乙型肝炎病原學(xué)診斷和治療

1、乙型肝炎病原學(xué)診斷和治療一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、熟悉乙肝病毒DNA提取方法2、掌握乙肝病毒DNAPCR檢測方法2二、實(shí)驗(yàn)原理聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)是在體外模擬體內(nèi)DNA復(fù)制，利用兩段特異的寡核酸引物，由DNA聚合酶催化產(chǎn)生目的基因的擴(kuò)增技術(shù)。3PCR技術(shù)基本原理4目的基因擴(kuò)增循環(huán)數(shù). 擴(kuò)增子數(shù) (靶序列拷貝數(shù))122438416532664201,048,576301,073,741,824(10億)1 循環(huán)= 2 擴(kuò)增子2 循環(huán) = 4 擴(kuò)增子3 循環(huán) = 8 擴(kuò)增子4 循環(huán) = 16 擴(kuò)增子5 循環(huán) = 32 擴(kuò)增子6 循環(huán) = 64 擴(kuò)增子7 循環(huán) = 128 擴(kuò)增子5三、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備（一）試劑

2、1、DNA提取液2、PCR反應(yīng)液3、石蠟油、雙蒸水4、電泳緩沖液（TAE）5、2瓊酯糖6、溴化乙錠（EB）7、Taq聚合酶10XPCR緩沖液dNTP引物6三、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備（一）器材和儀器1、離心機(jī)2、水浴鍋3、PCR擴(kuò)增儀4、電泳槽、電泳儀5、紫外燈6、移液器7移液器加樣槍頭8高速離心機(jī)旋渦振蕩器9PCR擴(kuò)增儀10熒光定量PCR擴(kuò)增儀11電泳儀電泳槽12暗室中紫外燈觀察結(jié)果13（一）乙肝病毒DNA提?。崃呀夥ǎ?、分離血清2、50ul血清加入50 ul裂解液混勻。3、沸水浴煮10分鐘。4、15000轉(zhuǎn)離心15分鐘。5、取上清到另一離心管中備用。三、實(shí)驗(yàn)步驟14分離血清15加入裂解液提取DNA16

3、熱 裂 解17高 速 離 心18三、實(shí)驗(yàn)步驟（二）HBVDNA擴(kuò)增1、配制反應(yīng)液（15ul10TAE，1ulTaq酶，13ul雙蒸水，1ul模板）,振蕩混勻.2、擴(kuò)增儀中：9430秒，5530秒，72 1分鐘，共30循環(huán)。3、72 延伸5分鐘。19配制PCR反應(yīng)液20三、實(shí)驗(yàn)步驟（三）擴(kuò)增產(chǎn)物檢測1、配制2瓊酯糖的凝膠2、取擴(kuò)增產(chǎn)物10ul加入凝膠小孔中3、電泳30分鐘4、紫外燈下觀察結(jié)果。21擴(kuò)增產(chǎn)物分析221分區(qū)操作：PCR具有超敏感性，因此在檢測過程中應(yīng)分區(qū)操作，即分為樣品處理區(qū)，PCR擴(kuò)增區(qū)，產(chǎn)物分析區(qū)。2、試驗(yàn)前實(shí)驗(yàn)室應(yīng)使用紫外消毒至少30分鐘，實(shí)驗(yàn)器械應(yīng)用70乙醇擦拭。3操作時(shí)戴一

4、次性手套，加樣頭要求及時(shí)更換，吸液時(shí)避免飛濺。四、注意事項(xiàng)234每天實(shí)驗(yàn)前，在廢物缸內(nèi)套上塑料袋，加入半缸含有效氯1%次氯酸鈉液，實(shí)驗(yàn)時(shí)將吸頭、離心管丟入廢液缸中浸泡。5、EP管在開蓋前應(yīng)離心片刻。6、所有試劑試驗(yàn)前充分融化，避免反復(fù)凍融。7、每次PCR反應(yīng)均應(yīng)設(shè)立陰陽性對照。四、注意事項(xiàng)24試驗(yàn)實(shí)設(shè)置與管理25PCR室的管理與防污染PCR室建立嚴(yán)格規(guī)章制度PCR室嚴(yán)格分區(qū)PCR室各區(qū)器械專區(qū)使用PCR室各區(qū)單向流動(dòng)PCR檢測前后要用1次氯酸鈉液或75乙醇擦拭PCR反應(yīng)液中使用dUTP防污染2627試劑準(zhǔn)備室管理制度 實(shí)驗(yàn)室人員進(jìn)入該室須穿專用白色工作服，實(shí)驗(yàn)中應(yīng)需戴手套。 每天實(shí)驗(yàn)開始前，清

5、潔臺(tái)面并應(yīng)打開紫外燈消毒30分鐘。 取出當(dāng)天試驗(yàn)需配置和使用試劑，其余試劑要立即收好，并放回冰箱內(nèi)。 實(shí)驗(yàn)中使用的離心管、吸頭等應(yīng)經(jīng)過滅活無菌處理（應(yīng)在消毒的有效期內(nèi)）。 PCR其他室的用品不得帶入本室。 每次實(shí)驗(yàn)記錄，應(yīng)使用本室專用的、帶有本室標(biāo)志的記錄本、紙和筆。 實(shí)驗(yàn)開始后，當(dāng)天不得再返回本室。2829樣品制備室管理制度實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)入該室須穿專用蘭色工作服，實(shí)驗(yàn)中應(yīng)需戴手套，手套須常更換。 樣品的接受、登記、保存和提取按試劑盒要求進(jìn)行。 使用本室專用的經(jīng)滅菌處理的加樣器和帶濾芯的吸頭。 實(shí)驗(yàn)記錄使用本室專用記錄本和筆。使用過的離心管、吸頭須置于1次氯酸鈉溶液中浸泡，消毒后方可丟棄。 患者樣

6、品按有生物傳染危險(xiǎn)品對待，應(yīng)高壓滅活后棄之。 PCR擴(kuò)增后區(qū)的物品不得帶入本室。 實(shí)驗(yàn)完畢后要打開紫外燈消毒。30產(chǎn)物分析區(qū)管理制度 實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)入該室須穿專用紅色工作服，實(shí)驗(yàn)中應(yīng)需戴手套，手套須常更換。 使用本室專用的經(jīng)滅菌處理的加樣器和帶濾芯的吸頭。 實(shí)驗(yàn)記錄使用本室專用記錄本和筆。 使用過的離心管、吸頭須置于1次氯酸鈉溶液中浸泡，消毒后方可丟棄。PCR產(chǎn)物分析區(qū)的物品不得帶出本室，嚴(yán)防污染攜帶至前區(qū)。 實(shí)驗(yàn)完畢后要打開紫外燈消毒，最好通夜消毒。31定量PCR概念以外參或內(nèi)參為標(biāo)準(zhǔn)，通過對PCR終產(chǎn)物的分析或PCR過程的監(jiān)測，對PCR起始模板量的定量32常規(guī)PCR與定量PCR的比較33實(shí)時(shí)熒

7、光定量PCR原理指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號的積累實(shí)時(shí)監(jiān)測PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析。Ct（cycle threshold)值定義：每個(gè)反應(yīng)管的熒光信號到達(dá)設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。熒光閾值（threshold)的缺省設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍，即： threshold=10SD cycle0-1534Ct值與起始模板的關(guān)系每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始模板數(shù)越多，Ct值越小，利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，只要獲得未知樣品的Ct值，及可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。35熒光定量的標(biāo)

8、準(zhǔn)曲線 標(biāo)準(zhǔn)曲線未知標(biāo)本Crossing Point (Cycles)log (copy number)nlog (F2/F1)nlog (F2/F1)Target3836除常規(guī)的一對引物以外，PCR反應(yīng)體系中另加有一個(gè)能與PCR產(chǎn)物雜交的熒光雙標(biāo)記探針。該探針的5端標(biāo)記一個(gè)熒光基團(tuán)，3標(biāo)記另一個(gè)熒光基團(tuán)。此時(shí)5端熒光基團(tuán)吸收能量后將能量轉(zhuǎn)移給臨近的3端熒光淬滅基團(tuán)（發(fā)生FRET），因此正常情況下檢測不到該探針5端熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光信號。Taqman探針原理37但當(dāng)溶液中有模板時(shí)，模板變性后低溫退火時(shí)，引物與探針同時(shí)與模板結(jié)合。在引物的介導(dǎo)下，沿模板向前延伸至探針結(jié)合處，發(fā)生鏈的置換；Taqm

9、an探針原理38Taqman探針原理Taq酶的53外切酶活性將探針5端連接的熒光基團(tuán)從探針上切割下來，游離于反應(yīng)體系中，從而脫離3端熒光淬滅基團(tuán)的屏蔽，接受光刺激發(fā)出熒光，切割的熒光基團(tuán)數(shù)與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成比例。因此根據(jù)PCR反應(yīng)液的熒光強(qiáng)度即可計(jì)算出初始模板的數(shù)量。39實(shí)時(shí)熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)Ct值的重現(xiàn)性:同一模板Ct值恒定.Ct值與起始模板的線性關(guān)系決定.內(nèi)標(biāo)對實(shí)時(shí)熒光定量PCR有影響:加入內(nèi)標(biāo)后PCR反應(yīng)變成雙重PCR,存在競爭。無法加入合適的起始拷貝的內(nèi)標(biāo)。40定量PCR在臨床診斷治療上的意義對致病微生物核酸含量進(jìn)行定量檢測彌補(bǔ)免疫檢測的缺陷（如HCV）縮短診斷的窗口期（如HBV,HIV）對治療過程進(jìn)行藥物療效監(jiān)測指導(dǎo)用藥加快疾病的診斷，病情判斷預(yù)后對染色體突變導(dǎo)致的遺傳病進(jìn)行檢測41定量PCR在乙肝檢測中意義1. 判斷疾病的嚴(yán)重程度和傳染性2. PCR結(jié)果與血清免疫學(xué)結(jié)果的綜合評價(jià)3. 觀察抗病毒藥物療效，指導(dǎo)藥物用量4.