放射自顯影基本原理和應(yīng)用

1、放射自顯影基本原理和應(yīng)用定義：放射自顯影是一種利用放射性核素發(fā)射的射線，使乳膠中的鹵化銀感光而形成潛影，經(jīng)顯影和定影，形成圖像。借助感光銀顆粒所在的部位和強度，通過影像分析，能準(zhǔn)確地判斷放射性示蹤劑的分布部位和數(shù)量（半定量），這種技術(shù)稱為放射自顯影術(shù)（autoradiography）。這種技術(shù)得到的圖像稱為放射自顯影像（autoradiogram），以上兩種術(shù)語均可簡稱為放射自顯影（ARG）。第一節(jié) 基本原理一、潛影的形成和消退二、類型三、常用的感光材料四、常用的放射性核素五、照相處理六、放射自顯影的分辨力七、放射自顯影的本底、效率一、潛影的形成和消退（一）潛影形成的原理放射自顯影原理與光學(xué)攝

2、影原理基本相似。乳膠中的每顆溴化銀晶體都是由Ag+和Br-的點陣構(gòu)成。在制作過程中，點陣存在缺陷，這些缺陷即是潛影形成過程中的敏化中心。射線與乳膠相互作用，引起電離作用，使Ag+還原為Ag原子，形成潛影。潛影形成步驟 1、發(fā)射電子：核射線與溴化銀作用，使其電離，射出電子，向敏化中心移動形成陰電層。 AgBr+粒子Ag+Br-+e- 2、 Ag+的還原：Ag+向敏化中心移動，與e-結(jié)合，還原成銀原子。 e-+Ag+ Ag 3、潛影形成：還原的銀原子起催化作用，致周圍的Ag+被還原，形成潛影。 Ag Ag nAg 潛影經(jīng)顯影液和定影液處理即成為自顯影圖像。（二）潛影的消退有潛影形成的結(jié)晶在顯影液的

3、作用下，溴被洗去，銀原子則留下來成一個黑色顆粒。潛影如未及時顯影，則在水、氧等作用下還原的銀原子會減少，使?jié)撚跋?。故曝光?yīng)在干燥、低溫、少氧的環(huán)境下進(jìn)行。二、放射自顯影的類型（一）宏觀自顯影（macroscopic ARG）：又稱大體自顯影，觀察范圍較大，分辨力低，只能供肉眼或放大鏡觀察，或根據(jù)黑度判斷示蹤劑的分布及相對數(shù)量。此種自顯影適用于小動物的整體標(biāo)本，大動物的整個臟器或肢體，以及層析板、免疫沉淀板、骨骼、牙齒的磨片或剖面等的研究。（二）顯微鏡自顯影（light microscopic ARG）：又稱光學(xué)顯微鏡自顯影，是借助顯微鏡進(jìn)行組織或細(xì)胞學(xué)觀察，分辨能力要求較高。根據(jù)銀顆粒來判斷

4、示蹤劑的分布部位和數(shù)量的多少。適用于組織切片、細(xì)胞涂片等標(biāo)本的研究?？梢詫Σ煌?xì)胞進(jìn)行比較，并根據(jù)不同示蹤劑在不同時間的分布，研究細(xì)胞水平的代謝過程。制備一般采用液體乳膠法。（三）電子顯微鏡自顯影（electron microscopic ARG)：用于示蹤劑在亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中分布情況的研究，能顯示出普通顯微鏡觀察不到的細(xì)微結(jié)構(gòu)與放射性核素分布的關(guān)系。適用于細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，甚至大分子（DNA 、RNA）上的精確定位和定量，也可觀察動態(tài)過程。此類技術(shù)要求標(biāo)本在100nm以下的超薄切片，乳膠厚度僅相當(dāng)銀顆粒的直徑（約140nm）。三、常用的感光材料放射自顯影常用的感光材料包括各種類型的原子核乳膠、X線膠

5、片、電影正片、氚片或幻燈片。（一）原子核乳膠簡稱核乳膠，由溴化銀和明膠組成。常溫上呈半固體，低溫為明膠狀，溫度升至40左右為液態(tài)。使用時乳膠涂層厚度可由乳膠量和稀釋度（用去離子水稀釋）進(jìn)行調(diào)節(jié)。液體乳膠直接涂在標(biāo)本或支持物上，多用于光鏡和電鏡自顯影。將液體核乳膠涂在玻片上，可抽成核乳膠干板（nuclear emulsion plate），再于標(biāo)本接觸形成自顯影像，多用于光鏡自顯影或宏觀自顯影。也可將干板將乳膠層從玻片上揭下來，稱為揭膜核乳膠（stripping film emuslon），多用于定量的光鏡自顯影。由溴化銀、碘化銀和明膠組成，銀晶體顆粒平均直徑1m，對低能射線敏感度高，對暗室的安

6、全光也有相當(dāng)耐受。乳膠涂在醋酸纖維素酯片基的單面，乳膠面沒有保護層。使用時要注意保護乳膠層面，該面直接與標(biāo)本接觸，以獲得最佳靈敏度。主要用于3H標(biāo)記化合物的宏觀自顯影或低倍光鏡自顯影。（二）氚片（tritum film）（三）X線片（X-ray film）由溴化銀、碘化銀和明膠組成，銀晶體顆粒直徑m，對射線分辨率較低，對暗室內(nèi)的安全光有一定的耐受。乳膠涂在醋酸纖維素酯兩面，外覆保護層。主要用于核素射線能量較高的宏觀自顯影或低倍光鏡自顯影。四、常用的放射性核素選擇放射性核素應(yīng)考慮其射線種類、能量和半衰期。核素 半衰期 射線類型 射線平均能量（MeV）3H 12.33年 0.00514C 5730

7、年 0.0532P 14.28天 0.69535S 87.4天 0.05545Ca 165天 0.1059Fe 44.6天 0.12125I 60.2天 、 0.0037五、照相處理（一）顯影和定影（二）顯影液和定影液（三）干燥、染色和封固（一）顯影和定影感光材料與標(biāo)本接觸后，經(jīng)射線的作用溴化銀晶體形成潛影，未受核射線作用的溴化銀則不形成潛影。這兩種晶體經(jīng)顯影和定影，才能將其區(qū)分。顯影的作用是使銀鹽還原，有潛影的結(jié)晶比無潛影者顯影快，因此適當(dāng)控制顯影時間可只使受照射的結(jié)晶呈現(xiàn)黑色顆粒，定影的作用是洗去未感光的銀鹽。（二）顯影液和定影液顯影和定影是由顯影液和定影液來完成的。常用的顯影液為D-19

8、b，定影液為F-5。顯影液和定影液的溫度應(yīng)嚴(yán)格控制在191，顯影時間2-4min。顯影結(jié)束后用水充分漂洗，然后進(jìn)行定影。定影時間4-8min，經(jīng)水充分沖洗后晾干。顯影和定影的具體時間可通過實踐選定。D-19b顯影液和F-5定影液配方 D-19b顯影液配方 F-5定影液配方 水（5）(ml) 700 水（5）(ml) 800 米吐爾（g） 2 硫代硫酸鈉(g) 240 無水亞硫酸鈉(g) 72 無水亞硫酸鈉(g) 15 對苯二酚（g） 8.8 28%醋酸(ml) 48 無水碳酸鈉(g) 48 硼酸(結(jié)晶 溴化鉀(g) 4 鉀礬(g) 15 加水至(ml) 1000 加水至(ml) 1000（三）

9、干燥、染色和封固經(jīng)顯影、定影和沖洗等處理的乳膠可空氣或人工干燥，但干燥過程應(yīng)避免塵粒沾污乳膠，也可用酒精進(jìn)行脫水干燥。干燥后可按常規(guī)方法染色（如蘇木精-伊紅），染色后可用蓋坡片封固。六、放射自顯影的分辨力放射自顯影的目的在于研究放射性核素或其標(biāo)記化合物在組織內(nèi)的位置，所以放射自顯影的分辯力，主要是指位置的分辯力。故分辨力就是指兩個相鄰的放射性核素分子在標(biāo)本中的距離近以多少能在顯影銀顆粒上顯示為兩個顆粒。銀顆粒顯影放射源可分辨不可分辨半距離（half distance，HD） 衡量分辨力常用半距離來表示。即一線性放射源，其顯影的銀顆粒分散在放射源的兩側(cè)，銀顆粒隨著與放射源的距離的增加而減少，當(dāng)銀

10、顆粒減少到一半時，此距離稱半距離。若放射源為點狀源則以半半徑來表示。HD影響分辨力的主要因素：1、核素的能量：核素的能量越高，射線的射程較長。分散的銀顆粒就較多，因而分辨力下降。如在相同條件下，3H、14C、32P的自顯影分辨力依次下降。射線能量低的自顯影射線能量高的自顯影影響分辨力的主要因素：2、樣品的厚度：樣品厚，組織表面和深層中放射源的射線同時射入乳膠層，使銀顆粒分散程度加重，影像重疊，分辨力下降。樣品薄，則分辨力高，但曝光時間需加長。薄樣品自顯影厚樣品自顯影影響分辨力的主要因素：3、乳膠層的厚度：較薄的乳膠層記錄的是離放射源最近的徑跡起始部，隨乳膠加厚，記錄的包括徑跡起始部和遠(yuǎn)離放射源

11、的部分，偏離放射源的機會越多，分辨力下降。乳膠層厚，形成較大的影像影響分辨力的主要因素：4、樣品與乳膠層的間隙：距離大者，射線散射面積也大，影像越不清晰，分辨力下降。樣品與乳膠層間隙大，形成較大顯影影響分辨力的主要因素：5、乳膠銀晶體大小：顯影銀顆粒不一定于原有的鹵化銀位置完全一致，故銀晶體越小，則顯影銀顆粒越小，分辨力就越好。6、曝光時間：正常曝光時間，核素中占多數(shù)的中、低能量射線作用于乳膠，分辨力高。時間過長，則高能射線作用乳膠幾率增加，散射加大，分辨力下降。7、顯影時間：顯影時間長，可使一些未感光的銀粒被還原，使影像界限不清，分辨力下降。七、放射自顯影的本底、效率1、本底：在自顯影上，除

12、標(biāo)本內(nèi)的放射性核素外，由其他原因造成的顯影顆粒，統(tǒng)稱自顯影的本底。本底過高不僅對低水平放射性的測量，而且降低分辨力。暗室紅燈過量或感光材料在紅燈下曝露時間過長、顯影液溫度過高或時間過長、感光材料過期或保存溫度過高、感光材料的機械彎折或涂液體乳膠干燥過快以及感光材料沾污還原性物質(zhì)等，是引起自顯影本底過高的常見原因。自顯影的效率：系指待測標(biāo)本中的放射性核素在曝光時間內(nèi)，每100次衰變所給出的顯影銀粒數(shù)目。粗略估計，當(dāng)3H標(biāo)本的厚度為1m、密度為時，光鏡自顯影中的效率為10%15%，而厚度為5 m者，效率則為4% 5%（很多深層粒子不能從標(biāo)本中射出）。32P標(biāo)本在同樣條件下的效率為30% 40%，在

13、電鏡自顯影中，3H的效率為25%。第二節(jié) 放射自顯影的基本方法及結(jié)果分析醫(yī)學(xué)生物學(xué)示蹤研究中的自顯影實驗，一般環(huán)節(jié)是：1、示蹤：向?qū)嶒瀯游锘螂x體標(biāo)本引入放射性核素標(biāo)記物。2、標(biāo)本制備：取生物標(biāo)本并制備成含放射性核素的切片、涂片或電泳、層析分離的標(biāo)本。3、自顯影制備：暗室中在標(biāo)本上敷加感光材料。4、曝光：避光條件下核射線作用于感光材料。5、照相處理：顯影、定影、水洗、干燥、染色、封固。最后是閱讀分析。一、示蹤劑引入的方法（一）引入途徑（二）引入方法（一）引入途徑1、體內(nèi)實驗：可由靜脈、皮下、肌肉、腹腔或直接腦內(nèi)注射和灌胃等途徑引入放射性標(biāo)記化合物。2、體外實驗：對組織、細(xì)胞、體液的培養(yǎng)過程，則可

14、在培養(yǎng)瓶中引入。在離體標(biāo)本上研究受體等生物活性物質(zhì)，也常將示蹤劑直接加在切片上進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，然后洗去多余的示蹤劑后再進(jìn)行自顯影。二、放射自顯影的標(biāo)本制備總要求：標(biāo)本制備過程不能引起示蹤劑的流失或移動。（一）組織切片（二）整體小動物或大動物臟器切片（三）牙齒、骨骼（四）體液、培養(yǎng)液中的細(xì)胞或其他成分（五）電鏡標(biāo)本（六）無細(xì)胞的標(biāo)本（一）組織切片1、冰凍切片：標(biāo)本采集后不經(jīng)固定，直接快速冷凍。冰凍的標(biāo)本不能反復(fù)凍融，直接放置-80備用。然后進(jìn)行切片，切片冷凍干燥后，移入室溫后置4進(jìn)行自顯影。適用于擴散性示蹤實驗和需保存生物活性的實驗。2、石蠟切片：標(biāo)本經(jīng)固定液固定（福爾馬林、多聚甲醛）固定、水洗、

15、脫水、二甲苯浸透、石蠟包埋等過程，常溫下切片。標(biāo)本不宜用含重金屬鹽的固定液，防止干擾結(jié)果。固定后必須充分水洗，制備過程中示蹤劑和某些組織成分可能發(fā)生擴散或流失，一般只用于非擴散性實驗。（二）整體小動物或大動物臟器切片實驗動物引入示蹤劑后，用藥物麻醉動物，然后將動物投入干冰丙酮混合液或液氮中快速冷凍，以防組織內(nèi)形成結(jié)晶，待全部凍結(jié)，用羥甲基纖維素包埋動物，包埋塊在整體切片機上制成切片，再進(jìn)行自顯影操作。（三）牙齒、骨骼觀察無機成分時，可在磨石上制成磨片。先用10%福爾馬林固定，經(jīng)磨石加水研磨至表面平整的薄片或剖面，然后乙醇脫水、干燥，再進(jìn)行自顯影。觀察有機成分時，可脫鈣后制成石蠟切片。（四）體液

16、、培養(yǎng)液中的細(xì)胞或其他成分可直接離心濃縮后制成細(xì)胞涂片，培養(yǎng)的細(xì)胞也可制備細(xì)胞爬片，細(xì)胞應(yīng)制成單層。離體實驗中，細(xì)胞周圍常有大量游離示蹤劑，應(yīng)充分洗滌后再制備涂片。固定涂片的固定液應(yīng)根據(jù)研究對象進(jìn)行選擇，如研究核酸時用甲醇：冰醋酸（3：1），蛋白質(zhì)則選用10%福爾馬林做固定液，干燥后進(jìn)行自顯影。（五）電鏡標(biāo)本電鏡標(biāo)本的制備與一般標(biāo)本制備不同，標(biāo)本先用2%戊二醛固定，緩沖液洗滌，再用鋨酸固定，沖洗，系列丙酮或乙醇脫水，環(huán)氧樹脂包埋。然后用超薄切片抽切片，切片厚度為50100m。再涂核乳膠，進(jìn)行自顯影。（六）無細(xì)胞標(biāo)本示蹤研究所用的各種電泳譜、色層條、免疫沉淀板，可按常規(guī)方法進(jìn)行處理、干燥，然后再

17、用接觸法做自顯影。三、自顯影制備（一）接觸法（二）液體核乳膠浸膜法（三）揭膜乳膠法（四）融裱法（五）金屬環(huán)法（一）接觸法在暗室中，將標(biāo)本面與感光膠片或核乳膠干板的乳膠面密切接觸，進(jìn)行曝光而制備自顯影的方法稱為接觸法。標(biāo)本與感光材料均不接觸水或有機溶劑，不會造成示蹤劑的擴散或流失，適用于各種實驗。（二）液體核乳膠浸膜法在暗室中，將標(biāo)本或載有標(biāo)本的玻片浸入適當(dāng)稀釋的液體核乳膠中，使標(biāo)本表面敷上一層薄而均勻的乳膠膜，干燥后曝光而制備處顯影的方法稱液體核乳膠浸膜法。在浸膜過程中，標(biāo)本要與含水的液體核乳膠接觸，會造成擴散性示蹤劑一定程度的擴散和流失，故只適用于非擴散性示蹤實驗。（三）揭膜乳膠法將揭膜乳膠

18、膜從玻璃基片上揭下來，在溫水中展開，浸透，然后將其貼于標(biāo)本表面，干燥后曝光而制備自顯影。揭膜乳膠厚度均勻，該法常用于光鏡自顯影的定量研究。因需在水中進(jìn)行，故適用于非擴散性示蹤實驗。（四）融裱法用預(yù)冷的核乳膠干板沾取剛剛切下的冰凍組織切片，并使其貼牢在乳膠面上，凍干后進(jìn)行曝光制備自顯影。主要用于光鏡自顯影的擴散性示蹤實驗。（五）金屬環(huán)法電鏡自顯影常用的方法。即將核乳膠在暗室中按1：4與蒸餾水稀釋，40融化并緩慢攪拌1h，存放4過夜使其穩(wěn)定。然后再融化并攪拌1h，將其冷卻到25。用不銹鋼制成的金屬環(huán)（1030mm）插入核乳膠中，垂直提出，在金屬環(huán)上便形成一層單層乳膠膜。將其敷在電鏡切片所放置的銅網(wǎng)

19、上，4曝光制備自顯影。四、自顯影的閱讀分析（一）宏觀自顯影的閱讀分析（二）光鏡自顯影的閱讀分析（三）電鏡自顯影的閱讀分析（一）宏觀自顯影的閱讀分析宏觀自顯影的影像可直接用肉眼觀察。比本底黑的部份即表示放射性示蹤劑的存在，黑度越大，表示該處放射性越強，示蹤劑分布越多。觀察時，需將自顯影像與標(biāo)本重合起來觀察，以準(zhǔn)確定位。如將自顯影像用光密度計進(jìn)行測量，則可進(jìn)行定量分析。（二）光鏡自顯影的閱讀分析通過在光鏡下觀察自顯影像上銀顆粒分布的位置和密度而確定放射性示蹤劑存在部位和數(shù)量。自顯影像上單位面積的顯影銀顆粒數(shù)目，與該處示蹤劑的放射性活度呈正比。光鏡自顯影的定量分析二種方法：一是計數(shù)被示蹤劑標(biāo)記的細(xì)胞

20、或細(xì)胞核在細(xì)胞群體中所占的百分率，即標(biāo)記指數(shù)。通常一個細(xì)胞核上有4個以上銀顆粒作為標(biāo)記細(xì)胞。另一種是計數(shù)自顯影像上某部位單位面積（用顯微鏡測微尺測量面積）上銀顆粒數(shù)目，或計數(shù)某種組織細(xì)胞上的銀顆粒數(shù)目。（三）電鏡自顯影的閱讀分析一般在電鏡照片上進(jìn)行，可以通過銀顆粒的位置、數(shù)目來確定放射性示蹤劑在亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的分布，以及數(shù)量。第三節(jié) 自顯影的應(yīng)用放射自顯影具有示蹤、定位、定量和定時等優(yōu)點，能準(zhǔn)確而精細(xì)地將機體的生理功能、生化代謝、增殖等變化與細(xì)胞、組織和器官緊密結(jié)合起來。在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用范圍十分廣泛。一、物質(zhì)在體內(nèi)的分布、代謝用放射性自顯影可動態(tài)觀察生理或病理狀態(tài)下放射性核素標(biāo)記的各種藥物、毒物

21、、營養(yǎng)物質(zhì)等在臟器、組織、細(xì)胞中的分布、轉(zhuǎn)運、蓄積和排泄，以研究其代謝規(guī)律、作用部位及作用機理等。二、生物活性物質(zhì)的合成、代謝研究以適宜的放射性核素標(biāo)記某些生命物質(zhì)的前體，如DNA的特異性前體胸腺嘧啶核苷、RNA的特異性前體尿嘧啶核苷、蛋白質(zhì)的特異性前體氨基酸、類固醇激素的前體膽固醇等，用自顯影追蹤這些標(biāo)記前體在組織、細(xì)胞中的部位、參入數(shù)量、參入時間、影響因素以及合成產(chǎn)物的轉(zhuǎn)運情況等，可能研究各種生物活性物質(zhì)在體內(nèi)或細(xì)胞中合成、代謝的部位、動態(tài)及其機理，還可由此了解細(xì)胞功能，應(yīng)用十分廣泛。三、特異性抗原、受體、DNA片段等的分布用標(biāo)記抗體、標(biāo)記受體的配基或互補RNA（DNA）等，將這些特定的標(biāo)

22、記物引入體內(nèi)或與離體組織細(xì)胞標(biāo)本反應(yīng)，根據(jù)這些特定的標(biāo)記物在體內(nèi)或標(biāo)本分布的情況，以揭示與它們有特異親合力的抗原、受體、DNA片段在組織、細(xì)胞中的分布，以進(jìn)行深入的機理研究。四、其他方面應(yīng)用放射自顯影還在分子生物學(xué)研究中的限制性內(nèi)切酶圖譜分析、DNA和RNA的序列分析、DNA指紋圖譜分析，生物化學(xué)中的各種電泳圖譜、層析圖譜以及免疫學(xué)研究中的各種免疫沉淀反應(yīng)中被用不顯示不同處理或反應(yīng)后標(biāo)記物的位置和數(shù)量。思考題一、定義：放射自顯影、自顯影的分辨力二、1、放射自顯影的原理 2、放射自顯影的基本方法 3、放射自顯影在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用 三、1、自顯影曝光時應(yīng)在干燥、低溫、少氧的環(huán)境中進(jìn)行。 2、衡量自

23、顯影的分辨力常用半距離表示 3、自顯影的類型有宏觀ARG、顯微鏡ARG和電鏡ARG 4、顯影的作用是使銀鹽還原為銀顆粒，常用的顯影液是D-19b，定影的作用是洗去未感光的銀鹽，常用的定影液是F-5 5、影響自顯影分辨力的因素有核素能量、樣品厚度、乳膠層厚度、樣品與乳膠層的間隙、銀晶體的大小、曝光時間和顯影時間。ARG在細(xì)胞周期研究中的應(yīng)用細(xì)胞增殖是一個復(fù)雜的問題，近年來隨著新技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用，在細(xì)胞形態(tài)學(xué)研究的基礎(chǔ)上，對細(xì)胞增殖研究已形成一門新的學(xué)科細(xì)胞動力學(xué)（cell kinetics）。它是研究生物體內(nèi)各種細(xì)胞群體在新生、增殖和消亡過程中處于各種狀態(tài)時的時間參數(shù)、細(xì)胞數(shù)量、分布位置、細(xì)胞遷

24、移等。細(xì)胞動力學(xué)是生物學(xué)中一門研究范圍廣泛、實用性極強的分支學(xué)科。一、細(xì)胞周期細(xì)胞周期（cell cycle）是指從一次分裂結(jié)束到下次分裂終止所經(jīng)歷的歷程，它包括細(xì)胞生長和分裂周期。通常將細(xì)胞周期分為四個時相（phase），即DNA合成期（S期）、有絲分裂期（M期）、復(fù)制前期（G1期）、復(fù)制后期（G2期）。一個細(xì)胞完成有絲分裂后，并非所有細(xì)胞都可進(jìn)入G1期，其中部分細(xì)胞不進(jìn)入下一個細(xì)胞周期而處于“靜止”狀態(tài)，這種細(xì)胞被稱為靜止細(xì)胞或休止細(xì)胞以及G0期細(xì)胞。無增殖能力細(xì)胞或凋亡細(xì)胞死亡G0期G1期2nDNAS期2-4n DNAG2期4nDNAM期很久以來，人們就注意到了細(xì)胞細(xì)胞分裂現(xiàn)象并進(jìn)行了大量研究。20世紀(jì)50年代初，Howard對32P-磷酸鹽培養(yǎng)的RNA酶處理過的蠶豆尖細(xì)胞進(jìn)行了研究，借助放射自顯影技術(shù)，首次證明了被標(biāo)記的細(xì)胞不是分裂細(xì)胞，而是間期細(xì)胞，表明DNA合成是在新時期完成的，并發(fā)現(xiàn)在開始標(biāo)記8h才出現(xiàn)標(biāo)記的