《生物制藥工藝學》課件09

1、第九章 親和純化技術利用生物分子間的特異性結(jié)合作用的原理進行生物物質(zhì)分離純化的技術稱為親和純化技術（Affinity purification）123技術要點（1）找與底物專一可逆結(jié)合的配基；（2）將配基通過共價鍵偶聯(lián)到基質(zhì)；（3）配基與底物吸附；（4）洗脫目標物。 4親和純化技術親和層析(Affinity chromatography) 親和過濾（膜分離）親和分配（雙水相萃?。┯H和反膠團萃?。ǚ茨z團萃?。┯H和沉淀（沉淀）親和電泳（電泳）5第一節(jié) 親和層析(affinity Chromatography)利用生物大分子物質(zhì)具有與某些相應的分子專一性可逆結(jié)合的特性而建立的層析技術。 適用于從成份

2、復雜且雜質(zhì)含量遠大于目標物的混合物中提純目標物。6特點經(jīng)過一次處理可得到高純度活性物質(zhì) ；設備要求不高、操作簡便、特異性強、分離速度快、分離效果好、分離條件溫和；親和吸附劑通用性較差，專用的吸附劑。7親和吸附劑：載體配基在親和層析中起可逆結(jié)合的特異性物質(zhì)稱為配基（Ligand）。與配基結(jié)合的層析介質(zhì)稱為載體（Matrix）。8一、親和層析的原理（1）配基固定化：配基與載體偶聯(lián)，結(jié)合成具有特異親和性的分離介質(zhì)。（2）吸附樣品：親和層析介質(zhì)選擇性吸附生物活性物質(zhì).（3）樣品解吸：選擇適宜的條件使被吸附物活性物質(zhì)解吸。9二、親和層析載體（一）、親和層析對載體的要求：（1）充分功能化，與配基進行共價連

3、接。（2）有較好的理化穩(wěn)定性和生物惰性。（3）具有高度的水不溶性和親水性。（4）具有多孔的立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。（5）應為大小均勻的剛性小球。10（二）、常用載體 纖維素 (cellulose)瓊脂糖凝膠 葡聚糖凝膠 聚丙烯酰胺凝膠 多孔玻璃珠（Bio-Glass） 其它載體殼聚糖 (Chitosan)111、纖維素纖維素結(jié)構(gòu)緊密、均一性差，不利于大分子的滲入。非特異性吸附力較強，空間位阻。主要用于分離與核酸有關的物質(zhì)。 122、瓊脂糖凝膠瓊脂糖濃度有2%、4%、6%，商品為Sepharose 2B、4B和6B（Pharmacia）。保持吸附物質(zhì)活性，能迅速活化并接上各種功能基團，結(jié)構(gòu)疏松孔徑大，流速

4、快。Sepharose CL,穩(wěn)定性明顯增加，能在pH314中應用。 13 3、葡聚糖凝膠：葡聚糖凝膠孔徑太小，偶聯(lián)配基后，孔徑更小，應用受到限制。 4、聚丙烯酰胺凝膠： Bio-gel P 有供化學反應的酰胺基，能制得配基含量較高的親和柱，適用于親和勢比較低的系統(tǒng)。 pH過高或過低的溶液中酰胺基易水解。14 5、多孔玻璃珠：化學與物理穩(wěn)定性較好，機械強度高。缺點：親水性不強，對蛋白質(zhì)尤其是堿性蛋白質(zhì)有非特異性吸附，化學活性基團少。6、其它載體殼聚糖15殼聚糖(甲殼素和殼聚糖)16三 、 親和配基 配基的選擇配基的濃度配基偶聯(lián)的位置配基分子的大小配基的類型17（一）、配基的選擇 親和層析配基的

5、選用主要取決于分離對象。 1、配基與配體有足夠大的親和力 （親和勢），KL 在10-410-8之間。 2、配基與配體的結(jié)合應是專一的 。3、配基應具有化學活性 。18親和勢KL（EL復合物的解離常數(shù) ） 19（二）、配基的濃度 對親和勢比較低的時候（KL10-4mol/L），增加配基濃度有利于吸附。增加親和柱的長度來提高吸附率。配基濃度太高使吸附力太強，洗脫困難。理想的配基濃度為1-10mol/L。20（三）、配基偶聯(lián)的位置配基固定化時，其不參與親和結(jié)合的部位與載體進行偶聯(lián)。AMP-Sepharose親和柱腺嘌呤N6-氨基接到載體上，對脫氫酶和甘油激酶有吸附力。磷酸基接到載體上，對甘油醛-3-

6、磷酸脫氫酶有吸附力。21（四）、配基分子的大小 選用大分子配基。甘氨酸小分子物質(zhì)作為配基，載體和配基間插入一個“手臂”以消除空間障礙。22（五）、配基的類型 較小的有機分子或天然生物活性物質(zhì)。根據(jù)配基應用和性質(zhì):特殊配基和通用配基。特殊配基（special ligand） 23通用配基（general ligand）用于一類物質(zhì)的分離提純。用NADH作脫氫酶類親和層析的通用配基；用ATP作激酶類親和層析的通用配基；用外源性凝集素作糖蛋白類親和層析時的通用配基等。 24四、 載體的活化與偶聯(lián) 糖類載體的活化與偶聯(lián) 聚丙烯酰胺凝膠及其它凝膠衍生物活化與偶聯(lián)用于固定化配基的凝膠衍生物 25（一）、糖

7、類載體活化與偶聯(lián) 溴化氰活化法高碘酸氧化法環(huán)氧化法甲苯磺酰氯法雙功能試劑法26溴化氰活化法 載體如瓊脂糖、葡聚糖等，在堿性條件下用溴化氰處理，可引入活潑的“亞氨基碳酸”中間體。在弱堿的條件下直接與含有游離脂肪族氨基或芳香族氨基的配基偶聯(lián)。27方法28高碘酸氧化法 多糖載體與0.1mol/L的高碘酸鈉氧化反應24小時會產(chǎn)生醛；在溫和條件下，醛與賴氨酸上的-NH2生成西夫堿，接著用硼氫化鈉還原，生成穩(wěn)定的烷基胺。29 環(huán)氧化法堿性條件下，多糖載體與環(huán)氧氯丙烷作用生成環(huán)氧化合物；環(huán)氧化合物又與氨基酸或蛋白質(zhì)上氨基偶聯(lián)。30 甲苯磺酰氯法甲苯磺酰氯法在無水丙酮中進行。優(yōu)點：活化反應迅速； 偶聯(lián)條件溫和

8、； 偶聯(lián)效率高。 31雙功能試劑法雙功能試劑是同一分子中具有兩個反應活性基團的化學試劑，常作為連接兩個分子的“橋梁”。 二乙烯砜、戊二醛、琥珀酸酐優(yōu)點：反應速度快、條件溫和，能與氨基、糖類、酚、醇類等偶聯(lián)。 32（二）、聚丙烯酰胺凝膠及 其它凝膠衍生物活化與偶聯(lián)疊氮化法 重氮化法 (含氨基載體) 碳二亞胺縮合法（含羧基載體）33聚丙烯酰胺凝膠載體的活化法有大量可修飾的酰胺基。酰胺基能被含氮化合物置換制備多種衍生物。 34疊氮化法聚丙烯酰胺的酰肼衍生物，加1mol/L的亞硝酸，反應液攪90s；加入脂肪胺類配基，制得親和吸附劑。 35重氮化法-氨基烷基瓊脂糖衍生物，對硝基苯甲酰氯反應，制得對硝基苯

9、甲酰胺烷基瓊脂糖衍生物。用連二亞硫酸鈉還原，亞硝酸鈉處理，得重氮鹽衍生物。配基與重氮鹽衍生物偶聯(lián)，制得親和層析柱。36碳二亞胺縮合法碳二亞胺為羧基活化劑。反應中的脲衍生物可用有機溶劑洗滌除去。37（三）、用于固定化配基的凝膠衍生物 1、CNBr活化的Sepharose 4BSepharose 4B經(jīng)CNBr活化，可偶聯(lián)蛋白和核酸類配基。2、AH-Sepharose 4B和CH-Sepharose 4B含有6個碳原子的”手臂”的瓊脂糖衍生物 AH-Sepharose 4B用于含有羧基的一類配基。CH-Sepharose 4B能與含有一級氨基的配基偶聯(lián)。38 393、環(huán)氧活化型Sepharose

10、6B由親水“手臂”與Sepharose 6B載體通過醚鏈形成的衍生物。用于小分子配基的固定化。用于偶聯(lián)脂多糖、蛋白等大分子配基。404、活化型親和膠10和15由N-羥琥珀酰亞胺與瓊脂糖衍生物形成的活化酯。Affi-Gel10的“手臂”長為10個碳原子，產(chǎn)生一些負電荷，有利于堿性或中性蛋白偶聯(lián)；Affi-Gel15為15個碳原子的“手臂”，產(chǎn)生一些正電荷，故有利于酸性蛋白的偶聯(lián)。 415、CM-生物膠A、親和膠202和親和膠102CM Bio-Gel A，無“手臂” 的羧基衍生物；Affi-Gel 102具有6個原子“手臂”，未端為氨基。Affi-Gel202具有10個原子的“手臂”，未端具有羧

11、基；42五、 影響吸附親和力的幾個因素 KL配基濃度對親和力的影響空間障礙的影響配基與載體的結(jié)合位點的影響載體孔徑的影響微環(huán)境的影響43（一）、配基濃度對親和力的影響為將親和配體與其它物質(zhì)分開，需要阻留值10。配基濃度與親和對解離常數(shù)相關。對于低親和力系統(tǒng)，配基濃度。 44（二）、空間障礙的影響空間位阻。對于分子大的配體以及小分子配基更明顯。“手臂”，增加與載體相連配基的活動度，減輕載體的立體障礙。常用的“手臂”多為烴鏈。 45（三）、配基與載體的結(jié)合位點的影響多肽或蛋白質(zhì)等大分子配基須控制偶聯(lián)反應條件，使它以最少的功能基團與載體連接。保持蛋白質(zhì)原有的高級結(jié)構(gòu)，使親和吸附劑具有較大的親和力。

12、46（四）、載體孔徑的影響載體孔隙是配體向配基接近的通道。孔徑大小對吸附劑親和能力有影響。（五）、微環(huán)境的影響載體及“手臂”的電性、極性對親和力的影響。避免引入離子鍵的基團。疏水作用的存在，會引起非特異性吸附作用。47六、 配基與間隔臂的連接 （一）、含氮配基的連接（二）、含羧基配基的連接（三）、含巰基配基的連接（四）、含醛基、酮基、羥基配基的連接48七、 親和層析的吸附和洗脫 影響吸附的條件親和層析的洗脫親和吸附劑的再生49（一）、影響吸附的條件 親和吸附劑及配體的性質(zhì)緩沖液的種類、離子強度、pH、溫度和層析流速有關。溫度升高會使吸附作用減弱。流速每小時低于10 ml/cm2。層析柱用前必須

13、充分平衡。上樣體積為柱床體積的5%。50非專一性吸附 親和層析中的非專一性吸附。 離子效應 疏水基團 復合親和力51離子效應 配基與載體-間隔臂的不完全結(jié)合，將無關離子基團引入吸附劑。具有離子基團的親和吸附劑會影響蛋白質(zhì)的洗脫行為。52疏水基團吸附劑疏水性基團與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的疏水區(qū)相互吸引，形成非專一性吸附。疏水基團：（1）長的烴鏈結(jié)構(gòu)的“手臂”：（2）疏水性配基：53復合親和力離子效應作用，又有疏水作用。配體與配基有較強生物特異性。用高濃度的鹽和有機溶劑，以提高選擇性。54（二）、親和層析的洗脫洗脫：洗脫方法主要有三種： 非專一性洗脫 特殊洗脫 專一性洗脫55非專一性洗脫 改變洗脫劑的pH。

14、 離子強度的分步和梯度變化.親和勢很高，促溶離子，其洗脫能力的強弱順序ClICF3COOSCN CCl3COO。用蛋白質(zhì)變性劑（如脲或鹽酸胍）。56特殊洗脫裂解配基與載體的連接鍵。斷裂方法有：硫酯鍵用羥胺處理30分鐘；偶氮鍵用連二亞硫酸鈉硼酸緩沖液處理；二硫鍵用巰基乙醇、半胱氨酸、二硫蘇糖醇等處理。57專一性洗脫S（固定化配基），E（酶），I（游離配基）（1）競爭性效應，即ESI不如EI穩(wěn)定，增加洗脫劑中I，會使E洗脫下來（正洗脫）。（2）當ESI穩(wěn)定性與EI相同時，I的存在并不影響E對S的結(jié)合，非競爭性效應。（3）反競爭性效應，即ESI比EI穩(wěn)定，I使E與S結(jié)合更緊密（負洗脫） 。58反競爭

15、性效應59親和層析中配基的選擇和洗脫條件 60（三）、親和吸附劑的再生用緩沖液充分平衡后即可重復使用。親和力下降，非特異吸附增加，大多由變性蛋白沉積造成，用6mol/L脲洗柱。61八、其他親和層析 金屬離子親和層析有機染料親和層析擬生物親和層析（Biomimetic AFC） 62（一）、金屬螯合親和層析將環(huán)氧活化型Sepharose 6B與金屬螯合劑偶聯(lián)，再用金屬離子溶液處理制成金屬螯合親和層析柱。金屬螯合劑:亞氨二醋酸、氨基水楊酸、8-羥基喹啉、羧甲基氨基酸等 .63蛋白質(zhì)上的氨基酸殘基，如組氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巰基和色氨酸的吲哚基，利于蛋白質(zhì)與固定化金屬離子結(jié)合。金屬離子如鋅和銅。6

16、4吸附：pH在68。洗脫：降低pH值、增加離子強度、或在緩沖液中加5mmol/L EDTA等方法。特點： 蛋白質(zhì)吸附容量大； 價格便宜； 具有普遍適用性。65（二）、有機染料親和層析有機染料具有類似于NAD+的結(jié)構(gòu)。需核苷酸類物質(zhì)為輔酶的酶，對染料具有一定親和力。染料共價偶聯(lián)到瓊脂糖載體上，能制得親和層析柱。染料親和層析已成功的分離純化了多種酶。66親和層析一 、原理二 、親和層析載體三 、親和配基 四 、載體的活化與偶聯(lián)五 、影響吸附親和力的因素六 、配基與間隔臂的連接七 、親和層析的吸附和洗脫八、其他親和層析67第二節(jié) 其他親和純化技術一、親和過濾（膜分離）二、親和分配（雙水相萃?。┤?、親

17、和反膠團萃?。ǚ茨z團萃取）四、親和沉淀（沉淀分級）五、親和電泳（電泳）68一、 親和過濾（Affinity Filtration）將親和層析和膜過濾技術結(jié)合運用，包括親和錯流過濾和親和膜分離。親和錯流過濾（affinity Cross Flow Filtration,ACFF）: 是將親和層析與超濾技術結(jié)合，高分子底物經(jīng)專一可逆的親和反應后，用膜進行錯流過濾，兼有親和層析與膜過濾的優(yōu)點。69親和錯流過濾 （affinity Cross Flow Filtration） 基質(zhì)及大分子親和配基基質(zhì)是聚合物組成的內(nèi)核，親和配基連接在內(nèi)核表面。配基對提取的目標物進行專一可逆的吸附，形成復合體；用膜對混

18、合液進行錯流過濾，復合體因分子巨大可被保留，雜質(zhì)隨液體透過膜，目標物與其它成分分離。 70基質(zhì) 聚丙烯酰胺 菌類的完整細胞 （酵母、芽胞桿菌、鏈球菌等細胞） 瓊脂糖、脂質(zhì)體等 酵母細胞純化伴刀豆球蛋白A71親和膜 （affinity membrane）親和膜利用親和配基修飾的微濾膜為親和吸附介質(zhì)親和純化目標蛋白質(zhì)，是固定床親和層析的變型。 將一張微濾膜比喻為一個固定床，膜厚為床層高度。 72親和膜優(yōu)點 傳質(zhì)阻力小，達到吸附平衡的時間短；配基利用率高，配基用量低；壓降小，流速快；設備體積小。73二、親和萃取 （Affinity extraction）定義：利用偶聯(lián)親和配基的PEG為成相聚合物進行

19、的雙水相萃取，在親和配基的親和結(jié)合作用下促進目標產(chǎn)物在PEG相（上相）的分配，提高目標產(chǎn)物的分配系數(shù)和選擇性。 PEG/Dextran, PEG/無機鹽74mA目標分子的親和分配系數(shù) T和B分別表示上相和下相；mA和m O為有、無配基時目標分子的分配系數(shù)；m L為配基的分配系數(shù)；CL為配基濃度；Kd為配基與目標分子反應的解離常數(shù)。 上相配基濃度CLT越高，m A越大 75親和萃取純化過程 親和分配（進料），雜蛋白反萃?。ㄇ逑矗┠繕水a(chǎn)物反萃?。ㄏ疵摚?。 76三、親和反膠團萃?。ˋffinity-based reversed micellar extraction） 定義：指在反膠團相中除通常的表面活性劑以外，添加另一種親水頭部為親和配基的助表面活性劑（cosurfactant）；通過親和配基與目標分子的親和結(jié)合作用，促進目標產(chǎn)物在反膠團相的分配。77親和反膠團萃取過程78反萃取79四、親和沉淀 （Affinity precipitation）親和沉淀:是生物親和相互作用與沉淀分離相結(jié)合的生物大分子的分離純化技術。 一次作用親和沉淀二次作用親和沉淀80一次作用親和沉淀水溶性化合物分子上偶聯(lián)有兩個或兩個以上的親和配基雙配基（bis-ligand）；多配基（polyligand）。雙配基或多配基與含有兩個以上親和結(jié)合部位的多