2、色譜導(dǎo)論-PPT課件(87頁PPT)

1、色譜導(dǎo)論色譜概述及分類色譜分離過程和色譜圖柱色譜法的定性定量分析方法第1頁，共87頁。第一節(jié) 概述及分類一、色譜法的由來 1906年由俄國植物學(xué)家Tsweet創(chuàng)立植物色素分離 固定相CaCO3顆粒流動相石油醚 色譜柱：玻璃管 第2頁，共87頁。二 色譜法的發(fā)展歷史第3頁，共87頁。A.J. P. MARTIN 和R.L.M. Synge A.J. P. MARTIN. (1910-2002) of the British National Institute for Medical Research shared with fellow countryman R. L. M Synge the

2、 Nobel Prize in Chemistry (1952) for the invention of partition chromatography.R.L.M. Synge born Oct. 28, 1914, Liverpool, Eng.died Aug. 18, 1994, Norwich, Norfolk. Synge studied at Winchester College, Cambridge, and received his Ph.D. at Trinity College there in 1941. 第4頁，共87頁。1906Tswett用碳酸鈣作吸附劑分離植

3、物色素。最先提出色譜概念。1931Kuhn, Lederer用氧化鋁和碳酸鈣分離a-、b-和g-胡蘿卜素。使色譜法開始為人們所重視。1938Izmailov, Shraiber最先使用薄層色譜法。1938Taylor, Uray用離子交換色譜法分離了鋰和鉀的同位素。1941Martin, Synge提出色譜塔板理論；發(fā)明液-液分配色譜；預(yù)言了氣體可作為流動相（即氣相色譜）。1944Consden等發(fā)明了紙色譜。1949Macllean在氧化鋁中加入淀粉黏合劑制作薄層板使薄層色譜進(jìn)入實用階段。1952Martin, James從理論和實踐方面完善了氣-液分配色譜法。1956Van Deemter

4、等提出色譜速率理論，并應(yīng)用于氣相色譜。1957基于離子交換色譜的氨基酸分析專用儀器問世。1958Golay發(fā)明毛細(xì)管柱氣相色譜。1959Porath, Flodin發(fā)表凝膠過濾色譜的報告。1964Moore發(fā)明凝膠滲透色譜。1965Giddings發(fā)展了色譜理論，為色譜學(xué)的發(fā)展奠定了理論基礎(chǔ)。1975Small發(fā)明了以離子交換劑為固定相、強電解質(zhì)為流動相，采用抑制型電導(dǎo)檢測的新型離子色譜法。1981Jorgenson等創(chuàng)立了毛細(xì)管電泳法。第5頁，共87頁。三 色譜法起過關(guān)鍵作用的諾貝爾獎研究工作年代獲獎學(xué)科獲獎研究工作1937化學(xué)類胡蘿卜素化學(xué)，維生素A和B1938化學(xué)類胡蘿卜素化學(xué)1939化

5、學(xué)聚甲烯和高萜烯化學(xué)1950生理學(xué)、醫(yī)學(xué)性激素化學(xué)及其分離、腎皮素化學(xué)及其分離1951化學(xué)超鈾元素的發(fā)現(xiàn)1955化學(xué)腦下腺激素的研究和第一次合成聚肽激素1958化學(xué)胰島素的結(jié)構(gòu)1961化學(xué)光合作用時發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)的確認(rèn)1970生理學(xué)、醫(yī)學(xué)關(guān)于神經(jīng)元觸處遷移物質(zhì)的研究1970化學(xué)糖核苷酸的發(fā)現(xiàn)及其在生物合成碳水化合物中的作用1972化學(xué)核糖核酸化學(xué)酶結(jié)構(gòu)的研究1972生理學(xué)、醫(yī)學(xué)抗體結(jié)構(gòu)的研究第6頁，共87頁。四 色譜法定義、實質(zhì)和目的定義：利用物質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)建立的分離、分析方法實質(zhì)：分離目的：定性分析或定量分析第7頁，共87頁。五 分類：1按兩相分子的聚集狀態(tài)分：流動相 固定相 類型液相色

6、譜液體 固體 液-固色譜液體 液體 液-液色譜氣體 固體 氣-固色譜氣體 液體 氣-液色譜氣相色譜第8頁，共87頁。2按固定相的外形分柱色譜 填充柱色譜 毛細(xì)管柱色譜 平面色譜 紙色譜 薄層色譜 高分子薄膜色譜3按分離機制分：分配色譜：利用分配系數(shù)的不同吸附色譜：利用物理吸附性能的差異離子交換色譜：利用離子交換原理空間排阻色譜：利用排阻作用力的不同第9頁，共87頁。第10頁，共87頁。六 色譜法的特點優(yōu)點：高選擇性可將性質(zhì)相似的組分分開高效能反復(fù)多次利用組分性質(zhì)的差異產(chǎn)生很好的分離效果 高靈敏度10-1110-13g，適于痕量分析分析速度快幾幾十分鐘完成一次分離，可測多種樣品 應(yīng)用范圍廣氣體，

7、液體、固體物質(zhì)，化學(xué)衍生化再色譜分離分析 缺點：對未知物分析的定性專屬性差 需要與其他分析方法聯(lián)用(GC-MS,LC-MS)第11頁，共87頁。第二節(jié) 色譜分離過程和色譜圖一 色譜過程：被分離組分在兩相中的“分配”平衡過程第12頁，共87頁。 第13頁，共87頁。以分配色譜為例： 進(jìn)入固定相返回流動相再進(jìn)入固定相再返回流動相反復(fù)多次分配被測組分分配系數(shù)不同 差速遷移 分離 微小差異積累較大差異吸附能力弱的組分先流出；吸附能力強的組分后流出第14頁，共87頁。二 色譜流出曲線和色譜峰第15頁，共87頁。1流出曲線和色譜峰 由檢測器輸出的電信號強度對時間作圖，所得曲線稱為色譜流出曲線。曲線上突起部

8、分就是色譜峰2. 基線 色譜柱后僅有純流動相進(jìn)入檢測器時的流出曲線稱為基線，S/N大、穩(wěn)定的基線為水平直線 3. 峰高 色譜峰頂點與基線之間的垂直距離，以h表示 第16頁，共87頁。4. 保留值 保留值是試樣中各組分在色譜柱內(nèi)滯留時間的數(shù)值，反映了組分分子與固定相分子間作用力的大小，是組分的色譜行為。(1)死時間 tM 不被固定相保留的組分（如空氣、甲烷）進(jìn)入色譜柱時，從進(jìn)樣到出現(xiàn)色譜峰極大值所需的時間稱為死時間。死時間也是流動相流經(jīng)色譜柱所需要的時間，流動相平均線速度可表示為：第17頁，共87頁。 (2) 保留時間tR：試樣組分從進(jìn)樣到柱后出現(xiàn)濃度最大值時的時間。 保留時間就是組分通過色譜柱

9、的時間，或者說組分在柱內(nèi)運行的時間。(3) 調(diào)整保留時間：某組份的保留時間扣除死時間后的保留時間，它是組份在固定相中的滯留時間。即 tR=tR-tM 由于保留時間為色譜定性依據(jù)。但同一組份的保留時間與流速有關(guān)，流動相流速大，保留時間相應(yīng)降低，兩者的乘積仍為常數(shù)；而保留體積與流速無關(guān)，因此有時需用保留體積來表示保留值。 第18頁，共87頁。（4）死體積VM：不被保留的組分通過色譜柱所消耗的流動相體積，本意指未被固定相占據(jù)的空隙體積，還包括色譜儀管路，連接頭間空隙和檢測器間隙。死體積可由死時間與流動相體積流速(Fo與溫度和氣壓有關(guān))來計算： VM =tM Fo（5）保留體積VR：指從進(jìn)樣到待測物在

10、柱后出現(xiàn)濃度極大點時所通過的流動相的體積 VR =tR Fo（6）調(diào)整保留體積：某組份的保留體積扣除死體積后的體積 VR= VR-VM=tR Fo第19頁，共87頁。死體積反映了色譜柱和儀器系統(tǒng)的幾何特性，它與待測物的性質(zhì)無關(guān)，故保留體積值中扣除死體積后將更加合理的反映被測組分的保留特性。保留值:試樣的各組分在色譜柱中的滯留時間，通常用時間或用將組分帶出色譜柱所需載氣的體積表示。 被分離組分在色譜柱中的滯留時間主要取決于它在兩相間的分配過程，保留值是由色譜分離過程中的熱力學(xué)因素所控制的，在一定的固定相和操作條件下，任何一種物質(zhì)都有確定的保留值。第20頁，共87頁。只要柱溫，固定相性質(zhì)不變，即使

11、柱徑，柱長，填充情況及流動相流速有所變化，保留體積和調(diào)整保留體積都不變。同一組份的保留時間與流速有關(guān)；保留體積VR和調(diào)整保留體積VR與流速無關(guān)。第21頁，共87頁。5 相對保留值 r2,1（1）組份2的調(diào)整保留值與組份1的調(diào)整保留值之比（2）表示固定相的選擇性，等于1不能分離（3）相對保留值的優(yōu)點是只要柱溫，固定相性質(zhì)不變，即使柱徑，柱長，填充情況級流動相流速有所變化，相對保留值仍保持不變，因此它是色譜定性分析的重要參數(shù) 相對保留值絕對不是兩個組份保留時間或保留體積之比第22頁，共87頁。6 選擇因子 在定性分析中，通常固定一個色譜峰作為標(biāo)準(zhǔn)（s），然后再求其它峰（i）對這個峰的相對保留值，以

12、表示：式中tr(i)為后出峰的調(diào)整保留時間，所以這時總是大于1的第23頁，共87頁。7 區(qū)域?qū)挾?色譜峰的區(qū)域?qū)挾仁墙M份在色譜柱中譜帶擴張的函數(shù)，它反映了色譜操作條件的動力學(xué)因素度量色譜峰區(qū)域?qū)挾韧ǔＳ腥N方法：1. 標(biāo)準(zhǔn)偏差 即0.607倍峰高處色譜峰寬的一半 EF距離的一半2. 半峰寬W1/2 即峰高一半處對應(yīng)的峰寬， GH間的距離W1/2 = 2.354第24頁，共87頁。3. 基線寬度W 即色譜峰兩側(cè)拐點上的切線在基線上的截距，如圖183中IJ的距離它與標(biāo)準(zhǔn)偏差的關(guān)系是： W = 4 第25頁，共87頁。色譜流出曲線得到的重要信息 (l)根據(jù)色譜峰的個數(shù)，可以判斷樣品中所含組份的最少個

13、數(shù) (2)根據(jù)色譜峰的保留值(或位置），可以進(jìn)行定性分析 (3)根據(jù)色譜峰下的面積或峰高，可以進(jìn)行定量分析 (4)色譜峰的保留值及其區(qū)域?qū)挾龋窃u價色譜柱分離效能的依據(jù) (5)色譜峰兩峰間的距離，是評價固定相(和流動相)選擇是否合適的依據(jù)第26頁，共87頁。三 色譜分析理論基礎(chǔ) 兩組分峰間距足夠遠(yuǎn)：由各組分在兩相間的分配系數(shù)決定，即由色譜過程的熱力學(xué)性質(zhì)決定。 每個組分峰寬足夠?。河山M分在色譜柱中的傳質(zhì)和擴散決定，即由色譜過程動力學(xué)性質(zhì)決定。 因此,研究、解釋色譜分離行為應(yīng)從熱力學(xué)和動力學(xué)兩方面進(jìn)行。 第27頁，共87頁。一 描述分配過程的參數(shù) 1 分配系數(shù)（平衡常數(shù)） 在一定的壓力和溫度下，

14、組分在兩相間達(dá)到分配平衡時，組分在固定相中的濃度Cs與在流動相中的濃度Cm之比。 K與組分，固定相，流動相性質(zhì)，溫度和壓力有關(guān)，與兩相體積、柱管特性和所用儀器無關(guān)；分配系數(shù)K越大，越晚流出色譜柱；分配系數(shù)K越小，越早流出色譜柱，組分在柱中移動速度與其分配系數(shù)成反比。 第28頁，共87頁。2 分配比（容量因子，容量比） 在一定溫度和壓力下，組份在兩相間的分配達(dá)平衡時，分配在固定相和流動相中的質(zhì)量比，反映了組分在柱中的遷移速率。 k值決定于組分，兩相熱力學(xué)性質(zhì)，隨柱溫、柱壓變化而變化，還與流動相及固定相的體積有關(guān)，Vm為柱中流動相的體積，色譜柱固定相顆粒間的空隙體積，Vs為柱中固定相的體積。第29

15、頁，共87頁。3 分配系數(shù)K與分配比k的關(guān)系（1）稱為相比率，它也是反映色譜柱柱型特點的參數(shù)。對填充柱，=635；對毛細(xì)管柱，=601500。（2）分配系數(shù)K只決定于組分和兩相性質(zhì)，與兩相體積無關(guān)；分配比k不僅取決于組分和兩相的性質(zhì)，且與相比有關(guān)，即組分的分配比隨固定相的量而改變。（3）二者在表征組分的分離行為時是完全等效的。 第30頁，共87頁。4、 保留值與分配比k的關(guān)系VR = VM +K Vsk = VR， /VM= tR， /tM分配比是調(diào)整保留時間（體積）與死時間（體積）之比，表示組分分子花費在固定相中的時間比在流動相中長多少倍；也說明調(diào)整保留值與分配比成正比。第31頁，共87頁。

16、5、分配系數(shù)K及分配比k與選擇因子的關(guān)系 K或k反映的是某一組分在兩相間的分配情況；而是反映兩組分間的分離情況！當(dāng)兩組分K或k相同時，=1時，兩組分不能分開；當(dāng)兩組分K或k相差越大時，越大，分離得越好。也就是說，兩組分在兩相間的分配系數(shù)不同，是色譜分離的先決條件。 第32頁，共87頁。二 塔板理論 最早由Martin等人提出塔板理論，把色譜柱比作一個精餾塔，用精餾塔中塔板的概念來描述組分在兩相間的分配行為，同時引入理論塔板數(shù)(n)作為衡量柱效率的指標(biāo)，即色譜柱是由一系列連續(xù)的、相等水平的塔板組成。每一塊塔板的高度用H表示，稱為塔板高度。第33頁，共87頁。塔板理論假設(shè)：1.在柱內(nèi)一小段長度H內(nèi)

17、，組分可以在兩相間迅速達(dá)到平衡，這一小段柱長稱為理論塔板高度H。2.以氣相色譜為例，載氣進(jìn)入色譜柱不是連續(xù)進(jìn)行的，而是脈動式，每次進(jìn)氣為一個塔板體積（Vm）。3. 所有組分開始時存在于第0號塔板上，而且試樣沿軸（縱）向擴散可忽略。4. 分配系數(shù)在所有塔板上是常數(shù)，與組分在某一塔板上的量無關(guān)。 第34頁，共87頁?？梢岳斫鉃椋好恳粔K塔板上，溶質(zhì)在兩相間快速形成分配平衡，而隨著流動相按一個一個塔板的方式向前移動。對于一根長為L的色譜柱，溶質(zhì)平衡的次數(shù)應(yīng)為： n = L/H。n稱為理論塔板數(shù),與精餾塔一樣，色譜柱的柱效隨理論塔板數(shù)n的增加而增加，隨板高H的增大而減小。第35頁，共87頁。為簡化起見，

18、假設(shè)色譜柱由5塊塔板（n5）組成，以r表示塔板編號，0,1，2；某組分的分配比k=1。 在色譜分離過程中，該組分的分布可計算如下： 開始時，若有單位質(zhì)量，即m=1（例1mg或1g）的該組分加到第0號塔板上，分配平衡后，由于k=1，故p=q=0.5。以此類推。 每當(dāng)一個新的板體積載氣以脈動式進(jìn)入色譜柱時，上述過程就重復(fù)一次(見下表)。第36頁，共87頁。第37頁，共87頁。塔板理論得出： 第一，當(dāng)溶質(zhì)在柱中的平衡次數(shù)，即理論塔板數(shù)n大于50時，可得到基本對稱的峰形曲線。通常填充色譜柱的n約為103106 ，H1mm。而毛細(xì)管柱 n=105-106，H0.5mm 。第二，當(dāng)樣品進(jìn)入色譜柱后，只要各

19、組分在兩相間的分配系數(shù)有微小差異，經(jīng)過多次的分配平衡后，可獲得良好的分離。第三，n與半峰寬及峰底寬的關(guān)系式為： n = 5.54(tr/W1/2)2 = 16 (tr/W)2第38頁，共87頁。若扣除死時間tM，用有效塔板數(shù)n有效表示柱效: n有效= 5.54(tr/W1/2)2=16(tr/W)2 色譜峰W越小，n就越大，而H就越小，柱效能越高，因此，n和H是描述柱效能的指標(biāo)。第39頁，共87頁。 塔板理論用熱力學(xué)觀點形象地描述了溶質(zhì)在色譜柱中的分配平衡和分離過程，導(dǎo)出流出曲線的數(shù)學(xué)模型，并成功地解釋了流出曲線的形狀及濃度極大值的位置，還提出了計算和評價柱效的參數(shù)。譜帶會為什么擴張？影響柱效

20、的因素以及提高柱效的途徑？載氣流速對柱效有沒有影響?塔板理論的特點和不足第40頁，共87頁。三 速率理論 1956 年，荷蘭學(xué)者 Van Deemter 提出了色譜過程動力學(xué)速率理論。 吸收了塔板理論的概念，考慮了組分在兩相間的擴散和傳質(zhì)過程，給出了 van Deemter 方程 ： H = A + B / u + C u u為流動相的線速度；A、渦流擴散項； B、分子擴散項系數(shù)、 C、傳質(zhì)阻力項系數(shù)。第41頁，共87頁。1 渦流擴散項 (A) 在填充柱中，由于受到固定相顆粒的阻礙，組份在遷移過程中隨流動相不斷改變方向，形成紊亂的“渦流”： 從圖中可見，因填充物顆粒大小及填充的不均勻性：同一組

21、分運行路線長短不同流出時間不同（形成一個統(tǒng)計分布） 峰形展寬。 第42頁，共87頁。A=2dp dp 填充物平均直徑；填充不規(guī)則因子 上式表明，A與填充物的平均直徑dp的大小和填充不規(guī)則因子有關(guān)，與流動相的性質(zhì)、線速和組分性質(zhì)無關(guān)。為了減少渦流擴散，提高柱效，使用細(xì)而均勻的顆粒，并且填充均勻是十分必要的。 對于空心毛細(xì)管，不存在渦流擴散，因此A0第43頁，共87頁。2 分子擴散項 (B/u) 縱向分子擴散是由于色譜柱軸向上的濃度梯度引起的。當(dāng)樣品被注入色譜柱時，它呈“塞子”狀分布。隨著流動相的推進(jìn)，“塞子”因濃度梯度而向“塞子”前后自發(fā)地擴散，組分分子從高濃度處向低濃度處擴散，引起譜峰展寬。第

22、44頁，共87頁。 B2Dg ：彎曲因子，填充柱色譜，1.5， R增加不大)。改變的方法有：降低柱溫、改變流動相及固定相的性質(zhì)和組成。 第68頁，共87頁。3 ) 分離度R與分配比k的關(guān)系 k與兩組分的性質(zhì)和柱子都有關(guān)。k增加，分離度R增加，但當(dāng)k10，則R的增加不明顯。通常k在210之間改變k的方法有：適當(dāng)增加柱溫(GC)、改變流動相性質(zhì)和組成(LC)以及固定相含量 第69頁，共87頁。例：兩組分在1m長柱子上的分離度為0.75，問使用 多長柱子可以使它們完全分離？解：第70頁，共87頁。例：已知物質(zhì)A和B在一根30.0cm長的柱上的保留時間分別為16.40和17.63min，不被保留組分通

23、過該柱的時間為1.30min，峰底寬為1.11和1.21min，試計算（1）柱的分離度（2）柱的平均塔板數(shù)（3）塔板高度（4）達(dá)1.5分離所需柱長解：第71頁，共87頁。第72頁，共87頁。第三節(jié) 色譜法的定性定量方法一 定性分析1、利用保留值定性 1）已知對照物定性：定性專屬性差 不同組分如在某一色譜條件下保留值相同，應(yīng)更改色譜柱再檢測，粗步判斷是否為一個純物質(zhì)。 2）相對保留值定性 在樣品和標(biāo)準(zhǔn)中分別加入同一種基準(zhǔn)物s ，將樣品的ri,s 和標(biāo)準(zhǔn)物的ri,s 相比較來確定樣品中是否含有i組分。 第73頁，共87頁。3 利用保留指數(shù)定性保留指數(shù)是把物質(zhì)的保留行為用兩個緊靠它的標(biāo)準(zhǔn)物（一般是兩

24、個正構(gòu)烷烴）來標(biāo)定，設(shè)正構(gòu)烷烴的保留指數(shù)為碳數(shù)100；測定時，將碳數(shù)為Z和Z+1的正構(gòu)烷烴加入到樣品x中進(jìn)行色譜分析，測得這三個物質(zhì)的調(diào)整保留值分別為：tR（i) ，tR （Z) 和tR (z+1)，且待測物x的調(diào)整保留值需要介于兩個烷烴之間。 第74頁，共87頁。保留指數(shù)僅與固定相的性質(zhì)、柱溫有關(guān)，與其它實驗條件無關(guān)；其準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性都很好,只要柱溫與固定相相同，就可應(yīng)用文獻(xiàn)值進(jìn)行鑒定，而不必用純物質(zhì)相對照。第75頁，共87頁。2利用化學(xué)反應(yīng)定性：收集柱后組分，官能團反應(yīng)定性鑒別（非在線）。3利用兩譜聯(lián)用定性：GC-MS，GC-FTIR。第76頁，共87頁。二 定量分析 色譜定量的依據(jù)是當(dāng)操

25、作條件一致時，被測組分的質(zhì)量（或濃度）與檢測器給出的響應(yīng)信號成正比，即： i = fi Ai 式中i為被測組分i的質(zhì)量； Ai為被測組分i的峰面積； fi為被測組分i的校正因子。進(jìn)行色譜定量分析時需要：（1）準(zhǔn)確測量檢測器的響應(yīng)信號 峰面積或峰高；（2）準(zhǔn)確求得比例常數(shù) 校正因子；（3）正確選擇合適的定量計算方法，將測得的峰面積或峰高換算為組分的百分含量。 第77頁，共87頁。（一）峰面積的測量1對于對稱峰 :A=1.605h W1/22非正常峰（不對稱峰）: A=1.605h (W0.15+W0.85)3自動求和（自動積分儀或色譜工作站）： 直接給出A，h，W1/2第78頁，共87頁。（二）

26、定量校正因子 為了使峰面積能真實反映出物質(zhì)的質(zhì)量，就要對峰面積進(jìn)行校正，即在定量計算中引入校正因子 fi = mi / Ai 式中fi值與組分i質(zhì)量絕對值成正比，稱為絕對校正因子。在定量分析時要精確求出fi值是比較困難的：一方面由于精確測量絕對進(jìn)樣量困難；另一方面峰面積與色譜條件有關(guān)，要保持測定fi值時的色譜條件相同，既不可能又不方便。第79頁，共87頁。1 相對校正因子 相對校正因子fi為組分i與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)s的絕對校正因子之比 fi =fi/fs =（mi /Ai）/（ms/As）=（mi/ms）（As/Ai） 相對校正因子fi是當(dāng)組分i的質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)s相等時，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的峰面積是組分i峰面積的倍數(shù)。通過相對校正因子，可以把各個組分的峰面積分別換算成與其質(zhì)量相等的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的峰面積，于是比較標(biāo)準(zhǔn)就統(tǒng)一了，這就是歸一化法求算各組分百分含量的基礎(chǔ)第80頁，共87頁。(2). 相對校正因子的表示方法 常用的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，對于熱導(dǎo)檢測器（TCD）是苯，對氫焰檢測器（FID）是正庚烷相對質(zhì)量校正因子相對摩爾校正因子相對體積校正因子第81頁，共87頁。（三）定量方法1歸一化法2外標(biāo)法 3內(nèi)標(biāo)法 第8