多糖的分離和純化(共7頁)

1、一、多糖(du tn)的分離(fnl)和純化(chn hu) 多糖是極性極大的大分子化合物，提取時一般先將原料脫脂、脫色，然后用水、鹽或稀堿水在不同溫度下提取。提取物濃縮后加沉淀劑(乙醇、丙酮等)離心沉淀，沉淀部分可反復(fù)多次離心沉淀，以除去部分水溶性色素等雜質(zhì)。1 除蛋白 用水或稀堿提取的多糖常含有蛋白質(zhì)，常用的除蛋白質(zhì)的方法有Sevag 法、三氟三氯乙烷法、三氯乙酸法等。前兩種多用于微生物多糖，后者多用于植物多糖。 Sevag 法是經(jīng)典的除蛋白質(zhì)方法，復(fù)雜、費時，且樣品損失較大。馮建林等比較了Sevag 法、三氟三氯乙烷法、三氯乙酸法、硫酸銨法及木瓜蛋白酶復(fù)合酶法除蛋白的效果，從蛋白殘留量和

2、多糖的得率兩方面評價認為三氯乙酸法最好，但三氯乙酸仍不能完全除去蛋白，建議三氯乙酸法和Sevag 法結(jié)合使用。2脫色 多糖中常含有一些色素(游離色素或結(jié)合色素)，根據(jù)其不同性質(zhì)采取不同的去除方法。常用的脫色方法有離子交換法、氧化法、金屬絡(luò)合物法、吸附法(纖維素、硅藻土、高嶺土、活性炭等)。D EA E一纖維素是目前最常用的脫色方法，通過離子交換柱不僅達到脫色目的，而且可以進行多糖的分離。H2 O2：是一種氧化脫色劑，濃度不宜過高，宜在低溫下進行，否則引起多糖的降解。對于同時含有游離蛋白質(zhì)和色素的多糖，可通過生成金屬絡(luò)合物的方法同時除去蛋白和色素，即加入費林試劑生成不溶性絡(luò)合物，經(jīng)分離后用陰離子

3、交換樹脂分解絡(luò)合物。吸附脫色法也常用，如通過活性炭、高嶺土、硅藻土柱達到脫色的目的。3多糖的分級 采用一般方法提取的多糖，通常是多糖的混合物，即是多分散性的，其不均一性表現(xiàn)在化學(xué)組成、聚合度、分子形狀等的不同。 分級可以達到純化的目的，可按分子大小和形狀分級(如分級沉淀、超濾、分子篩、層析等)，也可按分子所帶基團的性質(zhì)分級(如按電荷性質(zhì)分級的電泳、離子交換層析等)。(1)分級沉淀 利用分子大小和溶解度不同進行分離，常用的有兩種方法，即有機溶劑沉淀法和季銨鹽或硫酸銨法。Ba(O H )2、Ca(O H )2等也常用(chn yn)于酸性多糖的分級。(2)柱層析法柱層析法較常用(chn yn)，也

4、可分為兩類。一類(y li)是只有分子篩作用的一般凝膠柱層析，如Sephadex、Saphrose、Bio gel等；一類是離子交換層析，這種分級不僅按電荷性質(zhì)不同，同時也有分子篩作用，如帶負電荷的多糖可在陰離子型的 D EA E一纖維 素柱或 D EA ESephadex 柱上達到分級；酸性多糖可在陽離子型的羧甲基(CM Sephades)或黃乙基(SESephadex)等凝膠柱上分離。這種離子交換樹脂常用水、不同濃度和種類的緩沖溶液或酸堿液洗脫得以分級。檢測手段國內(nèi)仍沿用經(jīng)典的酚一硫酸法，國外用LKB 柱層析系統(tǒng)，用比旋度、視差折光及紫外檢測器，各組分的峰位自動記錄，分離效果好且方便。(3

5、)透析、超濾及超速離心 選用不同規(guī)格的超濾膜和透析袋進行超濾和透析以及一定條件下的超速離心操作，可按分子大小將多糖樣品分級，超濾和透析更常用于除去小分子物質(zhì)。(4) 區(qū)帶電泳 區(qū)帶電泳主要按多糖的電荷性質(zhì)不同分級，常用的有聚丙烯酰胺凝膠電泳、乙酸纖維素薄膜電泳。二、純度鑒定1、紫外分光光度法 :將多糖 P W2 加 0.9 % N aCl 溶液溶解, 配成濃度為 1mgmL-1的溶液, 采用 UV-160A 紫外可見光譜儀掃描(200nm-300nm)觀察 260nm、280nm 處是否有吸收峰。紙層析法(PC)取 0.5% 的多糖 PW2 樣品溶液50L , 點樣于新華中速濾紙(3cm 20

6、cm)距端點 1cm 處的中部, 以正丁醇濃氨水水(40505)為展開劑, 飽和 2h 以上,在室溫下展開 6h, 取出吹干, 用 0.5%甲苯胺藍液染色, 立即用 95%乙醇漂洗至背景褪色。凝膠柱層析法用 DEA E-纖維素 52(2.6cm 100cm)柱層析 , 0.1molL-1N aCl 洗脫 , 流速 6mL h-1, 按2mL 一管分部收集 , 苯酚-硫酸法逐管檢測 , 繪制收集體積與糖含量之間的關(guān)系曲線。瓊脂糖(Ag aro se)凝膠電泳法在瓊脂糖板(厚度為0.2cm)上點樣 3 5L 采用濃度為 0.075molL-1, pH8.6 的巴比妥緩沖液, 電泳 1 1.5h,

7、電壓為 64 80V , 甲苯胺藍(濃度為 1%)染色, 醋酸乙醇混合溶液(醋酸乙醇水 =0.155)脫色 。P W2 多糖純品經(jīng)電泳展開 。5、紅外光譜分析取干燥樣品微量 , 壓片 , 全波段掃描 。6、核磁共振(h c n zhn)分析將樣品 10mg , 溶于 D2O(重水(zhn shu)中 , 溶解溫 度 80, 分別(fnbi) 在 400MHz 和 500MHz 上測 定1HNM R和CNM R 。三、結(jié)構(gòu)鑒定 多糖的化學(xué)研究首先是提取、分離、純化以獲得不同的多糖組分，經(jīng)純度鑒定證明為均一多糖后進行各組分的理化性質(zhì)如溶解度、旋光、粘度、分子量等的測定，然后進行平面的和立體的化學(xué)研

8、究以及結(jié)構(gòu)改造和修飾的研究。經(jīng)典通用的多糖結(jié)構(gòu)鑒定方法常按圖1 程序進行。經(jīng)過分級純化的多糖在測定結(jié)構(gòu)前須檢查其純度及測定分子量。目前檢查純度最常用的判斷方法主要有：1)用G C 、H PLC 測定組成多糖的單糖的摩爾比是否恒定。 用不同的柱型測定結(jié)果更為可靠。電泳只出現(xiàn)一條帶。如可用聚丙烯酰胺凝膠電泳、乙酸纖維素薄膜電泳及玻璃纖維紙電泳。對于中性多糖可采用高壓電泳，以硼酸鹽為緩沖液，可增大其遷移速度。 3)凝膠柱層析圖呈現(xiàn)對稱的單峰。若有“拖尾”現(xiàn)象，說明其均一性不夠好。紙層析法呈單一集中斑點。多糖(du tn)的分子量測定過去用超速離心沉降法、光散射(snsh)法、滲透壓法、粘度法等，這些

9、方法操作復(fù)雜且誤差(wch)較大，現(xiàn)已少用?，F(xiàn)在較常用的方法有凝膠過濾法和高效凝膠液相色譜法，這兩種方法須先用已知分子量的標準多糖對照測定樣品的分子量。多糖的生物大分子結(jié)構(gòu)比蛋白質(zhì)更為復(fù)雜，這不僅因為組成多糖的單糖品種繁多(目前已知的單糖有200 多種)，而且即使只由一種單糖組成的多糖因其連接方式的不同以及可能有的支鏈(蛋白質(zhì)支鏈較少)使多糖的結(jié)構(gòu)鑒定非常困難。 多糖的結(jié)構(gòu)鑒定方法較多，主要分為3 大類，即化學(xué)分析法、物理分析法和生物學(xué)方法。31 化學(xué)分析法311 酸水解 闡明結(jié)構(gòu)的第一步就是要鑒別多糖的單糖組分，酸水解是常用的方法，可根據(jù)需要選擇適當(dāng)?shù)臈l件(酸的種類、濃度、溫度及水解時間等)

10、?，F(xiàn)在酸水解方法已實現(xiàn)完全自動化。312 甲基化 甲基化法雖然不能解決多糖中單糖的連接順序，但它對于闡明單糖的連接方式(鍵型)、重復(fù)結(jié)構(gòu)中某種單糖的數(shù)目、末端糖的性質(zhì)以及分支點的位置等非常有用。全甲基化的多糖一般先經(jīng) 90 %甲酸水解，然后用05 m olL 的硫酸或三氟乙酸水解，水解時要注意防止發(fā)生去甲基化和降解反應(yīng)。水解后的甲基化單糖混合物可用層析法分離或制成揮發(fā)性衍生物通過GC 分析。若用G CM S對結(jié)構(gòu)解析更為方便。313過碘酸及其鹽的氧化 多糖因其有鄰二醇、鄰三醇結(jié)構(gòu)而易被過碘酸鹽氧化開環(huán)。通過測定過碘酸鹽的消耗、甲酸的生成和剩余糖的比就可確定多糖維中各種單糖的鍵型及其比例。314

11、 Sm ith 降解 用稀酸在室溫下對多元醇進行部分酸水解，可得到各種赤蘚醇糖苷或丙三醇糖苷，研究這些單糖苷、二糖苷和寡糖苷的結(jié)構(gòu)有助于闡明多糖中單糖的部分連接順序和鍵型。315堿降解 堿降解發(fā)生在與單糖的羥基或羧基連接的酯上，多糖還原端的單糖被逐個剝落，用之可分析多糖的鍵型。316 酶水解 是多糖控制降解的另一種方法，它主要是根據(jù)特定的酶降解特定結(jié)構(gòu)的多糖的特性以闡明多糖的部分結(jié)構(gòu)。317免疫化學(xué)技術(shù)(jsh) 多糖是許多微生物免疫特異性的決定因子，根據(jù)(gnj)多糖抗原與蛋白質(zhì)抗體的多反應(yīng)基的特異性，只有一定結(jié)構(gòu)的多糖才能與一定類型抗體的蛋白質(zhì)作用，如果能制備對抗未知多糖的抗體，那么這種抗

12、體可用來闡明未知多糖的相似結(jié)構(gòu)。32物理(wl)分析法321 IR IR 在多糖結(jié)構(gòu)分析上主要是確定吡喃糖的苷鍵構(gòu)型以及常規(guī)觀察其他官能團。一般主要觀察 730960 cm-1 的范圍，如對于a一吡喃糖，艿C1 一H 在 845 cm-1，而吡喃糖艿C1 一H在890 cm-1。322 M S 、G C M S GC 分析多糖雖受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，但G CM S 是多糖結(jié)構(gòu)分析不可缺少的工具，特別是對水解單糖、甲基化單糖及甲基化寡聚糖的分析，而且能鑒別出糖的異構(gòu)體。 M S 在糖鏈結(jié)構(gòu)分析中，由于其方法快速靈敏、樣品用量極少而得到越來越廣泛的應(yīng)用。不但在鑒定各種甲基衍生物的碎片、從而

13、確定各種單糖殘基的連接位置時必不可少，而且近年來由于快原子轟擊質(zhì)譜(FA M M S)、電噴霧電離質(zhì)譜(ESIM S)和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(M A LD IM S)的出現(xiàn)，質(zhì)譜還可以測定糖鏈的分子量及糖鏈的一級結(jié)構(gòu)。 ESIM S 是目前最軟的一種電離技術(shù)。因其能形成多電荷離子，故能測量分子量近10 萬的大分子。ESIM S 易和 H PLC 、CE 、SFC 等技術(shù)聯(lián)用，大大提高了工作效率及靈敏度和精確度。ESIM S 與CID 聯(lián)用可得到不同的碎片離子，由此可獲知低于pmol(皮摩爾，10-12摩爾)的寡糖及其復(fù)合物的分子量、連接順序及分支等信息。V ernon 等曾用 ES

14、IM S 與CID 相結(jié)合的技術(shù)研究了多糖的分子量、序列、鏈連接及分支 。ESIM S 因其“干凈”、靈敏，還可與串聯(lián)質(zhì)譜(M SM S)聯(lián)用進行寡糖混合物的結(jié)構(gòu)確證。M A LDIM S 也是一種類似ESIM S 的軟電離技術(shù)，與E SIM S 一樣，這種電離技術(shù)產(chǎn)生分子離子穩(wěn)定、不易裂解，極適用于測定生物大分子樣品，且準確度極高。測定的分子量與分子形狀無關(guān)(與層析法和電泳法不同)，所以很適合測定多糖的分子量及大小分布。此外，M A LD I方法不受樣品中的無機鹽緩沖液的影響，其靈敏度也是各類方法中最高的。M ock 用1 mol樣品在5 min 內(nèi)就可獲得寡糖分子量最多差0.5 的準確度

15、。323 N M R 用N M R 技術(shù)研究糖鏈結(jié)構(gòu)的優(yōu)點是不破壞樣品，糖鏈的結(jié)構(gòu)特征通過化學(xué)位移、偶合常數(shù)、積分面積、N O E 及馳豫時間等參數(shù)表達。早期N M R 主要用于解決多糖結(jié)構(gòu)苷鍵的構(gòu)型以及重復(fù)結(jié)構(gòu)中單糖的數(shù)目，近年來N M R 技術(shù)突飛猛進的發(fā)展為生物大分子的結(jié)構(gòu)研究創(chuàng)造了良好的條件。如在確定多糖的單糖組成方面，除了通過 H N M R和”C N M R 化學(xué)位移信息外，還可用 H 一 HCo SY 、 H 一C Co SY 等二維譜；在確定單糖的 類 型 和 構(gòu) 型 方 面，可用 H 一 H DQ FC o SY 、R C T 、T o C SY 、H o H A HA ，H

16、 ET Co R H M Q C 。在確定單糖的連接位置和順序時可用 H N M R 方法，如 H lH 遠程偶合J ：0cH、DIFN o E 、1D N o ER o E 、2DN o E SY R o E SY 、2D T o C SY R o E SY 、3DTo CSY R o ESY 。可用的nC N M R 方法，如對照已知結(jié)構(gòu)的單糖或寡糖的CN M R 數(shù)據(jù)、H ET Co RH M Q C 、H M BC 、G IS 、SIN EPT 、D EP T 、A PT 、L R H 一 C C o N N E C T IV IT Y和nC一 H N o E ，測定T (糖鏈中單糖的

17、活動自由度與T 有關(guān))等。Paw an 等綜述了一維、二維N M R 在分析糖的構(gòu)型、相互連接的位置及順序等方面的應(yīng)用。Jasson 等曾開發(fā)了一套專門用于多糖結(jié)構(gòu)N M R 解析的計算機專家系統(tǒng)cs ，使復(fù)雜、費時的多糖結(jié)構(gòu)研究工作大為簡化。 H N M R 和CN M R 用于多糖結(jié)構(gòu)解析的技術(shù)和分析程序見圖2。組成多糖的單糖類型、環(huán)大小(呋喃環(huán)或吡喃環(huán))及一0H 的位置情況確定多糖或寡糖的結(jié)構(gòu)(jigu)田2 N M R 用于多糖結(jié)構(gòu)鑒定的方法與程序32 4 C E 毛細管電泳(din yn)(CE )是近幾年發(fā)展起來的一種糖類分析方法。它以快速、高效、高分辨和樣品用量少等優(yōu)點，越來越受

18、到糖化學(xué)家們的重視。CE 在多糖結(jié)構(gòu)研究中主要用來測定多糖的分子量(不同質(zhì)量、不同電荷的分子電泳遷移性能(xngnng)不同)、多糖或寡糖的組成分析、純度鑒定、結(jié)構(gòu)歸屬及單糖差向異構(gòu)體的分離。與寡糖的降解方法聯(lián)用，通過確定寡糖降解片段的結(jié)構(gòu)并根據(jù)結(jié)構(gòu)優(yōu)化原理還能實現(xiàn)寡糖的結(jié)構(gòu)分析。由于CE 具有快速、高效、高分辨和樣品用量少等優(yōu)點，使其對于復(fù)雜多糖的結(jié)構(gòu)分析具有不可低估的價值。它既可以對多糖進行直接分析、得到多糖微不均一性信息，又可對多糖的酶解產(chǎn)物進行定量和定性分析n 。另外CEM S 聯(lián)用可以對細胞水平的極微量多糖進行精確分析。需要說明的是，CE 方法分析結(jié)果的重現(xiàn)性較差，在進樣方法和定量分析方面需要在技術(shù)上進一步提高。33 生物學(xué)方法 生物學(xué)方法主要是酶學(xué)方法，即利用各種特異性糖苷酶水解多糖分子得到寡糖片段，再與其他定性、定量方法聯(lián)用推測多糖的結(jié)構(gòu)。目前較為先進的酶學(xué)方法是試劑陣列分析法(R A A M