作用后，發(fā)生能量轉(zhuǎn)移，使得淬滅劑得到激發(fā)氧的

31、淬滅：氧存在的情況下，增強了熒光物質(zhì)激發(fā)態(tài)分子的S1T1的系間竄越，隨著溶劑介電常數(shù)的減小而增加自淬滅和自吸收：由于激發(fā)態(tài)分子之間的相互碰撞產(chǎn)生能量損失，所以當(dāng)熒光物質(zhì)濃度較大時，會發(fā)生自淬滅現(xiàn)象；當(dāng)熒光物質(zhì)的吸收光譜和發(fā)射光譜重疊嚴(yán)重時，熒光被溶液中處于基態(tài)的分子吸收，稱為自吸收。動態(tài)猝滅(熱能釋放)；靜態(tài)猝滅(形成不發(fā)光的配合物，涉及吸收光譜改變)能量轉(zhuǎn)移(激發(fā)猝滅劑)；氧的猝滅作用自猝滅和自吸收；氣相色譜的選擇：在GC中，固定相可分為液體固定相(氣-液色譜) 和 固體固定相(氣-固色譜)，其中液體固定相應(yīng)用更為廣泛；氣相色譜的應(yīng)用范圍GC可應(yīng)用于分析氣體試樣，也可分析易揮發(fā)或可轉(zhuǎn)化為易揮

32、發(fā)的液體和固體試樣，不僅可以分析有機物，也可應(yīng)用于無機物的分析；一般來說，只要沸點在500 以下，熱穩(wěn)定性良好的物質(zhì)，原則上都可采用GC進行分離和分析；然而對于難揮發(fā)和熱不穩(wěn)定的物質(zhì)，GC一般不再適用，但是近年來，裂解GC(將大分子量的物質(zhì)在高溫下裂解為易揮發(fā)的小分子，然后通過GC進行分析)、反應(yīng)GC(通過適當(dāng)化學(xué)反應(yīng)將難揮發(fā)物質(zhì)轉(zhuǎn)化為易揮發(fā)物質(zhì)，然后通過GC進行分析)的應(yīng)用，擴展了GC的應(yīng)用范圍氣相色譜分離中，欲使色譜峰寬減小，可采取以下措施：減小色譜柱長度，增加柱溫、減小進樣量，較小填料粒度9、HPLC 與 GC 的比較：(1) GC分析對象只限于分析氣體和沸點較低的化合物，它們僅占有機物

33、總數(shù)的20，對于占有機物總數(shù)近80的那些高沸點、熱穩(wěn)定性差、摩爾質(zhì)量大的物質(zhì)，目前主要采用HPLC進行分離和分析；(2) GC的流動相一般采用惰性氣體，它對組分沒有親和力，即不產(chǎn)生相互作用力，僅起運載作用；而HPLC的流動相可選用不同極性的液體，選擇余地大，它對組分可產(chǎn)生一定親和力，并參與固定相對組分作用的劇烈競爭；因此，流動相對分離起很大作用，相當(dāng)于增加了一個控制和改進分離條件的參數(shù)，這為選擇最佳分離條件提供了極大方便(3) GC一般都在較高溫度下進行的，而HPLC則經(jīng)?？稍谑覝貤l件下工作；總之，高效液相色譜法是吸取了GC與經(jīng)典LC優(yōu)點，并用現(xiàn)代化手段加以改進，因此得到迅猛的發(fā)展，目前高效液

34、相色譜法已被廣泛應(yīng)用于分析對生物學(xué)和醫(yī)藥上有重大意義的生物分子，例如蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、多糖類、植物色素、高聚物、染料及藥物等物質(zhì)的分離和分析根據(jù)樣品物理、化學(xué)性質(zhì)選擇色譜方法；各種氣體、沸點5000C以下?lián)]發(fā)性、熱穩(wěn)定的樣品，一般采用氣相色譜分析；非揮發(fā)性樣品，包括有機物、無機物、高分子化合物等均可采用液相色譜分析補充內(nèi)容緒論 精密度 dr = s/ x dr :相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(精確度)；s : 絕對標(biāo)準(zhǔn)偏差；X : n次測量的平均值 S ：絕對標(biāo)準(zhǔn)偏差n ：測量次數(shù)Xi：代表單次測量結(jié)果 X ：代表n次測量結(jié)果的平均值靈敏度檢出限Sm = Sblank + k sb Sm = Sblank

35、+ 3sb儀器或方法的靈敏度越高，精密度越好，檢出限就越低；一般用S/N來描述儀器的信噪比，多數(shù)情況下，N是恒定的，與S大小無關(guān)，當(dāng)測量信號較小時，測量的相對誤差將增加。 生物樣品預(yù)制備沉降速度：指在離心力作用下，顆粒在單位時間內(nèi)的運動距離差速離心：原理：差速離心是采取逐漸提高離心速度的方法分離不同大小的顆粒。起始的離心速度較低，讓較大的顆粒沉降到管底，小的顆粒仍然懸浮在上清液中。收集沉淀，改用較高的離心速度離心懸浮顆粒，將較小的顆粒沉降，以此類推，達到分離不同大小顆粒的目的。用差速離心分離法分離顆粒不僅取決于顆粒的質(zhì)量和形狀而且也取決于顆粒的密度。離心開始時首先是質(zhì)量最大顆粒的樣品沉降,而且

36、在質(zhì)量和密度相同的條件下,球體顆粒沉降速度要比形狀不對稱的顆?？欤绻|(zhì)量相同而密度不同的顆粒,密度大的沉降得快。原理：用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將具有不同顆粒性質(zhì)的樣品置于介質(zhì)的頂部，通過離心力場的作用使樣品分層、分離；該方法對密度介質(zhì)的要求主要包括：1）能產(chǎn)生密度梯度，且密度高時，粘度適中；2）pH中性或易調(diào)為中性；3）濃度大時滲透壓不大；4）對生物樣品惰性；5）易于從介質(zhì)中重新回收樣品；6）在紫外區(qū)或近紫外區(qū)無吸收，常用的密度介質(zhì)有：密度梯度離心常用的介質(zhì)為氯化銫，蔗糖、多聚蔗糖和硅膠顆粒等。光學(xué)分析導(dǎo)論與光譜法不同，非光譜法不涉及到能量躍遷，而是利用了光與物質(zhì)

37、作用時所產(chǎn)生的反射、折射、干涉、衍射和偏振的變化來達到分析測試的目的；光譜法的定義：光譜法是基于物質(zhì)與輻射能作用時，測量由物質(zhì)內(nèi)部發(fā)生量子化的能級之間的躍遷而產(chǎn)生的發(fā)射、吸收或散射的波長和強度進行分析的方法單色器也稱為分光系統(tǒng)，可將由不同波長的“復(fù)合光”分開為一系列“單一”波長的“單色光”的器件；理想的100%的單色光是不可能達到的，實際上只能獲得的是具有一定“純度”的單色光，即該單色光具有一定的寬度(有效帶寬)；有效帶寬越小，分析的靈敏度越高，選擇性越好，分析物濃度與光學(xué)響應(yīng)信號的線性相關(guān)性也越好狹縫寬度的選擇原則*定性分析：選擇較窄的狹縫寬度可提高分辨率，減少其它譜線的干擾，提高選擇性；定

38、量分析：選擇較寬的狹縫寬度可增加光強度，提高分析的靈敏度；應(yīng)根據(jù)實驗對象和分析要求確定狹縫寬度，并通過條件優(yōu)化確定最佳狹縫寬度，如選擇光譜半峰寬的十分之一可以兼顧靈敏度和光強度 原子吸收光譜測定對象：定物質(zhì)中某種元素的存在和含量同一周期：從左到右，原子半徑逐漸減小，原子核對價電子束縛增加，所需激發(fā)能越來越高同一主族：自上而下，所需激發(fā)能越來越低AAS是應(yīng)用廣泛的微量金屬和非金屬元素的首選測定方法線光譜 (Line spectra) 由處于氣相的單個原子發(fā)生電子能級躍遷所產(chǎn)生的銳線；例 如：鈉原子基態(tài)的光譜項是： 32S1/2 第一激發(fā)態(tài)的光譜項是：32P1/2與32P3/2其中：主量子數(shù)變化：

39、n = 3-3 =0； 總角量子數(shù)變化：L = P - S =1； 總自旋量子數(shù)變化： S = (2s-1) (2s-1) =0； 內(nèi)量子數(shù)變化： J = 1/2 1/2 = 0 or 3/2 1/2 = 1鈉原子第二激發(fā)態(tài)的光譜項為：32D3/2 與 32D5/2當(dāng)電子在3p與3d之間躍遷時，有四種可能的躍遷：32P1/2-32D5/2、32P1/2-32D3/2、32P3/2-32D5/2、32P3/2-32D3/2實際上只觀察到后三種躍遷，因第一種躍遷J=2，是禁戒的光源應(yīng)滿足如下要求：（1）光源的帶寬比吸收峰的寬度窄，才能滿足比爾定律的濃度和吸光度的線性關(guān)系；因此，在原子吸收光譜中不能

40、使用連續(xù)光源的激發(fā)模式；（2）根據(jù)氣態(tài)自由原子對同種原子輻射的特征譜線產(chǎn)生自吸的現(xiàn)象，應(yīng)該使用待測元素的共振線作為輻射源；（3）輻射光強度大，穩(wěn)定性好；（4）光源溫度低于原子化溫度，防止多普勒變寬火焰的類型化學(xué)計量火焰：燃?xì)馀c助燃?xì)獾谋壤c它們之間的化學(xué)反應(yīng)計量關(guān)系相近；特點：溫度高，干擾少，穩(wěn)定，背景低，常用；富燃火焰：燃?xì)馀c助燃?xì)獾谋壤笥诨瘜W(xué)計量關(guān)系特點：還原性火焰，燃燒不完全，適用于測定易形成氧化物的元素，如：鐵、鈷和鎳等；貧燃火焰：燃?xì)馀c助燃?xì)獾谋壤∮诨瘜W(xué)計量關(guān)系特點：火焰溫度低，氧化性氣氛，適用于測定易解離的元素，如：堿性金屬測定1 優(yōu)點 (1) 檢出限低、靈敏度高 20種元素優(yōu)

41、于AAS (2) 譜線簡單、干擾小(3) 線性范圍寬（可達35個數(shù)量級） (4) 易實現(xiàn)多元素同時測定（產(chǎn)生的熒光向各個方向發(fā)射）缺點 存在熒光淬滅效應(yīng)、散射光干擾等問題；三種類型：共振熒光、非共振熒光與敏化熒光共振熒光：氣態(tài)原子吸收共振線被激發(fā)后，激發(fā)態(tài)原子再發(fā)射出與共振線波長相同的熒光；非共振熒光：當(dāng)熒光與激發(fā)光的波長不相同時，產(chǎn)生非共振熒光；分為：直躍線熒光、階躍線熒光、anti-Stokes熒光三種； 原子發(fā)射光譜1原子發(fā)射光譜(AES;)：是依據(jù)每種化學(xué)元素的原子或離子在熱激發(fā)或電激發(fā)下，發(fā)射特征的電磁輻射，而進行元素定性、半定量和定量分析的方法，它是光學(xué)分析法中產(chǎn)生與發(fā)展最早的一種

42、分析方法定性分析由于待測原子的結(jié)構(gòu)不同，因此發(fā)射譜線特征不同定量分析由于待測原子的濃度不同，因此發(fā)射強度不同2在原理上，AES與AAS的區(qū)別：測定發(fā)射；AES與AFS的區(qū)別：激發(fā)方式不同，AES屬于熱致激發(fā)或者電致激發(fā)，而AFS屬于光致激發(fā)；但都是線光譜3AES特點;多元素同時檢測能力；分析速度快；選擇性好，能產(chǎn)生很多光譜線，定性分析很有優(yōu)勢，但是由于譜線干擾增加了定量分析的難度，因此需要高分辨儀器；檢出限較低，一般光源可達ug/mL，如采用電感耦合等離子體（ICP）作為光源，則可降低至 ng/mL；精密度好，一般光源為10%左右，線性范圍約2個數(shù)量級。 ICP精密度達到1%以下，線性范圍可延長至7個數(shù)量級，這種方法可有效地用于同時測量高、中、低含量的元素；試樣消耗少；非金屬元素測定困難4 在AES中，光源具有使試樣蒸發(fā)、解離、原子化、激發(fā)、躍遷產(chǎn)生光輻射的作用；一般光源可達ug/mL，如采用電感耦合等離子體（ICP）作為光源，則可降低至 ng/mL；目前常用的光源有直流電弧、交流電弧、電火花及電感耦合等離子體(ICP)；紫外吸收光譜 * 躍遷和n *是有機化合物電子躍遷和紫外 可見吸收的最重要的兩種形式熒光PCRA PCR原理：以DNA為模板、4種dNTP為底物，在模板3末端有引物存在的條件下，利用耐熱DNA聚合酶進行互補鏈的